《发酵工程》第8章工业发酵染菌的防治

1、第八章第八章 工业发酵染菌的防治工业发酵染菌的防治学学 时：时：教学内容：教学内容：21.了解染菌对工业发酵的危害了解染菌对工业发酵的危害2.掌握染菌的检查、判断方法掌握染菌的检查、判断方法3.了解染菌的原因和预防措施了解染菌的原因和预防措施第一节第一节 染菌对工业发酵的危害染菌对工业发酵的危害 无论单菌发酵还是混合菌种发酵，都是纯种发酵，无论单菌发酵还是混合菌种发酵，都是纯种发酵，除菌种除菌种以外的其他微生物都应视为杂菌。以外的其他微生物都应视为杂菌。所谓染菌，是指在发酵培养所谓染菌，是指在发酵培养基中侵入了有碍生产的其它微生物。基中侵入了有碍生产的其它微生物。 我国几乎所有的发酵工业都曾遭

2、受过杂菌的污染，染菌率我国几乎所有的发酵工业都曾遭受过杂菌的污染，染菌率有时高达有时高达10%。染菌对发酵产率、提取收得率、产品质量和三。染菌对发酵产率、提取收得率、产品质量和三废治理等都有很大影响。染菌的结果，轻者影响产量或质量，废治理等都有很大影响。染菌的结果，轻者影响产量或质量，重者可引起倒罐，甚至停产，造成原料、人力和设备、动力的重者可引起倒罐，甚至停产，造成原料、人力和设备、动力的浪费。因此，防止杂菌和噬菌体污染是保证发酵正常进行的关浪费。因此，防止杂菌和噬菌体污染是保证发酵正常进行的关键之一。键之一。 防止染菌的原则：防患重于治理。防止染菌的原则：防患重于治理。一一. 染菌对不同品

3、种发酵的影响染菌对不同品种发酵的影响二二.感染不同种类和性质杂菌对发酵的影响感染不同种类和性质杂菌对发酵的影响三三.不同污染时间对发酵的影响不同污染时间对发酵的影响四四.染菌程度对发酵的影响染菌程度对发酵的影响五五.染菌对产物提取和产品质量的影响染菌对产物提取和产品质量的影响 菌种、培养基、发酵条件、发酵周期以及产物性质等不同，染菌种、培养基、发酵条件、发酵周期以及产物性质等不同，染菌造成的危害程度也不同。菌造成的危害程度也不同。一一. 染菌对不同品种发酵的影响染菌对不同品种发酵的影响 青霉素发酵青霉素发酵许多产青霉素酶的杂菌许多产青霉素酶的杂菌任何时期污染任何时期污染都可能使青霉素迅速被破坏

4、而一无所获。都可能使青霉素迅速被破坏而一无所获。 疫苗深层培养疫苗深层培养一旦受污染，全部废弃。一旦受污染，全部废弃。 柠檬酸发酵柠檬酸发酵产酸后产酸后pH值很低，一般杂菌不易生长值很低，一般杂菌不易生长防止前期染菌。防止前期染菌。 谷氨酸发酵谷氨酸发酵周期短，生产菌繁殖快，加之培养基不太周期短，生产菌繁殖快，加之培养基不太丰富丰富极少污染，但噬菌体危害大。极少污染，但噬菌体危害大。 肌苷、肌苷酸发酵肌苷、肌苷酸发酵生产菌是多种营养缺陷型，生长能生产菌是多种营养缺陷型，生长能力差，培养基营养丰富等力差，培养基营养丰富等易染菌易染菌 总之，无论何种发酵，染菌后都会造成糖及其他营养基质总之，无论何

5、种发酵，染菌后都会造成糖及其他营养基质被消耗，而影响发酵产物的合成，使产量大大地降低。被消耗，而影响发酵产物的合成，使产量大大地降低。二二.不同染菌对发酵的影响不同染菌对发酵的影响 在工业发酵中，不同种类的杂菌对发酵造成的危害是不同的。在工业发酵中，不同种类的杂菌对发酵造成的危害是不同的。 例如，在抗生素发酵中，青霉素发酵污染细短产气杆菌比例如，在抗生素发酵中，青霉素发酵污染细短产气杆菌比污染粗大杆菌危害更大；链霉素发酵污染细短杆菌、假单胞杆污染粗大杆菌危害更大；链霉素发酵污染细短杆菌、假单胞杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌更严重，而四环素发酵最怕污染菌和产气杆菌比污染粗大杆菌更严重，而四环素发酵

