《基因工程》重点

1、基因工程重点第一章一、名词解释：基因工程：基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体链接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使基因生物获得新的遗传性状的操作。基因操作：泛指对基因进行酶切、连接、转化等分子生物学操作，是基因工程的技术基础。基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，它在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节，很多时候并不涉及动物、植物等的转化及性状的遗传改良。第二章一、名词解释：核酸酶：通过切割相邻两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而使核酸分子多核苷酸链发生水解

2、断裂的酶。限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）：简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链结构的内切核酸酶。限制-修饰系统：黏性末端（sticky end）：指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。平末端（blunt end）：若限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端为平末端。同切点酶（isoschizomer）：又称同裂酶，是一类来源于不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。同尾酶（isocaudamer）：来

3、源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的粘性末端。酶的星号活性（star activity）：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定条件下测定的。当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。DNA连接酶（DNA ligase）：能催化双链DNA片段靠在一起3'羟基末端与5'端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两端连接的一种核酸酶。DNA聚合酶:DNA聚合酶的作用是在引物和模板的作用下，把脱氧核糖单苷酸连续地加到双链DNA分子引物的3'-OH末端，催化甘氨酸的聚合作用。TaqDNA聚合酶：是一种耐热的依赖

4、DNA的DNA聚合酶，Taq基因全长2496bp，编码832个氨基酸，相对分子质量约为94000，除具有53聚合酶活性外，还有53外切酶活性，但没有35外切活性，因而无35方向的校正功能。反转录酶(reverse transcriptase):是依赖于RNA的DNA聚合酶，或称为RNA指导的DNA聚合酶，是分子克隆中重要的核酸酶之一。反转录酶普遍存在于含RNA的反转录病毒中，它以RNA为模板，催化合成互补的DNA单链，进而合成DNA第二条链。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT):，简称末端转移酶，一般是从小牛胸腺中提取的一种碱性蛋白，相对分子质量为3400。在末端转移酶催化下将脱氧核苷酸添加到DNA

5、分子的3-OH，伴随无机磷酸的释放。碱性磷酸酶:能够催化核酸分子脱掉5的磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH末端。外切核酸酶(exonuclease):是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。S1核酸酶:来源于米曲霉，是一种含锌的蛋白质，相对分子质量为32000，相对耐热，由nucO编码，可以高特异性地降解单链DNA和RNA，包括单链分子中的单链区域(如发卡结构)，反应产物为5单核苷酸链，调节S1核酸酶的用量，可以切割双链DNA的单链缺刻，但它不能识别单个碱基对的错配。脱氧核糖核酸酶(DNase):简称DNA酶，是来源于牛胰脏的糖蛋白。它是一种需要二价阳离子的内

6、切核酸酶，能从嘧啶核苷酸5端磷酸基处随机降解单链或双链DNA，生成具有5磷酸末端的寡核苷酸。当有Mg2+存在时，能在双链DNA上随机独立地产生切口；而在Mn2+存在时，则在双链DNA的大致同一位置上切割，产生平末端。核糖核苷酸A(RNase A)：又称RNA酶A，是从牛胰脏中分离纯化得到的一种内切核酸酶，它可以特异性地攻击RNA上嘧啶残基的3端，切割胞嘧啶或尿嘧啶与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，反应终产物是嘧啶3磷酸和末端带嘧啶3磷酸的寡核苷酸。P13页的表21二、思考题1、Klenow片段和大肠杆菌DNA聚合酶有何异同？答：(1)Klenow片段是来自大肠杆菌DNA聚合酶的大片段(2)DNA聚

7、合酶具有53聚合酶活性，35核酸外切酶活性，53核酸外切酶活性；Klenow片段只有53聚合酶活性，35核酸外切酶活性。2、型限制性内切核酸酶的基本特性有哪些？答:型限制性内切核酸酶只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，其识别和切割DNA分子具有严格的特异性。识别序列的特异性:识别序列为4-6bp的双重螺旋对称结构的回文序列；切割位点的特异性：在识别序列内或附近特异性切割双链DNA分子，水解磷酸二酯键，产生3端羟基、5端磷酸基团的DNA片段。3、大肠杆菌DNA聚合酶酶有哪些不同的酶活性特性，各有何利用价值？53聚合酶活性:大肠杆菌DNA聚合酶的聚合酶活性是以DNA为模板，利用体系中的4种脱氧核

