发酵提取工艺基础知识-王静

1、发酵液提取工艺基础知识预处理菌体分离菌体破碎细胞碎片分离初步纯化收集上清液浓缩精制成品加工发酵液由于所需的产品在培养液和菌体中浓度很低，并与许多杂质夹杂在一起，所以必须进行预处理。发酵液预处理的原因预处理的目的：改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率；尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）；去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步操作。预处理常用方法：加热法助滤剂上的吸附凝聚和絮凝加热最简单、最经济的预处理方法是加热，加热不仅可以增加料液的操作特性，也可以对其进行灭菌。但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。助滤剂上的吸附在过滤操作中，为了降低过滤

2、阻力，增加过滤速率或得到高度澄清的滤液所加入的一种辅助性的粉粒状物质，称为助滤剂。常用的助滤剂有硅藻土、纸粕、活性炭、金属屑和炉渣等。硅藻土具有很大的比表面积，能吸附胶体物质，并形成空隙率很高的滤饼，是应用最广泛的助滤剂。纸粕多用作预涂层，可防止滤布的早期堵塞。助滤剂只用于以获得清净滤液为目的的过滤操作。凝聚和絮凝凝聚：胶体粒子(10-100nm)中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）机理：a 中和粒子表面电荷 b 消除双电层结构絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程机理：架桥作用凝聚和絮凝通过电解质的加入促进原始溶液的凝聚和絮凝，试剂有简单的电解质、酸、碱、合成的聚合

3、电解质。简单电解质降低了胶体粒子间的排斥电位，从而使得范德华引力起主导作用，聚合成较大的胶粒，粒子的密度越大，越易分离。预处理时加入合成聚合电解质既能降低排斥电位，又吸附了周围的微粒，形成桥架作用，促使胶粒形成粗大，密度低的絮凝团。这些絮凝团很容易被过滤得到。常用絮凝剂聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物，根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等。天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、骨胶、海藻酸钠等。微生物絮凝剂是近年来研

4、究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。菌体分离主要采用过滤和离心两种方法。 当发酵液不易被过滤纯化时，我们可以采用离心的方法来分离， 与过滤设备相比，离心设备的价格昂贵。但当固体颗粒细小而难以过滤时，离心操作往显得十分有效。 过滤是将料液通过固体支持或者过滤介质时，使得固体物质从溶液中分离，对于好定形的晶体，这是一种最直接的步骤。滤饼滤饼过滤方法和设备n常压过滤 过滤器：玻璃漏斗、搪瓷漏斗、金属夹层保温漏斗 过滤介质：滤纸或脱脂棉

5、n减压过滤 过滤器：布氏漏斗（多用于非黏稠性料液和含不可压缩性 滤渣的料液） 过滤介质：滤纸n加压过滤 压滤器 工作原理：用加压或者减压的方法将料液压入滤器内，通过包有滤布或滤纸的多孔性空心钢柱。固体被截留在柱外滤材上，滤液经柱内自滤器上端压出 。n板框过滤机 工作原理：滤浆由机头（封头）进入，经滤过介质，由滤液流出口排出。过滤设备从传统的板框式过滤机到旋转式真空过滤设备，种类很多。 当发酵液不易被过滤纯化时，我们可以采用离心的方法来分离。 离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程，当静置悬浮液时，密度较大的固体颗粒在重力作用下逐渐下沉，这

6、一过程称为沉降。旋转式真空过滤设备常见的离心机有：1.管式离心机最简单，可提供较大离心力；管状离心机可以冷却，在蛋白质生产中很有利；悬浮液由管底进，澄清液由管口流出。管壁上沉积物为浓浆；可连续加料至流出物固体损失使离心不能正常进行；须定时拆卸、清洗，这种间断性操作也是最大的缺点。碟片式离心机第三种篮式过滤机是离心和过滤方法的结合。它具有一个多孔可高速旋转的圆筒 。悬浮液延着圆筒的旋转轴连续加入，通过筒壁上的小孔流出， 中空柱状料液的内径基本为一个常数，不随料液的加入而改变，滤饼在筒壁上沉积。 发酵液提取的第一步是将生物机体从发酵液中分离，通常使用过滤和离心等方法，上面已有陈述。大多数情况下，抗

