第8章重组子鉴定与筛选

1、第第8章章 重组体鉴定与文库筛选重组体鉴定与文库筛选1. 遗传检测筛选法遗传检测筛选法2. 限制酶切分析限制酶切分析/电泳电泳3. PCR扩增检测法扩增检测法4. 核酸杂交检测法核酸杂交检测法 5. 免疫化学检测法免疫化学检测法 6. 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 7. 体外表达筛选技术（体外表达筛选技术（ 转译筛选法）转译筛选法） n借助抗药性标记基因筛选：如借助抗药性标记基因筛选：如 tet, blan组织化学法筛选：如组织化学法筛选：如lacZ, gusA等等n致死基因插入失活致死基因插入失活: 如如sacB等等n其他标记基因其他标记基因 ：营养缺陷互补基因、：营养缺陷互补基因、spi等

2、等1. 遗传检测筛选法遗传检测筛选法2.限制酶切分析限制酶切分析+电泳电泳插入片段的重组载体的分子量比空载体分子量大。插入片段的重组载体的分子量比空载体分子量大。u单一位点酶切：单一位点酶切：1个片段个片段u 2位点酶切：位点酶切：2个片段（一般选择克隆位点）个片段（一般选择克隆位点）u 测序鉴定测序鉴定从转化后的菌体克隆中提取从转化后的菌体克隆中提取质粒，酶切后电泳、比较酶质粒，酶切后电泳、比较酶切片段的分子量大小。切片段的分子量大小。Marker空载体空载体外源外源片段片段3kb2kb4kb重组重组载体载体重组重组载体载体2.6kb载体+1.4kb外源片段3. PCR扩增检测法扩增检测法原

3、理：原理：设计引物扩增外源片段，如果能在模板序列上扩增出设计引物扩增外源片段，如果能在模板序列上扩增出预期预期DNA片段，表明外源片段插入载体或基因组片段，表明外源片段插入载体或基因组l 从重组克隆中提取质粒（或从重组克隆中提取质粒（或DNA）l 用外源用外源DNA插入片段引物作插入片段引物作PCRl 电泳电泳PCR产物。产物。l 检查是否有检查是否有PCR产物。产物。l PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。染色体染色体ACTTTGACTCCATGAAACGACTTTGACTCCATGAAACTmarker(1).非探针杂交非探针杂交 异源双链杂交，异源双链杂交，

4、 R-环杂交环杂交4. 核酸杂交检测法核酸杂交检测法核酸探针：用放射性同位素或荧光基团标记的单链核酸核酸探针：用放射性同位素或荧光基团标记的单链核酸(2). 探针杂交探针杂交（用于文库筛选，见基因操作基本技术）（用于文库筛选，见基因操作基本技术）Southern blottingNorthern blotting斑点杂交斑点杂交原位杂交原位杂交一条一条DNADNA异源双链除了异源双链除了单个碱基错配单个碱基错配外其余碱基对配对正常，外其余碱基对配对正常，DNADNA骨架会出骨架会出现突起现突起, ,从而错配的碱基可能会旋入从而错配的碱基可能会旋入DNADNA双螺旋沟槽中，或者旋到螺旋的外双螺旋

5、沟槽中，或者旋到螺旋的外部，或者部，或者DNADNA双链可能会在异源双链处发生曲折。因此，在非变性凝胶中电双链可能会在异源双链处发生曲折。因此，在非变性凝胶中电泳时，具有错配的双链要比没有错的双链移动得慢，从而将突变检出。泳时，具有错配的双链要比没有错的双链移动得慢，从而将突变检出。 异源双链杂交（异源双链杂交（HA）如有如有片段缺失或插入片段缺失或插入，杂交后还可用电镜直接观察是否有环形的不配对部分，杂交后还可用电镜直接观察是否有环形的不配对部分R-环检测环检测在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，加入双链变性，复性的时候，加入作为检测序列的作为检测序列的RNA分子，

