第十章细胞增殖及其调控

1、l细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一。l细胞增殖是生物繁育的基础。l成体生物仍然需要细胞增殖，以弥补代谢过程中的细胞损失。l细胞增殖受到严密的调控机制所监控。 一一 细胞周期与细胞分裂细胞周期与细胞分裂 二二 细胞周期调控细胞周期调控（一）（一）细胞周期概述细胞周期概述（二）（二）有丝分裂有丝分裂（三）（三）减数分裂减数分裂1 细胞周期2 G0期细胞3 细胞周期检验点4 细胞周期研究中常用的细胞l从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累过程，直到下一次细胞分裂结束为止，称为一个细胞周期 （cell cycle）。l细胞沿着G1SG2MG1周期性运转，在间期细胞体积增大(生长)，在 M 期细胞 先

2、是核分裂，接着胞质分裂，完成一个细胞周期。根据增殖状况，细胞分类三类 1）连续分裂细胞(cycling cell) 2）休眠细胞(Go期细胞) 3）终末分化细胞细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制，主要是确保周期每一时相事件的有序、全部完成并与外界环境因素相联系。1）G1期检验点 酵母Start； 动物细胞Restriction Point2）G2/M 检验点细胞周期检验点及其作用R点：点：在G1期的晚期阶段有一个特定时期，如果细胞继续走向 分裂，则可以通过这个特定时期，进入S期，开始合成 DNA, 并继续前进，直到完成细胞分裂。在芽殖酵母 中，个特定时期被称为起始点。在其他真核细胞中，这

3、一特定时期称为限制点（R点），或检验点。G2/M 检验点：检验点：在S期，DNA复制完成后，细胞即进入G2期。 通过G2期后，细胞即进入M期。但细胞能否顺利地进入 M期，要受到G2期检验点的控制。G2期检验点要检查 DNA是否完成复制，细胞是否已生长到合适大小，环境 因素是否利于细胞分裂等。只有当所有有利于细胞分裂 的因素得到满足后，细胞才能顺利实现从G2期向M期的 转化。 （1）HeLa 细胞（2）非洲爪蟾卵细胞（3）酵母细胞l目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的黑人妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。HeL

4、a细胞是有关哺乳类尤其是人类细胞生物学实验研究的基本材料。l非洲爪蟾的卵母细胞体积大（直径约1mm）、数量多, 易于显微操作, 还可制成具有生物活性的无细胞体系, 易于生化分析, 在发育生物学和细胞生物学研究中具有不可替代的作用。l非洲爪蟾的卵母细胞发育过程可以分为6个阶段，即、和期。第至期为卵母细胞生成和生长阶段。在这段时期内，卵细胞积累了大量的营养物质，基本可以满足早期胚胎发育的物质需求。第期卵母细胞达到一定体积，停止生长，等待成熟。此时的卵母细胞处于第一次减数分裂期前期阶段，含有一个体积较大的细胞核，称为生发泡。卵母细胞成熟需要雌性激素孕酮的刺激。在孕酮作用下，卵母细胞向和期转化，生发泡

5、破裂，染色体凝集，进行第一次减数分裂，然后立即进行第二次减数分裂，并停留在分裂中期，即为成熟的卵母细胞（第期卵细胞）。卵细胞受精后，形成受精卵，很快开始卵裂。酵母细胞的细胞周期与标准的细胞周期相似，也包括G1期、S期、G2期和M期等4个时期。而且参与细胞周期调控的基因与高等生物的也基本相同。酵母细胞周期至少有下面三个特点： 1） 酵母细胞周期持续时间较短，大约为90min。 2） 和许多单细胞生物一样，细胞分裂过程属于封闭式，即 在细胞分裂时，细胞核核膜不解聚，与细胞核分裂直接相关的纺缍体不是在细胞质中，而是位于细胞核内。 3） 在一定的环境因素下，酵母细胞也可进行有性繁殖。进行细胞周期调控研

6、究的酵母主要包括两种，即芽殖酵母和裂殖酵母。 l芽殖酵母以出芽方式进行分裂，因而很易在生活状态下观察细胞周期进程。l细胞在G1期呈卵圆型，l含有一个细胞核，基因组为单倍体。细胞周期起始点位于G1期的后期阶段。起始点过后，细胞马上开始出芽。细胞出芽后，很快便进入S期，开始DNA复制，同时，纺缍体开始装配。酵母的纺缍体装配与S期DNA提制同时进行，而不是在DNA复制之后。l细胞分裂为不等分裂，即生成的两个细胞体积不等，以芽体逐渐形成的子细胞体积较小。lG1期裂殖酵母细胞为短棒状。与芽殖酵母相比，其细胞周期的特点是：l1) 分裂起始点无明显的形态学标志。l2) 细胞分裂为均等分裂。l3) 细胞生长仅