8、糖核苷(dNTP)，催化单核苷酸分子加到引物的3-OH末端，沿53合成与模板互补的另一条DNA链，聚合作用需要Mg2+存在。模板DNA可以是单链或双链DNA分子。双链DNA只有在其一条链上有一个或数个断裂时才可以作为有效模板。35外切酶活性：大肠杆菌DNA聚合酶的35外切酶活性是沿35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸，这种外切酶活性在体内DNA复制时主要起校对作用。当DNA复制中掺入的核苷酸与模板不互相而游离时就会被其35外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。这种校对功能保证了DNA复制的真实性，从而降低突变率。53外切酶活性：大肠杆菌DNA聚合酶的53外切酶活性，是

9、从5端降解双链DNA分子。它也可以讲解DNA：RNA杂合体中的RNA分子，即具有RNA酶H的活性。这种酶外切活性特点是：待切除的核酸分子必须具有5端游离基团；核苷酸分子被切除前位于已配对的DNA双螺旋区段上；被切除的可以是脱氧核苷酸，也可以是非脱氧核苷酸。第三章一、名词解释载体：能携带外源基因进入细胞复制、整合或表达的工具。质粒：存在于多种宿主细胞中，独立于染色体外的可自主复制闭合环状的DNA分子。人工染色体(载体):染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源基因DNA片段复制的载体，其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体的大小媲美。

10、二、相关知识重点1、载体必须满足的基本条件：具有对受体细胞的能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增值具有单一性制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因的插入4、具有合适的选择性标志，用于含有重组质粒的宿主细胞筛选2、 （1）pBR322质粒载体的基本特征:由ColE1质粒衍生的pMB1作为出发质粒构建而成。复制起点来自pMB1，拷贝数15-20，具有tet 和amp 。（2）pUC18和pUC19的基本特征:均由pBR322改造而来。两个质粒结构几乎一样，只是多克隆位点的排列方向相反。复制起始位点为突变的pMB1，缺乏控制拷贝数的rop基因，不含多余的DNA片段。均只保留pUB

11、R322的amp 基因，含有一段来自M13mp18/19的lacZ基因5'末端的编码序列，在特定的受体细胞中可变现-互补作用，形成蓝、白菌落可用于筛选重组质粒。注重看一下：P40和P47的两个图及其含义3、 常用的人工染色体有酵母人工染色体和细菌人工染色体。4、 原核表达载体的表达元件主要包括：启动子、复制子、转录终止子、核糖体结合位点和标记基因。5、 Ti质粒可分为T-DNA、Vir、Con和Ori4个功能区，均可用于双子叶植物转基因中。P536、 质粒具有哪些特性？答：质粒的基本性质:1)复制:它们使质粒独立于宿主细胞的染色体外自主复制并保持其固有的遗传信息及相对稳定的拷贝数2)质

12、粒的不相容性：两种质粒在同一种宿主细胞中不能共存3）质粒的转移性：使质粒从一个细胞转移到另一个细胞中。8、试述黏粒载体的组成要素及其应用情况？答：黏粒载体由质粒和含有cos位点的DNA片段所组成，大小一般在5-7kb，包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和DNA的cos位点，既可以转化大肠杆菌并按质粒复制的方式复制，又可以承载40kb左右的外源DNA片段。应用：黏粒载体只有一个cos位点，所以在使用时要首先须对黏粒载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二联体线性DNA分子，当外源DNA重组进入二联体线性DNA分子，而且两个cos位点之间的核苷酸列足够长且与包装蛋白混合时，两个cos

13、位点可被A蛋白所切割，并将两个同方向cos位点之间的片段包装到噬菌体中去。9、表达载体需要的基本元件及其作用？答：1)启动子：DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列，其强弱影响表达量的决定因素之一。2） 转录终止子：稳定系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定。3）核糖体结合位点：转录出的mRNA必须借助宿主细胞的蛋白质合成系统翻译出目的蛋白。细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效核糖体位点以及其中的SD序列，从而启动临近的翻译起始密码子的蛋白质翻译。4）复制子： 能独立进行复制的一部分DNA，其中包括发出被动复制指令的基因。5