6、如果分子，如果DNA中有与中有与RNA互补的互补的序列，则由于序列，则由于DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳双链更稳定而使互补序列的定而使互补序列的DNA单链被置换出来，形成非常稳定单链被置换出来，形成非常稳定的的R-环结构，电镜下可见。环结构，电镜下可见。利用标记的抗体作为利用标记的抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌并且表达来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。出相应的蛋白质的外源基因。5. 免疫化学检测法免疫化学检测法 对表达产物的检测。蛋白对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白“杂交杂交”放射免疫测定技术放射免疫测定技术(radioimmunoassay，RI

7、A):用竞争性结合的原理，应用竞争性结合的原理，应用放射性同位素标记抗原用放射性同位素标记抗原(或抗体或抗体)，与相应抗体，与相应抗体(或抗原或抗原)结合，通过原结合，通过原位杂交确定表达抗原或抗体的克隆，也可通过测定抗原位杂交确定表达抗原或抗体的克隆，也可通过测定抗原-抗体结合物的抗体结合物的放射强度确定待测物的浓度。常用于标记的放射性核素有放射强度确定待测物的浓度。常用于标记的放射性核素有125I，131I，3H 放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程原理同放射性抗体检测，只是用酶标记来代替放射性核素标记，原理同放射性抗体检测，只是用酶标记来代替放射性核素标记， 常用常用酶：辣根过氧化物

8、酶（酶：辣根过氧化物酶（HPR)，碱性磷酸酶等，需要用酶的底物来处理抗，碱性磷酸酶等，需要用酶的底物来处理抗原原-抗体结合样品（或膜），如：酶催过程发光，用底片曝光检测。抗体结合样品（或膜），如：酶催过程发光，用底片曝光检测。Ab-E+ AgAb-E-Ag+Ab-E 在抗原反应后，需要先把结合的标记物与游离的标记物在抗原反应后，需要先把结合的标记物与游离的标记物分离分离，然后，然后测定结合测定结合 的标记物（或游离标记物）的量，从而推算出标本中的抗原的标记物（或游离标记物）的量，从而推算出标本中的抗原量，这种方法称为量，这种方法称为异相法异相法。 在抗原抗体反应后，结合的标记物失去活力，在抗原

9、抗体反应后，结合的标记物失去活力，不需要分离不需要分离结合的标结合的标记物和游离的标记物就可以测定记物和游离的标记物就可以测定Ag含量，这种方法称为含量，这种方法称为均相法均相法。常用的免疫酶测定法为固相酶免疫测定。其特点是将抗原或抗体制常用的免疫酶测定法为固相酶免疫测定。其特点是将抗原或抗体制成固相制剂，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤，成固相制剂，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤，这种技术被称为这种技术被称为EL1SA （enzym

10、e linked immunosorbent assay,酶联免疫酶联免疫吸附试验吸附试验)，属于异相法。，属于异相法。ELISA检测的一般步骤检测的一般步骤（1）固定样品）固定样品将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板（孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中）的孔中(含有聚苯乙烯固相载体，非特异性吸附抗原或抗体），干含有聚苯乙烯固相载体，非特异性吸附抗原或抗体），干燥后就被固定在孔底。燥后就被固定在孔底。孔底孔底抗原分子表面与抗体特异性结合的化学基团称为抗原分子表面与抗体特异性结合的化学基团称为抗原决定簇抗原决定簇 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。加入一抗，反应后冲

11、洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合）一抗结合一抗一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗二抗上联着酶标（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）只二抗上联着酶标（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）只识别一抗。识别一抗。（3）二抗结合）二抗结合二抗二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。质（或发光）。（4）显色反应）显色反应在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。（5）比色）比色5.4 免疫印迹（免疫印迹（w