6、最怕污染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌。双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌。 谷氨酸发酵最危险的是污染噬菌体，因为噬菌体蔓延迅谷氨酸发酵最危险的是污染噬菌体，因为噬菌体蔓延迅速，难以防治，容易造成连续污染。速，难以防治，容易造成连续污染。三三.不同染菌时期对发酵的影响不同染菌时期对发酵的影响 菌体浓度低，培养基营养丰富，易染菌菌体浓度低，培养基营养丰富，易染菌先灭菌后弃去，先灭菌后弃去，同时还要对种子罐、管道进行检查、彻底灭菌。同时还要对种子罐、管道进行检查、彻底灭菌。1.种子培养期染菌种子培养期染菌2.发酵前期染菌发酵前期染菌 易染菌。杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁易染菌。杂菌与生产菌争夺营养

7、成分，干扰生产菌的繁殖和产物合成殖和产物合成应特别防止发酵前期染菌。应特别防止发酵前期染菌。 可重新灭菌，补充必要营养，重新接种。可重新灭菌，补充必要营养，重新接种。3.发酵中期染菌发酵中期染菌 严重干扰生产菌的代谢和产物的合成严重干扰生产菌的代谢和产物的合成。有的杂菌繁殖后产生。有的杂菌繁殖后产生酸性物质，酸性物质，pH值下降，糖、氮消耗迅速，菌体自溶，发酵液粘值下降，糖、氮消耗迅速，菌体自溶，发酵液粘性增加，产生大量泡沫，代谢产物的积累迅速减少或停止，有的性增加，产生大量泡沫，代谢产物的积累迅速减少或停止，有的已生成的产物也会被利用或破坏，有的发酵液变臭。已生成的产物也会被利用或破坏，有的

8、发酵液变臭。挽救处理困难，危害性很大。挽救处理困难，危害性很大。 如抗生素发酵，可将另一罐发酵正常、单位高的部分发如抗生素发酵，可将另一罐发酵正常、单位高的部分发酵液输入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，降酵液输入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，降低流加糖量的措施。低流加糖量的措施。又如柠檬酸发酵中期染菌，可根据所染杂菌的性质分别处理：又如柠檬酸发酵中期染菌，可根据所染杂菌的性质分别处理：加大通气量，加速产酸，必要时加入盐酸调节加大通气量，加速产酸，必要时加入盐酸调节pH，抑制杂菌，抑制杂菌污染细菌：污染细菌：可加入可加入0.0250.035gL的硫酸铜，抑制酵母生长的硫酸铜

9、，抑制酵母生长污染酵母：污染酵母：加入另一罐接近成熟的发酵液，降低加入另一罐接近成熟的发酵液，降低pH值，使黄曲霉自溶值，使黄曲霉自溶。污染黄曲霉：污染黄曲霉：青霉在青霉在pH值较低时也能生长，可考虑提前放罐。值较低时也能生长，可考虑提前放罐。污染青霉：污染青霉：4.发酵后期染菌发酵后期染菌如杂菌量不大，可继续发酵，如污染严重，可提前放罐如杂菌量不大，可继续发酵，如污染严重，可提前放罐。四四.染菌程度对发酵的影响染菌程度对发酵的影响 染菌程度越大，对发酵的危害就愈大。当生产菌已迅速染菌程度越大，对发酵的危害就愈大。当生产菌已迅速繁殖，在发酵液中占有优势，污染极少数杂菌繁殖，在发酵液中占有优势，

10、污染极少数杂菌(12个杂菌个杂菌/ 1L)，对发酵不会造成影响，因为这些杂菌需要时间繁殖才，对发酵不会造成影响，因为这些杂菌需要时间繁殖才能达到危害发酵的程度，而且环境对杂菌的繁殖已不利。能达到危害发酵的程度，而且环境对杂菌的繁殖已不利。 但是污染幅度较大时，特别是发酵前期和中期污染，将但是污染幅度较大时，特别是发酵前期和中期污染，将造成严重的危害。造成严重的危害。五五.染菌对产物提取和产品质量的影响染菌对产物提取和产品质量的影响菌体大多自溶菌体大多自溶由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加大幅度降低过滤效率大幅度降低过滤效率发酵液粘加大，甚至发臭。发酵液粘加大，