14、)标志基因：通过检测受体细胞中有无标记基因来判断是否成功将重组质粒（带有目的基因）导入受体细胞。第四章一、名词解释1、Southern杂交：是将DNA片段从琼脂糖转移到滤膜上。2、Northern杂交：是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。3、Western杂交：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。4、探针：是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列，这些序列在使用之前，需要进行标记。5、引物：是指在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链DNA片段。6、逆转录PCR：在RT-PCR中，一条R

15、NA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板透过PCR进行DNA复制。二、相关知识要点1、DNA提取的基本原理：DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂它的钠盐比游离态更易溶于水，DNA在水中溶解度可达10g/L，呈黏性胶体。生物细胞中大部分DNA大部分集中在细胞核，多以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。DNP在盐溶液中的溶解度受盐溶液浓度的显著影响（在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最低，在1mol/LNaCl溶液中溶解度很大），而核糖核蛋白（RNP）在盐溶液中的溶解度受盐溶液浓度的影响较小（在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度较大），因此常用钠盐法分离DNP和RNP两

16、种核蛋白。2、DNA提取的主要步骤：（1）细胞裂解和DNA的溶解 ：一般采用机械破碎细胞或酶解细胞释放DNA 。 （2）与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除 : 主要是利用DNA与蛋白质、多糖等在生化性质上的差别，通过加入离子变性剂、去污剂使蛋白或多糖类变性。 （3）DNA的沉淀和纯化 ：将向得到的DNA上清液中加入2倍体积的无水乙醇可使其沉淀。3、NA提取的基本原理:TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留

17、在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。4、紫外光光度法测定DNA、RNA的浓度和纯度样品中单链DNA、双链DNA和RNA的浓度计算公式：SSDNA=33*(OD260OD310)*稀释倍数dSDNA=50*(OD260OD310)*稀释倍数SSRNA=40*(OD260OD310)*稀释倍数1µg/mL DNA溶液OD260等于0.02 1µg/mL 的RNA或单链DNA溶液OD260等于0.0220.024 1个OD260相当于 50µg/mL 的双链DNA，37µg/mL单链DNA，40&#

18、181;g/mL的RNA，30µg/mL的寡核苷酸5、DNA电泳影响因素：（1） DNA分子大小：DNA分子越大，在凝胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。（2） DNA分子构型：不同构型的质粒DNA分子即使具有相同分子质量，电泳迁移速率也不同，超螺旋最快、线状分子次之。开环分子最慢。（3） 凝胶浓度：对于同种DNA分子，凝胶浓度越高，电泳速率越慢；浓度低的胶线性范围较宽，而浓度高的凝胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。（4） 电场强度：电场强度高（5V/cm），电泳速度快，但分辨率低。（5） 溴化乙锭（EB）：其具有扁平结构，能嵌入到DN

19、A碱基对间，可用作DNA染色剂。（6） 电泳缓冲液：目前有TAE（多用，时间短成本低）、TBE、TPE3种6、核酸分子杂交：实质上是双链DNA或者具有二级结构的RNA变性后，其具有互补序列的两条单链的退火复性过程。应用于重组子鉴别、基因分离、DNA片段分析、基因表达研究等7、Southern杂交应用：遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等，例如在研究转基因的时候，可用于检测外源基因的插入和整合情况。8、Northern杂交应用：是检测、定量mRNA大小及在组织中表达水平的标准方法，既是能直接提供有关RNA完整性、不同的剪接信息及mRNA大小等信息的唯一方法，也是在同一张膜上直接比较同一信

20、息在不同样品中的表达丰度的首选方法。9、Western杂交应用：主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。10、PCR技术原理：DNA在高温时可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做引发子，加入DNA聚合酶、dNTP完成特定基因的体外复制。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。12、PCR技术的基本过程：变性、退火和延伸（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经P

21、CR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；（2）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；（3）引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的"半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。13、PCR的反应体系含有哪些基本成分？缓冲液、模板、dNTP、耐热的DNA聚合酶、引物和体内

