乳酸菌检验操作规范培训

1、目录目录一、乳酸菌一、乳酸菌二、仪器设备二、仪器设备三、三、 培养基培养基四、无菌室准备四、无菌室准备五、接种培养五、接种培养六、菌落计数六、菌落计数七、乳酸菌在改进七、乳酸菌在改进MC培养基上菌落特征培养基上菌落特征八、过氧化氢酶试验八、过氧化氢酶试验第二页，共38页。一、一、乳酸菌乳酸菌1 1、乳酸菌的概念、乳酸菌的概念乳酸菌一词并非生物分类学名词，而是指能乳酸菌一词并非生物分类学名词，而是指能够利用发酵性糖类产生大量乳酸的一类微生够利用发酵性糖类产生大量乳酸的一类微生物的统称。物的统称。通常将乳酸细菌之类群称为乳酸菌。通常将乳酸细菌之类群称为乳酸菌。第三页，共38页。2 2、乳酸菌主要分

2、布、乳酸菌主要分布乳杆菌属乳杆菌属LactobacillusLactobacillus 链球菌属链球菌属StreptococcusStreptococcus明串珠菌属明串珠菌属LeuconostocLeuconostoc片球菌属片球菌属PediococcusPediococcus双歧杆菌属双歧杆菌属BifidobacteriumBifidobacterium第四页，共38页。一乳杆菌属一乳杆菌属LactobacillusLactobacillus1乳杆菌属的形态特征乳杆菌属的形态特征 细胞呈杆状，多为长杆状、短杆状及棒杆状，一般成短细胞呈杆状，多为长杆状、短杆状及棒杆状，一般成短链排列。革兰氏

3、染色阳性，通常不运动，无芽孢。链排列。革兰氏染色阳性，通常不运动，无芽孢。第五页，共38页。2乳杆菌属的生物学特点乳杆菌属的生物学特点 化能异养型，营养要求严格，生长繁殖需要多种氨化能异养型，营养要求严格，生长繁殖需要多种氨基酸、维生素、肽、核酸衍生物。基酸、维生素、肽、核酸衍生物。 厌氧、耐氧性厌氧或兼性厌氧厌氧、耐氧性厌氧或兼性厌氧 生长最适生长最适pH为为5.56.2，在，在pH5的环境中可生长，而中性的环境中可生长，而中性或初始碱性条件下生长速率降低。或初始碱性条件下生长速率降低。生长温度范围，生长温度范围，253，最适生长温度，最适生长温度3040。 第六页，共38页。3乳杆菌属的代

4、表种乳杆菌属的代表种 3.1保加利亚乳杆菌保加利亚乳杆菌L.bulgaricus细胞形态长杆状，两端钝圆。细胞形态长杆状，两端钝圆。固体培养基生长的菌落呈棉花状，易与其它乳酸菌区别。固体培养基生长的菌落呈棉花状，易与其它乳酸菌区别。能利用葡萄糖、果糖、乳糖进展同型乳酸发酵产生能利用葡萄糖、果糖、乳糖进展同型乳酸发酵产生D型乳酸有酸涩味，适口性差，不能利用蔗糖。型乳酸有酸涩味，适口性差，不能利用蔗糖。第七页，共38页。该菌是乳酸菌中产酸能力最强的菌种。该菌是乳酸菌中产酸能力最强的菌种。蛋白质分解力较弱，发酵乳中可产生香味物质蛋白质分解力较弱，发酵乳中可产生香味物质乙醛。乙醛。最适生长温度最适生长

5、温度3745，温度高于，温度高于50或低于或低于20不生长。不生长。常作为发酵酸奶的生产菌。常作为发酵酸奶的生产菌。 第八页，共38页。3.2嗜酸乳杆菌嗜酸乳杆菌L.acidophilus 细胞形态比保加利亚乳杆菌小，呈细长杆状，能利细胞形态比保加利亚乳杆菌小，呈细长杆状，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进展同型乳酸发酵产用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进展同型乳酸发酵产生乳酸。生乳酸。最适生长温度最适生长温度37，20以下不生长，耐热性差。蛋以下不生长，耐热性差。蛋白质分解力较弱。白质分解力较弱。 第九页，共38页。最适生长最适生长pH 5.56.0，耐酸性强，能在其它乳酸菌，耐酸性强，能在其它乳酸

6、菌不能生长的酸性环境中生长繁殖。不能生长的酸性环境中生长繁殖。嗜酸乳杆菌是能够在人体肠道定殖的少数有益微生物嗜酸乳杆菌是能够在人体肠道定殖的少数有益微生物菌群之一，其代谢产物有机酸和抗菌物质菌群之一，其代谢产物有机酸和抗菌物质乳杆菌素乳杆菌素可抑制病原菌和腐败菌的生长。可抑制病原菌和腐败菌的生长。 第十页，共38页。二链球菌属二链球菌属Streptococcus1链球菌属的形态特征链球菌属的形态特征 细胞呈球形或卵圆形，成对或成链排列。革兰氏染色细胞呈球形或卵圆形，成对或成链排列。革兰氏染色阳性，无芽孢，一般不运动，不产生色素。阳性，无芽孢，一般不运动，不产生色素。第十一页，共38页。2链球菌