11、甚至发臭。造成影响：造成影响：过滤时间拉长，影响设备周转使用，破坏生产平衡过滤时间拉长，影响设备周转使用，破坏生产平衡对过滤的影响：对过滤的影响：有机溶剂萃取工艺：有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白，易发生乳化，使水相和溶剂相难于的水溶性蛋白，易发生乳化，使水相和溶剂相难于分开分开离子交换工艺：离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量的交换量对提取的影响：对提取的影响：对内在质量：对内在质量：染菌的发酵液含有较多的染菌的发酵液含有较多的蛋

12、白质和其它杂质蛋白质和其它杂质产品纯度产品纯度对产品外观：对产品外观：一些染菌发酵液经过处理一些染菌发酵液经过处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现浑过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现浑浊，影响外观浊，影响外观对产品质量的影响：对产品质量的影响：第二节第二节 染菌的检查和原因分析染菌的检查和原因分析二二.染菌的检查与判断染菌的检查与判断三三.染菌的原因分析染菌的原因分析四四.杂菌污染的途径和预防杂菌污染的途径和预防五五.染菌的拯救与处理染菌的拯救与处理一一.种子培养和发酵的异常现象种子培养和发酵的异常现象 1、种子培养异常、种子培养异常 其表现及原因：其表现及原因：（1）菌体生长缓慢：）菌

13、体生长缓慢：原料质量、菌体老化、供氧不足、原料质量、菌体老化、供氧不足、温度、酸碱度，种子冷藏时间长或接种量过低。温度、酸碱度，种子冷藏时间长或接种量过低。（2）菌丝结团：）菌丝结团：菌丝团中央结实，内部菌丝的营养吸收菌丝团中央结实，内部菌丝的营养吸收和呼吸受到影响，不能正常生长。原因多而且复杂。和呼吸受到影响，不能正常生长。原因多而且复杂。（3）代谢不正常：）代谢不正常：接种物质量和培养基质量、培养环境接种物质量和培养基质量、培养环境差，接种量小、杂菌污染等有关差，接种量小、杂菌污染等有关一一. .种子培养和发酵的异常现象种子培养和发酵的异常现象2、发酵异常、发酵异常 其表现及原因：其表现及

14、原因：（1）菌体生长差：）菌体生长差：种子质量的影响；导致代谢缓慢。种子质量的影响；导致代谢缓慢。（2）pH不正常：不正常：培养基质量、灭菌效果、补糖等影响；培养基质量、灭菌效果、补糖等影响；是所有代谢反应的综合反映。是所有代谢反应的综合反映。（3）溶解氧异常）溶解氧异常 染菌：染好氧菌，染厌氧菌染菌：染好氧菌，染厌氧菌（4）泡沫过多）泡沫过多 泡沫的消长不符合规律；培养基灭菌时温度过高或时泡沫的消长不符合规律；培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖变成氨基糖会引起泡沫。间过长，葡萄糖变成氨基糖会引起泡沫。（5）菌体浓度过高或过低）菌体浓度过高或过低 罐温长时间偏高；溶氧不足；营养条件差；种子

15、质量罐温长时间偏高；溶氧不足；营养条件差；种子质量差；菌体自溶。差；菌体自溶。（1）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）（2）平板划线培养或斜面培养检查法；）平板划线培养或斜面培养检查法； 平板制好后，应先保温平板制好后，应先保温24小时，确定无菌小时，确定无菌（3）肉汤培养基检查法（酚红变色）肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4）1 1、染菌的检查、染菌的检查二二.染菌的检查与判断染菌的检查与判断 以上以上3种检查法未发现染菌，还不能肯定未被种检查法未发现染菌，还不能肯定未被染菌；染菌； 原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较大的原因是以上检查法只