22、复制相比较，PCR体外反应体系还需要加耐热的DNA聚合酶DNA聚合酶应用区别：TaqDNA聚合酶：扩增效率最高的耐热DNA聚合酶，能很好的扩增6kb以下的DNA 片段。扩增碱基出错率为10-5左右。 PfuDNA聚合酶：目前保真度最高的耐热DNA聚合酶，碱基出错率为10-6，但扩增效率低于Taq酶，一般能很好的扩增2kb以下的片段。14、提取DNA、RNA的步骤主要有哪些？需要注意哪些问题？DNA提取：（1）细胞裂解和DNA的溶解 （2）与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除 （3）DNA的沉淀和纯化 注意问题：RNA的提取：（1）细胞的有效破碎 （2）使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放

23、到溶液中 （3)有效地抑制内源及外源RNase活性 （4）将RNA与DNA、蛋白质和多糖分开 注意的问题：15、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲电泳的原理是什么？影响因素有哪些？各有什么用途？（1) 琼脂糖凝胶电泳：是以琼脂糖为支持物，在适当条件下对带电生物大分子进行电泳的技术，主要用于DNA分子的分离、纯化和鉴定。影响因素：1）DNA分子大小 2）DNA分子构型 3）凝胶浓度 4）电场强度 5）溴化乙锭 6）电泳缓冲液（2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳：是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物介质的垂直凝胶电泳，可根据电泳样品的电荷、分子大小及性状的差别分离物质。适用于小分子DNA、寡聚核苷酸和蛋白质的分离。影

24、响因素：电场强度、分子静电荷量、分子大小和形状以及介质的离子强度、黏度和温度。（3) 脉冲电泳：是一种交替变换电场方向的电泳，它以一定的角度并以一定的时间改变电场的方向，是DNA在微观上按“Z”字形向前泳动，从而达到分离相对分子量大的DNA片段的目的，可使50Kb以上，甚至Mb级的大片段DNA。影响因素：电场方向、电流大小及作用时间。16、分子杂交的原理是什么？有几种类型？各有什么作用？核酸分子杂交实质上是双链DNA或者具有二级结构的RNA变性后，其具有互补序列的两条单链的退火复性过程。 有核酸和蛋白质两种类型 应用于重组子鉴别、基因分离、DNA片段分析、基因表达研究等17、设计引物应遵循以下

25、原则：1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3''端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。4、引物3''端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。5、引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶

26、序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。6、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。7、引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。18、实时定量PCR的原理是什么？有哪些应用？在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析应用：对特定核苷酸片段进行指数级的扩增第五章一、名词解释：1.RACE：即cDNA末端的快速扩增技术，是一种根据已知部分cDNA序列扩增未知序列

27、，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的PCR技术。或者2.RACE：即cDNA末端的快速扩增技术，是一种根据已知部分cDNA序列扩增未知序列的PCR技术。这种方法是根据基因编码蛋白的同源性或多个同源基因cDNA比较的变异情况，将同源基因cDNA的核心区段分析出来，针对核心区段保守性高的位点设计引物，然后运用RT-PCR克隆技术核心序列区。3.简并序列：由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列。4.基因组文库：简称基因文库，是将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。5.cDNA文库:是将生物特定的组织器

28、官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录。或者6.cDNA文库:以特定的组织或细胞mRNA为模板，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。二、思考题1.通过查阅资料了解5RACE克隆的几种具体方法和实验流程？答：方法与实验流程：（1）利用烟草碱性磷酸酶将mRNA5端的帽子结构切除，然后利用T4RNA连接酶上一段已知序列的寡核苷酸，RACE时可将它作为设计上游引物的依据。（2）利用特殊反转录

29、酶法，在反转录到cDNA的末端时，加上了几个多余的C碱基，在体系中加入3端为几个G碱基的已知序列寡核苷酸，在合成cDNA末端加上一段延伸的序列，作为上游引物的位点，在反转录酶的作用下，利用oligo作引物合成cDNA第一链，反转录酶在cDNA第一链末端延伸合成了几个C碱基，体系中加入的3端为G碱基的寡聚唐序列与cNDA末端互补，作为cDNA继续延伸合成的模板，在cDNA的末端合成出一段已知序列，形成5RACE的引物位点。（3）在cDNA第一链利用末端转移酶加上一段寡聚核苷酸作为引物结合的序列。（末端脱氧核糖核酸转移酶法）（4）单链cDNA分子环化法2、什么是简并引物？设计简并引物时怎样降低简并