7、属的生物学特点链球菌属的生物学特点 化能异养型，同型乳酸发酵产生右旋乳酸；化能异养型，同型乳酸发酵产生右旋乳酸；兼性厌氧型，接触酶反响阴性，厌氧培养生兼性厌氧型，接触酶反响阴性，厌氧培养生长良好。长良好。 第十二页，共38页。3链球菌属的代表种链球菌属的代表种 嗜热链球菌嗜热链球菌St.thermophilus 细胞形态呈链球状。细胞形态呈链球状。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖进展发酵产生乳酸能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖进展发酵产生乳酸 。第十三页，共38页。蛋白质分解力较弱，在发酵乳中可产生香味物质双乙酰。蛋白质分解力较弱，在发酵乳中可产生香味物质双乙酰。 该菌主要特征是能在高温条件下产酸

8、，最适生长温度该菌主要特征是能在高温条件下产酸，最适生长温度4045，温度低于，温度低于20不产酸。耐热性强，能耐不产酸。耐热性强，能耐6568的高温。的高温。第十四页，共38页。三明串珠菌属三明串珠菌属Leuconostoc 菌落一般小于菌落一般小于1.0mm，光滑、圆形、灰白色，光滑、圆形、灰白色 细胞球形或豆状，成对或成链排列细胞球形或豆状，成对或成链排列 。革兰氏染色阳性，不运动，无芽孢。革兰氏染色阳性，不运动，无芽孢。第十五页，共38页。四双歧杆菌属四双歧杆菌属Bifidobacterium 1双歧杆菌属的形态特征双歧杆菌属的形态特征 细胞呈多样形态：细胞呈多样形态：Y字型、字型、V

9、字型、弯曲状、勺型，典字型、弯曲状、勺型，典型形态为分叉杆菌型形态为分叉杆菌 革兰氏染色阳性，亚甲基兰染色菌体着色不规那么。革兰氏染色阳性，亚甲基兰染色菌体着色不规那么。无芽孢和鞭毛，不运动。无芽孢和鞭毛，不运动。 第十六页，共38页。2双歧杆菌属的生物学特点双歧杆菌属的生物学特点 化能异养型，对营养要求苛刻，生长繁殖需要多种双化能异养型，对营养要求苛刻，生长繁殖需要多种双歧因子歧因子 。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸和乙能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸和乙酸及少量的甲酸和琥珀酸。酸及少量的甲酸和琥珀酸。 蛋白质分解力微弱。蛋白质分解力微弱。第十七页，共38页。专性厌氧，

10、但不同菌种或菌株对氧的敏感性存在差专性厌氧，但不同菌种或菌株对氧的敏感性存在差异，屡次传代培养后，菌株的耐氧性增强。异，屡次传代培养后，菌株的耐氧性增强。生长温度范围生长温度范围2545，最适生长温度，最适生长温度37。生长生长pH值范围值范围4.58.5，最适生长起始，最适生长起始pH值值6.57.0，不，不耐酸，酸性环境耐酸，酸性环境pH5.5对菌体存活不利。对菌体存活不利。 第十八页，共38页。3、代表种、代表种 人体肠道中共有人体肠道中共有8种，其中数量最多的种，其中数量最多的5种为：种为：两歧双歧杆菌两歧双歧杆菌B.bifidum婴儿双歧杆菌婴儿双歧杆菌B.infantis青春双歧杆

11、菌青春双歧杆菌B.adolescentis长双歧杆菌长双歧杆菌B.longum短双歧杆菌短双歧杆菌(B.breve)第十九页，共38页。4、双歧杆菌功能、双歧杆菌功能是人体肠道有益菌群，它可定殖在宿主的肠粘膜上形是人体肠道有益菌群，它可定殖在宿主的肠粘膜上形成生物学屏障成生物学屏障 具有拮抗致病菌、改善微生态平衡、合成多种微生素、具有拮抗致病菌、改善微生态平衡、合成多种微生素、提供营养、抗肿瘤、降低内毒素、提高免疫力、保护造提供营养、抗肿瘤、降低内毒素、提高免疫力、保护造血器官、降低胆固醇水平等重要生理功能，其促进人体血器官、降低胆固醇水平等重要生理功能，其促进人体安康的有益作用，远远超过其它

12、乳酸菌。安康的有益作用，远远超过其它乳酸菌。 第二十页，共38页。二、检测仪器设备二、检测仪器设备 冰箱：冰箱：04恒温培养箱：恒温培养箱：361恒温水浴锅：恒温水浴锅：461微生物显微镜微生物显微镜三角瓶：三角瓶：500ml灭菌刻度吸管：灭菌刻度吸管：1ml、10ml 灭菌平皿：直径灭菌平皿：直径90mm第二十一页，共38页。三、三、 培养基培养基 1、改进、改进MC培养基培养基 成分：大豆蛋白胨，成分：大豆蛋白胨，5g；牛肉浸膏，；牛肉浸膏，5g;酵母浸酵母浸膏，膏，5g；葡萄糖，；葡萄糖，20g；乳糖，；乳糖， 20g；碳酸钙，；碳酸钙， 10g；琼脂，；琼脂，15g；蒸馏水，；蒸馏水，