7、是细胞长度的增加，细胞直径l 保持不变。1 与有丝分裂直接与有丝分裂直接相关的亚细胞结构相关的亚细胞结构2 有丝分裂过程中有丝分裂过程中染色体分离的动力机制染色体分离的动力机制1) 中心体中心体2) 动粒动粒3) 纺缍体纺缍体l中心体是一种与微管装配和细胞分裂密切相关的细胞器。l在间期细胞中，微管围绕中心体装配，如同星光向四周辐射，因而，中心体与四射的微管合称为星体。l中心体在G1期末开始复制，到S期时，细胞中已经含有一对中心体。等到G2期，一对中心体开始分离，并各自向细胞的两极移动，参与装配纺缍体。l每条中期染色体上含有两个动粒，分别位于着丝粒的两侧。细胞分裂后，两个动粒分别被分配到两个子细

8、胞中。当细胞再次进入S期后，动粒又会重新复制。l染色体依靠动粒捕捉由纺缍体极体发出的微管。没有动粒的染色体不能与纺缍体微管发生联系，也不能和其它染色体一起向两极运动。l组成纺缍体的微管可以分为三种类型： 动粒微管：正极与动粒相连，负责将染色体牵引到纺锤体上，其上具有动 力蛋白； 极微管： 正极于赤道面处相互搭桥而重叠，重叠部位结合有驱动蛋白， 负责将两极推开； 星体微管：由中心体向外放射出，末端结合有动力蛋白，负责两极的分 离，同时确定纺锤体纵轴的方向。 纺缍体的形成及两极的动运： 中心体分离时，负向（）运动的动力蛋白在来自姐妹中心体的微管之间搭桥，通过向负极运动，将被结合的微管牵拉在一起，组

9、成纺缍体微管，此时中心体也自然形成了纺缍体的两极。这一过程称为中心体列队。 正向（）运动的驱动蛋白在纺缍体微管之间搭桥，借助向微管正极运动，将纺缍体拉长，中心体之间的距离逐渐加大。当纺缍体拉长到一定程度后， 负向运动的动力蛋白在细胞膜和星体微管之间搭桥，借助负向运动，将星体拉近两极的细胞膜，纺缍体也进一步被拉长。1）染色体列队染色体列队2）染色体分离染色体分离l染色体列队是指染色体排列在赤道面上的过程，是有丝分裂中的重要事件之一，也是启动染色体分离并向两个子细胞中平均分配的先决条件。研究发现，至少有数种蛋白质与染色体列队直接相关，其中首要的两组蛋白质称为Mad蛋白和Bub蛋白。Mad蛋白和Bu

10、b蛋白可以使动粒敏化，促使微管与动粒接触。l当染色体上的两个动粒被微管捕捉后，动粒微管的牵拉或星体对染色体的外推最终将染色体排列在赤道上。l当染色体排列到赤道板上后，染色单体分离并开始向两极移动。关于运动的机制，目前认为分后期A和后期B两个阶段。l后期A：微管动力蛋白首先结合到动粒上，由ATP提供能量，沿动粒微管向负极部即（）极运动，并带动动粒和染色单体向极部运动，动粒微管末端随之降解。当染色单体接近两极，后期A结束。l后期B：极微管加长，形成较宽的极微管重叠区。驱动蛋白与重叠区微管结合并向微管正极行走，使重叠区逐渐变狭窄，两极之间的距离逐渐变长。同时，胞质动力蛋白在星体微管和细胞膜之间搭桥，

11、并向星体微管负极运动，进一步将两极之间的距离拉长。从而最终将染色体拉向两极。1 联会与联会复合体联会与联会复合体2 Z-DNA和和P-DNAl在减数分裂前期的偶线期，同源染色体配对的过程称为联会。联会初期，同源染色体端粒与核膜相连的接触斑相互靠近并结合。从端粒处开始，这种结合不断向其它部位延伸，直到整对同源染色体的侧面紧密联会。l在联会的部位形成一种特殊复合结构，称为联会复合体（synaptonemal complex, SC)。联会复合体沿同源染色体长轴分布，宽约1.52m，由位于中间的中央成分和位于两侧的侧成分共同构成。侧成分的外侧为配对的同源染色体。在SC的中央区域有时会出现一些棒状的重

