蛋白质分离纯化

1、第七章第七章 蛋白质的分离蛋白质的分离 纯化和表征纯化和表征 第一节第一节 蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质 第二节第二节 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 第三节第三节 蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的一般原则 第四节第四节 蛋白质混合物的分离方法蛋白质混合物的分离方法 第五节第五节 蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定 第六节第六节 蛋白质含量的测定与纯度鉴定蛋白质含量的测定与纯度鉴定 第一节第一节 蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质蛋白质是两性电解质，是多价的。蛋白质是两性电解质，是多价的。解离基团解离基团侧链基团（主要），侧链基团（主要）， 末端末端C

2、OOHCOOH和和NHNH3 3 （次要）（次要） 。 蛋白质的等电点（蛋白质的等电点（pIpI） 等离子点等离子点 第二节第二节 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀水化层和双电层水化层和双电层影响蛋白质沉淀的因素影响蛋白质沉淀的因素沉淀蛋白质的方法：沉淀蛋白质的方法： 盐析法盐析法 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法等电点沉淀法 重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法 生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法 加热变性沉淀法加热变性沉淀法 第三节第三节 蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的一般原则纯化的最终目标：增加纯度或比活性，并使产量达纯化的最终

3、目标：增加纯度或比活性，并使产量达到最高值。到最高值。 前处理前处理 粗分级粗分级 1.1.细分级细分级 Basic Principles of Protein PurificationAmmonium sulfate fractionationCellOrganelleHomogenizationMacromoleculeNucleic acidCarbohydrate(Lipid)SizeChargePolarityAffinitySmall moleculeCell DebrisProteinAmino acid, Sugar,Nucleotides, etc Gel filtratio

4、n,SDS-PAGE,UltrafiltrationIon exchange,Chromatofocusing,Disc-PAGE,Isoelectric focusingReverse phasechromatography,HIC,Salting-outAffinitychromatography,HydroxyapatiteJuang RH (2004) BCbasics第四节第四节 蛋白质混合物的分离方法蛋白质混合物的分离方法利用溶液度差别的分离方法利用溶液度差别的分离方法根据分子大小不同的分离方法根据分子大小不同的分离方法根据电荷不同的分离方法根据电荷不同的分离方法 一一 蛋白质与其

5、它化合物的专一或非专一相互蛋白质与其它化合物的专一或非专一相互作用作用利用溶液度差别的分离方法利用溶液度差别的分离方法1.1.等电点沉淀：（等电点沉淀：（isoelectric isoelectric precipitationprecipitation）2. 2. 蛋白质的盐溶和盐析（蛋白质的盐溶和盐析（Salting outSalting out） 3. 3. 有机溶剂分级法：有机溶剂分级法：4. 4. 温度对蛋白质溶解度的影响：温度对蛋白质溶解度的影响：二二. .根据分子大小不同的分离方法根据分子大小不同的分离方法透析（透析（dialysisdialysis）和和 超过滤（超过滤（ult

6、rafiltrationultrafiltration）：密度梯度（区带）离心：密度梯度（区带）离心：1.1. 凝胶过滤层析（分子排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤层析（分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析）凝胶渗透层析） （gel filtrationgel filtration） ： How to Separate These Objects 123910111264857458woodstone cotton wood woodcotton stone wood stone cotton stone cottoncottonwoodstoneShapeSizeDensityShapeDen

7、sitySizeSieving different sizesDifferent sedimentationDifferent rolling speed467 8513467 8 910111225Juang RH (2004) BCbasics透析（透析（dialysisdialysis）UltracentrifugationGel filtration chromatography葡聚糖凝胶过滤葡聚糖凝胶过滤三三. .根据电荷不同的分离方法根据电荷不同的分离方法 离子交换层析：离子交换层析： 电泳：电泳： 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE） 1.1.（等）电聚焦（

8、等）电聚焦（IEFIEF）：）： 离子交换层析离子交换层析SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 增速剂：增速剂：TEMEDTEMED（N,N,N,N-N,N,N,N-四甲基乙二胺）、四甲基乙二胺）、3-3-二甲胺丙腈二甲胺丙腈 引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素 特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径大小大小（等）电聚焦（等）电聚焦（IEFIEF）：）：蛋白质与其它化合物的专一蛋白质与其它化合物的专一 或非专一相互作用或非专一相互作用亲和

9、层析（亲和层析（Affinity chromatographyAffinity chromatography）吸附分离吸附分离 疏水层析疏水层析 Affinity Affinity chromatographychromatographyHigh Pressure Liquid ChromatographyHigh Pressure Liquid Chromatography第五节第五节 蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定方法：方法： 根据化学组成测定最低分子量根据化学组成测定最低分子量 利用凝胶过滤法测定分子量利用凝胶过滤法测定分子量 公式：公式：V Ve eV Vo o = a = ab

10、 logM b logM logM = K logM = K1 1K K2 2V Ve e 利用利用SDSPAGESDSPAGE法测定分子量法测定分子量 公式：公式： logM = K logM = K1 1K K2 2R R 4.4.质谱法质谱法5.5.通过渗透压测定蛋白质分子量通过渗透压测定蛋白质分子量 第六节第六节 蛋白质含量的测定与纯度鉴定蛋白质含量的测定与纯度鉴定 含量：含量： 凯氏定氮法（凯氏定氮法（KjeldahlKjeldahl） 双缩脲法双缩脲法（biuretbiuret） FollinFollin酚法（酚法（LowryLowry） 紫外吸收法紫外吸收法 染料结合法（染料结合

11、法（BradfordBradford） 1.1.BCABCA法：法： ROOOOOOOOHHHHHHHHHHH+NNNNNNNNNCCCCCCCCCCCCCCCCCCOO-RRRRRRRR1Biruet Methods (carbonyl)2Cu+Phosphomolybdic-phosphotungstateCOH.Lowry Methods280 nm(aromatic)Coomassie BrilliantBlue G-N=N-NH-OH-SO3-SO3-SO3-N=N-NH-OH-SO3-SO3-SO3-各各种种蛋蛋白白质质定定量量法法原原理理：各各种种蛋蛋白白质质定定量量法法原原理理：TyrUVAbsorbanceCu2+Cu+34Coomassie Brilliant Blue G-250加入蛋白加入蛋白质质酸性酸性环环境下呈茶色境下呈茶色 CBG 是一种指示剂470 nm595 nm Bradford Method：精 确准确不精不精 确确+不不准确准确280 nm 吸光度Biuret MethodLowry MethodBradfordMet