13、1000mL；1的中的中性红溶液，性红溶液，5mL；硫酸多粘菌素；硫酸多粘菌素B，10万万IU。 11515分钟高压灭菌备用。分钟高压灭菌备用。第二十二页，共38页。2、培养基的准备、培养基的准备使用前，将灭菌培养基用微波炉或水浴锅加使用前，将灭菌培养基用微波炉或水浴锅加热溶解，在热溶解，在4045水浴中保温待用。水浴中保温待用。第二十三页，共38页。四、无菌室准备四、无菌室准备无菌室使用前后，用紫外灯照射无菌室使用前后，用紫外灯照射3040min。将工作服、。将工作服、工作帽和工作鞋放入无菌室进展灭菌，进入无菌室前工作帽和工作鞋放入无菌室进展灭菌，进入无菌室前换上工作服、工作帽和工作鞋。换上

14、工作服、工作帽和工作鞋。第二十四页，共38页。超净工作台面，使用前用超净工作台面，使用前用75%酒精擦拭消毒后，用紫酒精擦拭消毒后，用紫外灯照射外灯照射4045min；操作完毕后，用干净抹布将操；操作完毕后，用干净抹布将操作台面擦拭干净后，用作台面擦拭干净后，用75%的酒精棉球进展擦拭，开的酒精棉球进展擦拭，开启紫外灯照射启紫外灯照射4045min。第二十五页，共38页。五、接种培养五、接种培养 以无菌操作，用以无菌操作，用1ml灭菌刻度吸管吸取灭菌刻度吸管吸取1ml样品原液，注入含有灭菌生理盐水的试管内，样品原液，注入含有灭菌生理盐水的试管内，充分振摇，制成充分振摇，制成1:10的稀释液。的

15、稀释液。注意：刻度吸管尖端不要触及试管内生理盐注意：刻度吸管尖端不要触及试管内生理盐水。水。第二十六页，共38页。用用1ml灭菌刻度吸管吸取灭菌刻度吸管吸取1ml1:10的稀释液，注的稀释液，注入含有灭菌生理盐水的试管内，振摇试管，混入含有灭菌生理盐水的试管内，振摇试管，混合均匀。合均匀。注意：吸取稀释液前，用刻度吸管吹打，使稀注意：吸取稀释液前，用刻度吸管吹打，使稀 释混合均匀。刻度吸管尖端不要触及管内稀释释混合均匀。刻度吸管尖端不要触及管内稀释液。液。第二十七页，共38页。另取另取1ml灭菌刻度吸管，按上述操作顺序，灭菌刻度吸管，按上述操作顺序，做做10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换倍

16、递增稀释液，如此每递增一次，即换用用1支支1ml灭菌刻度吸管。灭菌刻度吸管。第二十八页，共38页。在无菌操作条件下，用在无菌操作条件下，用1ml灭菌刻度吸管吸取灭菌刻度吸管吸取选定的样品稀释液或原液至灭菌平皿内。选定的样品稀释液或原液至灭菌平皿内。 同上对同一样品重复操作，即每个选定的适当同上对同一样品重复操作，即每个选定的适当的样品稀释液做两个平皿。的样品稀释液做两个平皿。 第二十九页，共38页。按以上步骤，以按以上步骤，以1ml灭菌生理盐水作为空白操灭菌生理盐水作为空白操作对照。作对照。 在无菌操作条件下，将约在无菌操作条件下，将约15ml的改进的改进MC培养培养基倾入样品平皿中，将平皿置

17、于操作台面上轻基倾入样品平皿中，将平皿置于操作台面上轻轻转动，使样品和培养基混合均匀。轻转动，使样品和培养基混合均匀。 第三十页，共38页。接种培养操作录像接种培养操作录像第三十一页，共38页。讨论讨论录像中存在细节问题：录像中存在细节问题：1、拿平板前先消毒手、拿平板前先消毒手2、倒培养基前要对培养基的瓶进展消毒，、倒培养基前要对培养基的瓶进展消毒，可以酒精棉球消毒和酒精灯外焰消毒。可以酒精棉球消毒和酒精灯外焰消毒。第三十二页，共38页。待培养基凝固后，将平皿翻转，即有培养基待培养基凝固后，将平皿翻转，即有培养基的一面向上。的一面向上。 将所有平皿置于将所有平皿置于361培养箱中，培养培养箱

18、中，培养723h，观察乳酸菌菌落特征。，观察乳酸菌菌落特征。 第三十三页，共38页。六、菌落计数六、菌落计数 选取菌落数在选取菌落数在30300之间的平皿进展计数。之间的平皿进展计数。 计数后，随机挑取五个菌落进展革兰氏染色，显微镜检计数后，随机挑取五个菌落进展革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。查并做过氧化氢酶试验。 革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽孢的球菌或杆菌革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽孢的球菌或杆菌可定为乳酸菌。可定为乳酸菌。第三十四页，共38页。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，乘以其根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，乘以其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。