16、能检查杂菌浓度较大的染菌情况（染菌情况（1个个/ml）2、以上、以上3种检查法的不足种检查法的不足（l）溶解氧水平异常变化显示染菌溶解氧水平异常变化显示染菌 如谷氨酸发酵，在发酵初期，菌体处于适应期，耗氧量很少，如谷氨酸发酵，在发酵初期，菌体处于适应期，耗氧量很少，溶解氧基本不变；当菌体进入对数生长期，耗氧量增加，溶解氧溶解氧基本不变；当菌体进入对数生长期，耗氧量增加，溶解氧浓度很快下降，并且维持在一定水平浓度很快下降，并且维持在一定水平(5%饱和度以上饱和度以上)，这阶段，这阶段由于操作条件由于操作条件(pH、温度、加料等温度、加料等)变化，溶解氧有波动但变化不变化，溶解氧有波动但变化不大；

17、发酵后期，菌体衰老，耗氧量减少，溶解氧浓度又上升。大；发酵后期，菌体衰老，耗氧量减少，溶解氧浓度又上升。3、发酵过程的异常现象来判断染菌、发酵过程的异常现象来判断染菌 当感染噬菌体时，生产菌的呼吸作用受抑制，溶解氧浓度很当感染噬菌体时，生产菌的呼吸作用受抑制，溶解氧浓度很快上升。其溶氧变化比菌体浓度变化更快速灵敏。快上升。其溶氧变化比菌体浓度变化更快速灵敏。（2）排气中）排气中CO2异常变化显示染菌异常变化显示染菌 好气性发酵排气中好气性发酵排气中CO2含量与糖代谢有关，可以根据含量与糖代谢有关，可以根据CO2含量来控制发酵工艺（如流加糖、通风量等）。含量来控制发酵工艺（如流加糖、通风量等）。

18、 对于某种发酵，在工艺一定时，对于某种发酵，在工艺一定时，排气中排气中CO2含量变化是有含量变化是有规律的规律的。在染菌后，糖的消耗发生变化（加快或减慢），引起。在染菌后，糖的消耗发生变化（加快或减慢），引起CO2含量的异常变化。如污染杂菌，糖耗加快，含量的异常变化。如污染杂菌，糖耗加快，CO2含量增加；含量增加；感染噬菌体，糖耗减慢，感染噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少。因此，可根据含量减少。因此，可根据CO2变变化来判断染菌。化来判断染菌。三三.染菌的原因分析染菌的原因分析1.发酵染菌率发酵染菌率 发酵的总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总投料发酵批次发酵的总染菌率：指一年内发酵染菌的批次

19、与总投料发酵批次数之比的百分率：数之比的百分率：发酵染菌率是在发酵罐中发生的染菌率，包括染菌后引起倒罐发酵染菌率是在发酵罐中发生的染菌率，包括染菌后引起倒罐的批数，的批数，但种子罐培养的染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌但种子罐培养的染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。的另行计算。总染菌率总染菌率=发酵染菌批数发酵染菌批数总投料批数总投料批数100% 除总染菌率外，还有：除总染菌率外，还有：设备染菌率：设备染菌率：某一设备缺陷某一设备缺陷不同发酵阶段的染菌率：不同发酵阶段的染菌率：前、中、后期前、中、后期季节染菌率：季节染菌率：操作染菌率：操作染菌率：操作工操作工 染菌率高低与发酵的菌种

20、、培养基、产品性质、发酵周染菌率高低与发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件、设备和管理技术水平有关。期、生产环境条件、设备和管理技术水平有关。2. 染菌原因分析染菌原因分析 总结经验教训，防患于未然，是积极防止发酵染菌的最重要措总结经验教训，防患于未然，是积极防止发酵染菌的最重要措施。施。 原因很多，归纳起来主要有：原因很多，归纳起来主要有：种子带菌种子带菌无菌空气带菌无菌空气带菌设备渗漏设备渗漏灭菌不彻底灭菌不彻底操作失误操作失误技术管理不善技术管理不善（1）从污染时间来分析）从污染时间来分析种子培养阶段：种子培养阶段：种子，灭菌，操作种子，灭菌，操作发酵后期：发酵后期：空气