7、生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。在上述过程中，需被分离的发酵液可被看作一种副产物来处理，以此分离和纯化产物。 有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素也是包含在生物体中。还有一些目标产物就是细胞本身，如面包酵母。大多数情况下，产物还是包裹在生物体内，属胞内产物。细胞壁和细胞膜简介 植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素、木质素蛋白质、酶类以及脂肪酸等。 细菌的细胞壁的主要成分是肽聚糖。 真菌细胞壁中的主要成分为几丁质、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等，这些都是单糖的聚合物

8、。细胞膜的结构细胞破碎的方法细胞化学破碎法细胞物理破碎法 细胞破碎化学方法中最简单的是渗透冲击法。此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。细胞破裂后释放到周围环境中的胞内物。 方法技术原理效果成本举例化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏酶消化法细胞壁被消化，使细胞破碎温和昂贵增溶法表面活性剂溶解细胞壁温和适中胆盐作用于大肠杆菌脂溶法有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳适中便宜甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱的皂化作用使细胞壁融解剧烈便宜 酶消化法和碱处理法都是细胞破碎的有效方法，但是也都有各自的缺点。 酶消化法的缺点在于酶的价格昂贵

9、限制了在大规模生产中的使用，虽然条件温和、具有选择性。细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。 碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化。该操作是细胞增溶的很好的例子，因为它使细胞壁的成分溶于表面活性剂，也使蛋白质变性。该法不仅破坏了细胞壁也破坏了产物，因此即便很便宜，碱处理也是一种很不常用的方法。方法技术原理效果成本举例机械法匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎适中适中动物组织及动物细胞研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬

10、浮液小规模处理匀浆法（孔型）须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理 机械法主要有匀浆法和研磨法。这两种方法中，细胞通过高的机械剪切力被破坏。热量的产生是该法的一个缺点，而且不容易规模放大，是一种可以在实验室规模下操作方法。冻结-融化法 机理：一是在冷冻过程中会使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性；二是冷冻时细胞内水结晶形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。 缺点：反复冻融会使蛋白质变性，从而影响活性蛋白质的回收率。干燥法 机理：采用空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等，改变膜的通透性

11、。 缺点：条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。自溶法 机理：是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。 缺点：容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。细胞碎片分离离心分离板框过滤萃取 萃取概念杂质溶质原溶剂萃取剂Light phaseHeavy phasen使含溶质的溶液（h）和萃取剂（L）解出混合，静止后分成两层。n多级萃取是多级串联的设备中进行多级萃取的方法，是n利用可与被萃目标物发生反应的物质作为萃取剂进行的反应n络合萃取分离有机酸（醋酸）化学萃化学萃取取n阳离子交换反应 被萃取物为待正电的阳离子（Z+） 萃取剂一般为弱酸有机物HA或H2A 萃

12、取过程：Z+(W)+HA(O)ZA(O)+H+( W)n阴离子缔合反应 金属离子在水相中以络合阴离子存在 萃取剂与H+结合成阳离子 萃取过程： (ZR)+(HU)(HU)(ZR)浓缩精制浓缩精制微滤（微滤（MFMF）：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力差为推动力，使不溶性物质得以分离的操作，孔径分布范围在0.02514m之间；超滤（超滤（UFUF）：分离介质同上，但孔径更小，为0.0010.02 m，分离推动力仍为压力差，适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质；反渗透（反渗透（RORO）：是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.00010.001 m之间；（由于分离的溶

