大肠埃希菌的检测

1、检测意义大肠埃希菌是肠道中存在的正常菌群，故常来源于人和动物的粪便，所以常作为粪便污染的指标。一旦被检药物中查出大肠埃希菌，表明该药品已被粪便污染，可能存在肠道致病菌和寄生虫卵，患者服用该药物后有引起感染的危险。因此，大肠埃希菌被列为重要的卫生指标菌。国家药品卫生标准规定口服药品不得检出大肠埃希菌。中国药典采用了MUGIndole快速测定药品中大肠埃希菌。在MUG试验中，将MUG（4-甲基伞形酮葡糖苷酸）作为目标菌的基本营养物加入培养基中，被大肠埃希菌的-葡萄糖醛酸酶直接分解产物又作为一种指示系统，在366 nm紫外光下呈现兰白色荧光，即MUG阳性；若无荧光，即MUG阴性。靛基质（Indole

2、）试验中，大肠埃希菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 因此根据大肠埃希菌的这一性质，对MUG呈阳性者，再加对-甲氨基苯甲醛试剂数滴，轻摇试管，培养液上层呈现玫瑰红色者(阳性)，报告检出大肠埃希菌。如果两者都为阴性，报告未检出大肠埃希菌。如果一阴一阳，需要进一步的培养和生化试验检查。本方法对大肠埃希菌的检出率达98。培养温度：控制菌培养温度为3035。蒸汽灭菌物品：蒸汽灭菌物品：1.乳糖胆盐发酵培养基试管10支干热灭菌干热灭菌物体：物体：5mL移液管1支1mL移液管5支胨10.0g 硫酸锰0.5mg硫酸锌0

3、.5mg 硫酸镁0.1g氯化钠5.0g 氯化钙50.0mg 磷酸二氢钾0.9g 磷酸氢二钠6.2g亚硫酸钠40.0mg 去氧胆酸钠1.0g MUG 75mg 水1000mL 除MUG外，取上述成分，混合。微温溶解，调节PH7.2-7.4，加入MUG，溶解，每管分装5mL，灭菌。取供试供试液1mL，直接或处理后接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37恒温箱中培养1824 h，进行增菌培养。取上述培养物0.2mL,接种至含5mL MUG培养基的试管内培养，于5小时，24小时在366nm紫外灯光下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性，不呈现荧光，则为M

4、UG阴性。观察后，沿着培养管的管壁加入数滴靛基质试液，叶面呈玫瑰红色，为靛基质阳性，呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。靛基质实验原理靛基质实验原理某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 蛋白胨水琼脂培养基100ml，20%乳糖溶液2ml，2%伊红水溶液2ml，0.5%美蓝水溶液1ml，将已灭菌的蛋白胨水琼脂培养基（pH7.6）加热溶化，冷却至60左右时，再把已灭菌的乳糖溶液，伊红水溶液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入。摇匀后，立即倒平板。乳糖在高温灭菌易被破坏必须严格控制灭菌

5、温度，115灭菌20min。1.MUG1.MUG、靛基质结果判断、靛基质结果判断MUG培养结果：在366nm紫外线下观察靛基质结果：液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试液本色，为靛基质阴性MUG阳性、靛基质阳性，判检出大肠杆菌； MUG阴性、靛基质阴性，判未检出大肠杆菌；MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性，需进一步做以下检查2 2。EMBEMB培养结果判断培养结果判断EMB培养18-24h后，检查有无疑似大肠埃希菌菌落（大肠埃希菌落形态特征见表），若无，判供试品未检出大肠埃希菌；若有，进一步做以下试验大肠埃希菌落形态特征培养基培养基菌落形态菌落形态EMBEMB呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，微突起，边缘整齐，表中心，圆形，微突起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有面光滑，湿润，常有金属光泽金属光泽。检验依据： 2010年版中国药典二部附录J 微生物限度检查法检验标准规定：口服制剂细菌数1g不得超过1000个；1ml不得超过100个。霉菌及酵母菌数1g不得超过100个。控制菌1g（1ml）不得检出大肠埃希菌。1实训过程要严格无菌操作。2供试液稀释及注入培养皿时应摇匀再取，供试液从制备至加入培养基不得超过1h.3配制MUG培养基时，务必调pH，否则pH偏高，MUG分解，本