12、组结，结构及功能不清楚。lSC于偶线期开始形成，与偶线期DNA(Zyg-DNA)的合成有关，成熟于粗线期，并存在数天，消失于双线期。现在一般认为SC的形成晚于基因重组的启动，与同源染色体间交换的完成有关。 l减数分裂的偶线期，会合成在S期未合成的约0.3的DNA。这些DNA称为偶线期DNA或Z-DNA。Z-DNA偶线期转录活跃，被认为与同源染色体配对有关。l而在粗线期，也合成一小部分尚未合成的DNA，称为P-DNA。P-DNA编码一些与DNA点切和修复有关的酶类。（一）细胞周期调控研究概况 （2001年生理学诺奖）；（二）MPF复合物的发现；（三）细胞分裂周期调控基因cdc；（四）周期蛋白(c

13、yclin)；（五）周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK；（六）细胞周期运转调控。1 Leland Hartwell ( 利兰哈特韦尔， 美国西雅图的弗雷德 哈钦森癌症研究中心, 以芽殖酵母为材料因发现了控制细胞周期的一类特异基因而受奖。其中一个叫“启动器”（start）的基因（基因cdc28）对控制每个细胞周期的初始阶段具有主要作用。哈特韦尔还引入了一个概念“检验点”（checkpoint)。2 Paul Nurse（保罗纳斯，在英国帝国癌症研究基金工作，以裂殖酵母为实验材料克隆并阐述了细胞周期的一个关键调节物质细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）（基因c

14、dc2）。他发现CDK的功能在进化中被很好的保存了下来。CDK通过对其它蛋白质的磷酸化来驱动细胞周期运转。 3 Timothy Hunt ( 蒂莫西亨特)， 在英国帝国癌症研究基金工作，他的贡献是从海胆卵中发现了细胞周期蛋白（cyclins）（一类调节CDK功能的蛋白质)。 以两栖类卵母细胞及哺乳类培养细胞为材料发现了MPF。 以芽殖酵母和裂殖酵母为研究对象发现了周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK。 以海胆卵细胞为研究对象发现了细胞周期蛋白cyclin 。 多年来，在上述三个领域的研究中，互相之间并没有联系起来，直到1988年，M. J. Lohka（日本人） 纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由p32和p

15、45两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。后来Paul Nurse（1990）进一步的实验证明p32实际上是CDC2的同源物，而p45是cyclinB的同源物，从而最终将细胞周期三个领域的研究联系在一起。即MPF由p34cdc2(cdc2基因的产物)和周期蛋白B(cyclinB， cdc13的产物)组成。1 1960s，Yoshio Masui（日本人）发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的生发泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown，GVBD)，证明成熟蛙卵中有促使染色体凝集的物质。2 1970年，Colorado (美国西部的科罗拉多州)大学的 R.T. Johns

16、on和P.N. Rao (日本人) 将M期的Hela细胞与其他种类的间期细胞融合。发现不同时期的间期细胞（如G1、S、G2期细胞）产生了形态各异的早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)，这种现象叫做早熟染色体凝集(premature chromosome condensation)。M期细胞可以诱导PCC，后来的大量实验证实，诱导PCC没有种族屏障。 （Johnson RT, Rao PN. Mammalian cell fusion: induction of premature chromosome condensation in int

17、erphase nuclei. Nature, 1970,226: 717-792.）3 1971年，Masui（日本人）和Markert用孕酮处理未成熟的非洲爪蟾卵母细胞令其成熟，然后将其胞质显微注射到另一个未成熟的卵母细胞中，结果导致后者成熟，而诱导成熟的卵母细胞的胞质又可使第三个未成熟的卵母细胞成熟。他们将此种活性因子称为成熟促进因子或M期促进因子。从而明确提出了MPF概念。 1960s， 华盛顿大学的Leland Hartwell（哈特韦尔哈特韦尔）以芽殖酵母为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(cel

18、l division cycle gene，cdc)。如芽殖酵母的cdc28基因的突变使细胞停留在晚G1期DNA复制前的“start”位点，而且在G2/M转换点也发挥重要功能。Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念（因为DNA受到损伤后，细胞不能通过G2/M检验点）。 1970s， Paul Nurse（纳斯纳斯）等人以裂殖酵母为实验材料，同样发现了许多细胞周期调控基因，如：裂殖酵母cdc2、cdc25的突变型和在限制的温度下无法分裂；进一步的研究发现cdc2和cdc28序列有69的同源性，都可编码一个34KD的丝氨酸/苏氨酸蛋