12、estern blotting）技术）技术在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。白质泳带。（见基因工程基本技术）（见基因工程基本技术）5.5 免疫沉淀检测法免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体发生抗原被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体发生抗原-抗体凝集反抗体凝集反应而形成应而形成“沉淀圈沉淀圈”。对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、

13、原噬菌体诱发）。（溶菌酶、原噬菌体诱发）。5. 6 Broome-Gilbert双位点检测法双位点检测法质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达融合蛋白表达融合蛋白质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B用于检测融合蛋白。用于检测融合蛋白。固相支持物固相支持物滤膜滤膜抗抗A抗体抗体标记的标记的抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B5.7 其他免疫化学检测技术其他免疫化学检测技术 金（金属离子免疫）标记、电化学发光免疫分析等金（金属离子免疫）标记、电化学发光免疫分析等 酵母双杂交由酵母双杂交由Fields在在1989年提出，其产生是基于对真核细胞转年提出，其产生是基于对真核细胞转录因子（

14、酵母转录因子录因子（酵母转录因子GAL4）性质的研究：）性质的研究：uGAL4包括两个结构域，位于包括两个结构域，位于N端端1-147位氨基酸残基区段的位氨基酸残基区段的DNA结合域（结合域（DNA binding domain，DBD）和位于）和位于C端端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域（位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain,AD).uDBD能够识别位于能够识别位于GAL4响应基因（响应基因（GAL4-responsive gene）的上游激活序列的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之，并与之结合结合

15、. uAD则是通过与转录机器中的其他成分之间的结合作用，以启则是通过与转录机器中的其他成分之间的结合作用，以启动动UAS下游的基因进行转录下游的基因进行转录. uDNA-BD和和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在者在空间上充分接近空间上充分接近时，则呈现完整的时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并转录因子活性并可激活可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录下游启动子，使启动子下游基因得到转录. 6. 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 Fields建立了一个双杂交系统：建立了一个双杂交系统：uDBD与与X蛋白融合，蛋白融合，AD与与Y蛋白

16、融合，蛋白融合，如果如果X、Y之间形成蛋白之间形成蛋白-蛋白复合物，蛋白复合物，使使GAL4两个游离的结构域重新在空间两个游离的结构域重新在空间上接近，则会启动特定基因（报告基因）上接近，则会启动特定基因（报告基因）的转录的转录u 一般将一般将DBD-X的融合蛋白称作诱饵的融合蛋白称作诱饵,X往往是已知蛋白，往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物，能称作猎物，能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因，通过对报告基因表达与否的检测，基因，通过对报告基因表达与否的检测，可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用用. Y蛋白编码基因可以是基因文

17、库，可以从文库中筛选到能蛋白编码基因可以是基因文库，可以从文库中筛选到能和特定的和特定的X蛋白发生相互作用的蛋白及其编码基因蛋白发生相互作用的蛋白及其编码基因酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：u作用信号是在融合基因表达后，作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出在细胞内重建转录因子的作用而给出的，的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。u检测在活细胞内进行，检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。u检测的结果可以是基因表达产物的

18、积累效应，检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。质之间的微弱的或暂时的相互作用。u酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建建cDNA文库，文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位的功能蛋白。胞部位的功能蛋白。缺点：缺点：n许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，另许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖

19、于其他非酵母蛋白的辅助，这些相互外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这些相互作用无法检测作用无法检测n假阳性：某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激假阳性：某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，活作用， 另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与能与其他蛋白形成稳定的复合物，其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达，从而引起报告基因的表达， 产生产生假阳性假阳性结果。结果。 7. 体外表达筛选技术（体外表达筛选技术（ 转译筛选法）转译筛选法） 体外表达技术：体外表达技术：借助无细胞核或基因组的转录和翻译系统，借助无细胞核或基因组的转录和翻译系统，实现特定基因的转录、翻译和检测。常用于体内表达困难的实现特定基因的转录、翻译和检测。常用于体内表达困难的蛋白质（毒性或易降解）的表达。蛋白质（毒性或易降解）的表达。其