30、度？答：简并引物：是合成一段作PCR扩增体系的简并序列的引物即为简并引物。 简并度越低，产物特异性越强，所以设计简并引物时在选取氨基酸序列时应选取对应密码子较少的残基，放弃最后一个氨基酸放弃其密码子的第3为碱基（避免引物3末端兼并）。 3、基因文库要满足什么条件？有哪些类型的基因文库？ 答：（1）基因文库要满足的条件：首先要满足文库的完整性，即文库应包含基因组的完整序列信息。基因组信息的可重建性。基因组文库的大小，即文库中应包含的独立重组子数目。 （2）基因文库的类型：按其克隆的载体分，通常有质粒文库、噬菌体载体文库、粘性粒文库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库等。4、cDNA文库必须满

31、足什么条件，其构建包括哪些步骤？ 答：条件：cDNA文库的代表性，即文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性；文库中的重组cDNA片段的序列完整性。（2）步骤：细胞总RNA的制备及分离、cDNA第一链的合成、双链cDNA的合成、双链cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒的包装及感染宿主细胞等。 总 RNA 的提取 RNA 提取程序一般包括：沉淀细胞、裂解细胞、离心除去细胞残渣。分离mRNA 分离mRNA前，需先分离总RNA，一般利用异硫氰酸胍和-巯基乙醇是核糖体解体，后通过沉淀得总RNA。在合成cDNA第一链之前应对其完整性进行检测。对mRNA进行富集，即通过一定的方式使特定的mR

32、NA分子在体系中的比例增高。cDNA的合成 cDNA第一链的合成是以mRNA分子为模板，在反转录酶的作用下，利用适当引物引导DNA合成的过程。mRNA3端为polyA尾为cDNA第一链的合成提供了一个很好的引物位点。黏性末端片段与载体的连接 为cDNA双链分子方便克隆入相应载体，常在oligo寡聚引物一端接上含有特定限制性核酸酶黏性末端的接头分子。离体包装获得重组噬菌体 检测重组噬菌体效价。第4题百度的答案是如下：条件：1 、要使用mRNA经过反转录PCR产生cDNA.2 、要进一步获得cDNA全长3 、加适当接头,连接到适当的载体内.4 、转化受体细胞,构建为cDNA文库.基本步骤包括：RN

33、A 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的cDNA 文库,获得高质量的mRNA 是至关重要的,所以处理mRNA 样品时必须仔细小心.由于RNA 酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA很重要.在获得高质量的mRNA 后用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成cDNA 第1链,cDNA 第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA 聚合酶I,同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析c

34、DNA插入片断.扩增cDNA 文库、对建立的cDNA文库进行鉴定.第六章一、名词解释1、感受态细胞：就是处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞。二、相关知识重点<一>黏性末端的连接应用（1）同一种酶产生的黏性末端的连接当带有相同黏性末端的DNA片段一起退火，并在DNA连接酶的催化作用下黏性末端的单链之间便可进行碱基配对，被共价地连接起来形成重组DNA分子。例如pBR322质粒进行BamHI酶切形成带有BamHI黏性末端的线性质粒。（2）不同种酶产生的黏性末端的连接用两种限制性内切核酸酶消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同的黏性末端，将它们混合，在

35、连接酶的作用下相同的黏性末端可以退火连接成重组DNA分子，实现DNA的定向连接。<二>平末端的连接应用对于平末端，通过调整反应条件就可用DNA连接酶实现片段之间的连接，非互补的黏性末端需修饰成平末端，再按平末端连接的方法进行连接同聚物加尾法：是指在相互连接的两类DNA分子中，其中一类的3'末端加上一段聚脱氧腺苷（polyA），另一类的3'末端加上一段聚脱氧胸苷（polyT），然后二者混合，在T4DNA连接酶作用下连接成环状分子。衔接物连接法：衔接物是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成、具有一个或数个 限制酶识别位点的平头末端的双链寡聚核苷酸片段。将衔接物的