19、白激酶。cdc2的蛋白称为p34 cdc2，cdc28的蛋白称为p34 cdc28，前者在裂殖酵母细胞周期调控中起着关键性的作用，而后者在芽殖酵母细胞周期调控中起着关键性的作用。进一步的研究发现，不管是cdc2，或是cdc28，其本身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白(p56cdc13)结合后，其激酶活性才能表现出来。 1987年，Paul Nurse（纳斯纳斯）又从人类细胞中分离到了cdc2的同源物。l1983年，英国Timothy Hunt（亨特亨特）首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，下轮间

20、期又重新合成，故命名为周期蛋白(cyclin)。根据它们序列上的细微差别分别称为cyclinA和cyclinB。后来证明，这两种蛋白广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中。进一步研究证明，周期蛋白为诱导细胞进入M斯所必需。而且，各种生物之间的周期蛋白在功能上有着广泛的互补性。l周期蛋白的类型、分子特征及降解l到目前为止，人们已经从不同物种中发现了多种周期蛋白，分别在细胞的不同分裂时期起调控作用。1 裂殖酵母中的周期蛋白：Cdc13、Cig1和Cig2等。2 芽殖酵母的周期蛋白：Cln1、Cln2、Cln2、Clb1、Clb2、Clb3、Clb4、Clb5和Clb6等。3 高等动物的周期蛋白：A

21、、B、C、D、E、F、G和H等。1 周期蛋白框 由100个左右的氨基酸残基组成，可介导周期蛋 白与CDK的结合。 2 破坏框序列 M期周期蛋白分子的近N端含有一段称为破坏框的 序列。破坏框主要参与由泛素介导的周期蛋白A和 B的降解。G1期周期蛋白分子中不含破坏框，但C 端含有一段特殊的PEST序列与其降解有关。 l周期蛋白在分裂后期开始降解，这一过程通过泛素化降解途径来实现，泛素连接到周期蛋白上需要三种不同酶的参与：E1、E2和E3： E1（泛素活化酶）的半胱氨酸残基与泛素的COOH端连接而活化泛素。 E1 将泛素交给E2（泛素缀合酶）。 E2 和E3（泛素连接酶）一起将泛素转移到周期蛋白的赖

22、氨酸残基上使其泛素化。多泛素化的周期蛋白作为蛋白酶体的降解底物被很快降解。 E3是一种多亚基的复合物，至少有8种组分，又称促后期复合物（anaphase-promoting complex, APC)。APC激发E2-泛素复合物同周期蛋白破坏框结合，然后激发泛素同破坏框C端的赖氨酸残基结合，此过程不断循环使周期蛋白多泛素化而最终被降解。 分裂中期MPF可以磷酸化APC而使其激活，G1期的后期APC被磷酸酶水解而失活。l从酵母中分离到的细胞分裂周期基因cdc2和cdc28，其编码的蛋白其实是一类周期蛋白依赖性蛋白激酶。属于丝氨酸/ 酪氨酸类激酶。后来又从其它生物中分离出了许多它们的同源物。其共同

23、特点是：l 都含一段PSTAIRE的保守序列，可能与周期蛋白的结合有关。l 都可以和周期蛋白结合，并将周期蛋白作为它的调节亚基，从而l 表现出蛋白激酶活性。 因此，被统称为周期蛋白依赖性蛋白激l 酶，简称CDK。l至今人们已发现并命名了多种CDK激酶，包括Cdc2、CDK2、 CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7和CDK8等。由于Cdc2第一个被发现，所以命名为CDK1。lCDK的含量一般在细胞周期循环中变化不大，而其活性的调节单位周期蛋白的含量则随细胞周期进程而周期性的改变，从而达到细胞周期的调控作用。MPF，即卵细胞促成熟因子（maturation-promoting fact

24、or, MPF） 细胞促分裂因子（mitosis-promoting factor,MPF） M期促进因子（M phase-promoting factor,MPF）。可以促使卵细胞成熟，促进细胞进入分裂期。现在知道，MPF主要含有CDC2蛋白（基因cdc2的产物，或称为p34cdc2）和周期蛋白B(cdc13的产物，即cyclinB)。p34cdc2为其催化亚单位，周期蛋白为其调节亚单位。两者结合后，p34cdc2表现出蛋白激酶活性。MPF在G2期磷酸化一系列的底物，涉及染色体凝集，细胞核解体，细胞骨架崩解等一系列过程，从而使细胞进入分裂期。即：MPF=CDK1=p34cdc2+cyclin