21、，补料，设备渗漏，泡沫顶盖，操作空气，补料，设备渗漏，泡沫顶盖，操作发酵前期：发酵前期：种子，灭菌，操作，空气种子，灭菌，操作，空气（2）从污染的杂菌种类来分析）从污染的杂菌种类来分析杂菌是耐热的芽孢杆菌：灭菌，死角杂菌是耐热的芽孢杆菌：灭菌，死角不耐热杂菌：种子带菌、空气带菌、设备渗漏、操作问题等；不耐热杂菌：种子带菌、空气带菌、设备渗漏、操作问题等；真菌：渗漏，无菌室灭菌不彻底，无菌操作，糖液灭菌不彻底；真菌：渗漏，无菌室灭菌不彻底，无菌操作，糖液灭菌不彻底；大批量发酵罐染菌：大批量发酵罐染菌： 前期：种子带菌或连消设备引起染菌；前期：种子带菌或连消设备引起染菌； 中、后期：空气净化系统存

22、在系统结构不合理、过滤器失效。中、后期：空气净化系统存在系统结构不合理、过滤器失效。（3）从染菌的规模来分析）从染菌的规模来分析部分发酵罐染菌：部分发酵罐染菌：前期：种子染菌、连消系统灭菌不彻底；前期：种子染菌、连消系统灭菌不彻底；后期：补料染菌（料液本身带菌或补料管道渗漏）。后期：补料染菌（料液本身带菌或补料管道渗漏）。个别发酵罐连续染菌：设备渗漏个别发酵罐连续染菌：设备渗漏四四.杂菌污染的途径和预防杂菌污染的途径和预防1.种子带菌及防止种子带菌及防止（l）培养基及用具灭菌不彻底：培养基及用具灭菌不彻底：防假压防假压（2）菌种在移接时被污染：）菌种在移接时被污染：操作不当，无菌室管理不严操作

23、不当，无菌室管理不严（3）菌种在培养、保藏过程中受污染：）菌种在培养、保藏过程中受污染：试管塞，培养和保藏温试管塞，培养和保藏温度不宜变化太大。度不宜变化太大。2. 无菌空气带菌及防止无菌空气带菌及防止无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。从空气净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、从空气净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。3.培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防止培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防止 （2）实罐灭菌时未充分排除罐内冷空气：）实罐灭菌时未充分

24、排除罐内冷空气：“假压假压”（1）原料性状：）原料性状：淀粉质原料在升温过快或混合不均匀时，容易淀粉质原料在升温过快或混合不均匀时，容易结块，结块，“夹生夹生”，包埋的活菌不易杀灭。，包埋的活菌不易杀灭。升温前搅拌，并升温前搅拌，并加入一定量加入一定量-淀粉酶。淀粉酶。（3）连续灭菌时蒸汽压力波动大，未达到灭菌温度：）连续灭菌时蒸汽压力波动大，未达到灭菌温度：严格严格控制灭菌温度，最好采用自动控制装置。控制灭菌温度，最好采用自动控制装置。（4）设备、管道存在）设备、管道存在“死角死角”：“死角死角”：由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引

25、起蒸汽不能有效到达预定的局部灭菌部位，从而不能达因，引起蒸汽不能有效到达预定的局部灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的要求。到彻底灭菌的要求。 常见的设备、管道常见的设备、管道“死角死角” 发酵罐的发酵罐的“死角死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，发：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐底脓疱状积垢酵罐罐底脓疱状积垢。图：不锈钢衬里破裂造成死角图：不锈钢衬里破裂造成死角图：发酵罐罐底积垢图：发酵罐罐底积垢 管道安装不当形成的死角4.设备渗漏引起染菌及防止设备渗漏引起染菌及防止（1）发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、磨擦和发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。振动等原因，往往造成渗漏。如：砂眼由于腐蚀逐渐加深，最终导致穿孔。如：砂眼由于腐蚀逐渐加深，最终导致穿孔。冷却管受搅拌器作用，长期磨损，焊缝处受冷热和振动产冷却管受搅拌器作用，长期磨损，焊缝处受冷热和振动产生裂缝而渗漏。生裂缝而渗漏。（2）微小渗漏的检查：可以压入碱性水，用浸湿酚酞指示剂）微小渗漏的检查：可以压入碱性水，用浸湿酚酞指示剂的白布擦，有渗漏时白布显红色。的白布擦，有渗漏时白布显红色。5.操作失误导致的染