36、5'末段和待克隆的DNA片段的5'末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4 DNA连接酶使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。随后按常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。人工接头连接法：人工接头是指人工合成的含有限制酶识别顺序的核苷酸片段。将具有平头末端的外源DNA片段与人工接头分子在T4 DNA连接酶的作用下连接起来。再用限制酶切割产生具有粘性末端的DNA片段，然后与具有同样粘性末端的载体DNA分子在T4 DNA连接酶作用下连接成重组体<三>转化、感染、转染

37、的区别答：转化：是指以质粒为载体，将外源DNA导入处于感受态的大肠杆菌等原核宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。感染：将以噬菌体DNA为载体的DNA重组分子，包装成细菌颗粒，使其感染受体菌的过程。转染：是以噬菌体为受体，但不经过蛋白质包装成病毒颗粒，而是用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体菌的过程。<四>重组DNA导入植物细胞的方法答：农杆菌介导的Ti质粒遗传转化法、植物病毒介导的感染、基因枪法、电击法、原生质体融合、显微注射、激光微束法、花粉管通道法<五>重组DNA导入动物细胞的方法磷酸钙沉淀法、脂质体介导感染法、显微注射法病毒感染法 、DEA

38、E葡聚糖转染技术、电击法、血影细胞介导法、<六>DNA片段与载体DNA的重组主要有哪几种方法？各有何优缺点？主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用。1、黏性末端的连接法（1）同一种酶产生的黏性末端的连接当载体和外源DNA用同一种限制性内切核酸酶消化时，可产生相同的黏性末端。当带有相同黏性末端的DNA片段一起退火，在DNA连接酶的催化作用下黏性末端的单链之间便可进行碱基配对，被共价地连接起来形成重组DNA分子。缺点：产生的目的基因会自身环化。（2）不同种酶产生的黏性末端的连接用两种限制性内切核酸酶消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同的黏性末端

39、，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可以退火连接成重组DNA分子，实现DNA的定向连接。优点：避免了载体和外源DNA片段的自身连接，外源DNA只能定向的连接到载体的相应位点之间。缺点：但也不可避免的会发生载体的位点黏性末端之间两个碱基互补形成开环。还可应用同尾酶产生的黏性末端进行连接，这样可以避免载体自连并得到最高的连接。2、平末端的连接优点：给不同的DNA分子的连接带来极大的方便。缺点：连接效率低，限制性内切核酸酶原有识别系列可能被破坏，外源DNA的插入没方向性，可能产生多拷贝插入现象。（1） 同聚物加尾法：优点：既可使两个平末端的DNA片段进行连接，也可以使平末端的DNA片段与黏性

40、末端DNA片段连接，连接效率较高缺点：操作繁琐，外源片段难以收回，同聚物尾巴可能会影响外源基因表达。不能把插入片段再切下来（2）衔接物连接法：适用于没有衔接物限制性内切核酸酶酶切位点的外源DNA片段。优点：是即有效又实用的手段，兼具同聚物加尾法和黏性末端连接法的优点，可以使任意两个不同末端的DNA片段都能连接起来，增加衔接物浓度还可显著提高效率。缺点：如果待克隆的DNA片段或基因的内部含有与衔接物相同的限制性内切核酸酶识别位点，这样在酶切消化衔接物产生黏性末端的同时，也会把外源基因切成不同的片段，给后续的亚克隆及其他操作造成麻烦。（3）接头分子连接法：优点：能较好的克服衔接物连接法的缺点缺点：

41、接头之间会连接。3、PCR产物的连接(1)、引入酶切位点连接法优点：效率较高，可有效地定向克隆PCR产物缺点：必须保证所选酶切位点在扩增的PCR产物内部不存在，还需在5-端多合成3-4个碱基一利于稳定结合。(2)、T-A克隆法：优点：效率比平末端的连接至少高出100倍，可有效的直接克隆PCR产物。4、Gateway载体构建系统：其是一个高效的大规模克隆系统。优点：可以在不进行酶切和连接的基础上实现基因快速克隆及载体间平行转移，同时还有利于保持正确的开放阅读框和插入方向。可以使用并表达来自多种类型的DNA序列。很适应于将大量的DNA序列转移到各种不同的表达载体上。可通过添加Gateway盒轻易地