25、B1 磷酸化相关蛋白，使染色质凝集；2 磷酸化核纤层蛋白，使核膜解体；3 使高尔基体和内质网片段化；4 使微管重排，促进纺缍体的形成。现已公认，CDK激酶对细胞周期起着核心调控作用，但CDK的活性除与周期蛋白直接有关外，细胞内多种因子通过对其分子内一些重要位点的磷酸化而进一步的调节。 p21蛋白主要对G1期的CDK2、 CDK3、 CDK4和 CDK6起抑制作用，而且还可以直接与PCNA结合抑制DNA的复制。lE2F是一细胞转录因子，最初是作为腺病毒E2基因转录激活因子发现的。数种参与细胞增殖的基因在它们的启动子区域皆有E2F结合位点，包括周期蛋白A、D1以及DNA聚合酶等一系列DNA复制相关

26、蛋白的基因。lRb是视网膜母细胞瘤基因的表达产物，Rb基因是一种抑癌基因，Rb蛋白的主要作用是调节细胞周期活动和维持细胞的正常生长。l在G1期，E2F与Rb结合， E2F的活性被阻抑，这时具有蛋白激酶活性的CDK-cyclinE或CDK-cyclinA复合物磷酸化Rb蛋白而释放出E2F，E2F再促使细胞增殖有关的一系列基因转录，从而使细胞越过G1/S检验点进入分裂期。l可见，E2F与Rb的分离则触发E2F的活化并引起细胞分裂增殖，而这个过程由相关的周期蛋白依赖性激酶CDK。p53蛋白是肿瘤抑制因子（也称促衰老蛋白），即阻止细胞分裂。因此，p53基因是抑瘤基因。p53蛋白的表达在平时处于较低水平

27、，当细胞感觉到DNA受到损伤时，p53的表达水平就会上升并阻止细胞分裂直至DNA损伤被修复。或者，当损伤太严重时，p53就会启动程序性细胞死亡的过程（或细胞凋亡），这种过程可以使细胞自我消亡，永远的除去损伤。 p53分子阻断细胞周期其实就是引起生长抑制，这主要是依赖于它的序列特异性的转录激活功能。p21就能为p53蛋白转录激活，它直接结合在Cyclin/cdk复合体上，即抑制cyclinE/cdk2、cyclinD1/cdk4和yclinA/cdk2等激酶活性，从而引起细胞停留在G1期。p21还可与核增殖抗原相关，进而直接抑制DNA复制。此外，p53分子还能以一种不依赖于p21方式引发生长抑制

28、。细胞由一次分裂末期到下一次分裂末期的历程称为细胞周期。周期中的细胞在正常情况下，沿着G1SG2M的路线运转，通过M期细胞一分为二，成为两个子细胞。在细胞周期中，存在三个关键的时相转换点，一个在G1期与S期之间；一个在G2期与M期之间；还有一个是分裂中期向后期的过渡时期。细胞能否顺利越过这三个检验点，直接关系到细胞能否正常进入细胞周期循环。而调控这一过程的关键因素是CDK与不同周期蛋白的结合、分离、磷酸化与去磷酸化等过程。 1 由G1S 的转化 2 由G2M 的转化 3 分裂中期向后期的转化1) 在芽殖酵母中，CDK(cdc28基因的产物p34cdc28)与CLN（芽裂酵母G1期周期蛋白）结合

29、成为具有激酶活性的复合物，早G1期时，由于CLN数量少（CDK主要与CLN3结合），此复合物激酶的活性低，而这一复合物可进一步激活G1期周期蛋白基因，使产生大量的CLN（包括CLN1和CLN2），大量的CLN与p34cdc2结合产生活性很强的复合物，称为促S期激活因子（SPF）。由SPF促进细胞越过R点进入S期。l在芽殖酵母中，G1S 的转化是其周期调控最主要的控制点。2) 在高等动物细胞中，G1期时，分裂相关蛋白的转录因子E2F和Rb相结合，不能自由活动。这时复合物CDK4/6+cyclinD（早G1期时）以及CDK2+cyclinE（晚G1期时）磷酸化Rb使之释放出E2F，这时自由的E2F

30、和G1期周期蛋白以及CDK一起形成SPF。然后通过E2F与DNA特异序列结合，从而诱导细胞分裂相关基因转录使细胞由G1期进入S期。l在G1期，如果G1周期蛋白量少，则与CDK结合产生的复合物激酶活性低，则不能使Rb磷酸化而释放E2F，这样细胞不会由G1期进入S期。 l在裂殖酵母中，CDK1（cdc2基因产物p34cdc2）与Cdc13蛋白（cyclinB的同源物）结合首先形成无活性的MPF, 因为，MPF中的Cdc2蛋白上的第14（Thr14）和第15(Tyr15)以及第161(Thr161)位上的三个氨基酸残基分别被一种称为Weel的激酶和Cdc2蛋白活化激酶CAK磷酸化。这种没有活性的MPF称为前MPF。前MPF可以被一种具有磷酸酶活性的