42、将直接感兴趣的载体改造成Gateway目的载体。缺点：DNA重组序列位点具有毒性。<七>如何将一平末端的DNA片段与BamH I 形成的黏性末端连接？ 答：将平末端的DNA也用BamH I酶切，获得带有BamH I黏性末端的DNA，将二者混合，在DNA连接酶的作用下，它们的黏性末端互补，彼此退火连接形成环状的重组质粒。（在平末端不存在酶切位点的情况下，则要在末端添加衔接物或含BamHI酶切位点的接头，然后再进行酶切连接）<八>重组子筛选主要有哪些方法？答：1、载体表型选择法（1）、抗药性标记插入失活选择法 （2）、半乳糖苷酶显色反应选择法 2、根据插入基因的表型选择法

43、3、DNA电泳检测法4、PCR检测法5、核酸杂交检测法6、免疫化学检测法（1）放射性抗体检测法（2）免疫沉淀检测法（3）表达载体产物的免疫化学检测法7、DNA序列分析<九>为什么pUC系列的载体与外源基因形成的重组体可用蓝白斑实验进行筛选？答：pUC系列载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因。pUC系列载体的多克隆位点区处于-半乳糖苷酶的肽编码区内，插入外源DNA片段后，肽编码区错位，肽失活，在将连接载体转入宿主细胞后，加入IPTG诱导和X-gal后，插入外源基因的载体菌落失去产生颜色的功能而呈白色，而没插入的菌落呈现蓝色，可以很

44、方便的通过辨识菌落的颜色筛选到阳性克隆<十>某一质粒载体有tetr和ampr的表型，在ampr中有一EcoRI的酶切位点，现用EcoRI切割载体进行基因重组，问如何用抗性变化筛选含有插入片断的重组体？答：因ampr上识别位点被EcoRI切割，故该质体将失去抗Amp的表型。将酶切后的质粒组装成的重组体转化菌先涂布在含有四环素的平板上生长，再将存活的菌落原位影印到另一个含有氨苄青霉素的平板上。在四环素平板上生长而在氨苄青霉素平板上不生长的菌落，即表明已筛选到含有插入片段的重组提质粒。第七章1、 名词解释：1、 基因表达：遗传信息从DNARNA蛋白质的过程2、 阅读框架：又称开放阅读框架

45、，是基因的编码区，包含从起始密码子至翻译终止密码子之间的cDNA序列。3、 顺式作用元件：是在转录水平上对基因表达有调节活性的DNA序列，包括启动子、增强子、沉默子和衰减子等，多位于基因旁侧或内含子中，一般只调节与其处于同一个DNA分子上的基因。4、 启动子：是RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA序列5、 增强子：是远距离调节启动子并提高转录效率的一段DNA序列，由多个元件组成，每个元件可与一种或多种转录调控因子结合。6、 沉默子：是远距离调节启动子以降低转录效率的一段DNA序列，是调节基因表达的顺式作用负调控元件。7、 终止子：是为转录提供终止信号的一段DNA序列，是基因表达的顺式作

46、用负调控元件。8、 衰减子：是原核生物基因表达调控的精细调节装置，是基因表达的顺式作用负调控元件。9、 SD序列：是翻译起始密码子（AUG）上游513个核苷酸处的一段富含嘌呤5-UAAGGAGGU-3的全部或其中的一部分序列，在翻译起始阶段与核糖体小亚基16SrRNA的3端相互作用，以正确定位起始密码子。（注：4-9为选择题）10、启动子、增强子起到正调控作用，沉默子、终止子、衰减子起到负调控作用。 （为选择题）二、问答题1、原核生物基因表达与调控的特点：（1） 原核生物基因表达一般以操纵子为单位。操纵子是原核生物基因表达和调控的协同单元，由数个功能相关的结构基因及其调控区组成，调控区主要分为三部分：操纵基因、启动基因及其他由调控功能的序列。（2） 原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。（3） 原核生物无核膜，转录和翻译过程是偶联的。（4） 原核生物基因一般不含内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。（5） 原