13、剂分子往往很小，不能忽略渗透压的作用，故而成为反渗透）纳滤纳滤：以压力差为推动力，从溶液中分离3001000小分子量的膜分离过程，孔径分布在平均2nm微滤超滤纳滤反渗透悬浮颗粒大分子有机物糖类等小分子有机物，二价盐或多价盐单价盐水行行 业业处理对象处理对象行行 业业处理对象处理对象制药工业母液中有效成分的回收抗菌素的分离纯化维生素的分离纯化氨基酸的脱盐与纯化化工行业酸碱纯化、回收电镀液中铜的回收食品工业乳清脱盐与浓缩苛性碱回收纯水制备超高纯水水的脱盐地下水的净化染料工业活性染料的脱盐与回收废水处理印染厂废水脱色造纸厂废水净化浓缩n浓缩通常是在沸腾状态下，经传热过程，利用气化作用，将挥发性大小不

14、同的物质进行分离，从液体中除去溶剂得到浓缩液的工艺操作。浓缩方法n常压蒸发是料液在一个大气压下进行蒸发的方法，又称常压浓缩。 待浓缩料液中的有效成分是耐热的，而溶剂又无燃烧性，无毒害，无经济价值，可用此法进行浓缩。n减压蒸发 减压蒸发是在密闭的容器内，抽真空降低内部压力，使料液的沸点降低而进行蒸发的方法，又称减压浓缩。特点：1.防止或减少热敏性物质的分解 2.增大传热温度差，强化蒸发操作 3.能不断地排除溶剂蒸汽，有利于蒸发的顺利进行 4.沸点降低，可利用低压蒸汽或废弃加热 5.料液沸点降低，其气化潜热随之增大，比常压蒸 发消耗的加热蒸汽的量要多。n薄膜蒸发n薄膜蒸发是使料液在蒸发时形成薄膜，

15、增加气化表面进行蒸发的方法，有称薄膜浓缩。n特点：1.蒸发速度快，受热时间短 2.不受料液静压和过热影响，成分不易被破坏 3.可在常压或减压下连续操作 得到的浓缩液中含有目标产物，需要通过沉析操作降低产物在溶液中的溶解度，使其沉淀出来。 云芝糖肽采用的是水提醇沉的方法沉淀的，水提醇沉淀法是先以水为溶剂提取发酵液中的目标成分，再用不同浓度的乙醇沉淀目标产物。干燥的基本概念干燥的基本概念干燥的基本原理n物料中所含水分的性质 1 结晶水 结晶水是化学结合水，一般用风化方法去除，在生物药中不视为干燥过程。 2 结合水 指存在于细小毛细管中的水分和渗透到物料细胞中的水分。 此种水分难以从物料中去除。因为

16、毛细管内水分所产生的蒸气压低；物料细胞中的水分被细胞膜包围和封闭，如不扩散打膜外，则不易蒸发去除。3 非结合水 指存在于物料表面的润湿水分；粗大毛细管中水分和物料孔隙中水分。 此种水分与物料结合力弱，易于去除。因为它所产生的蒸气压等于同温度水的蒸气压。4 平衡水分与自由水分 某物料与一定温度、湿度的空气相接触时，将会发生排除水分或吸收水分的过程，直到物料表面所产生的蒸气压和空气中的水蒸气分压相等为止，物料中的水分与空气处于动态平衡状态，此时物料中所含的水分称为该空气状态下物料的平衡水。 平衡水分与物料的种类、空气的状态有关。 自由水分是指 物料干燥过程是被气化的水分连续进行内部扩散和表面气化的

17、过程。 物料中所含的总水分为自由水分与平衡水分之和，在干燥过程中可以除去的水分只能是自由水（包括全部非结合水和部分结合水），不能除去平衡水。影响干燥的因素影响干燥的因素n被干燥物料的性质n干燥介质的温度，湿度与流速n干燥速率与干燥方法n压力干燥方法与设备n烘干法：是将湿物料摊放在烘盘内，利用热的干燥气流是湿物料水分气化进行干燥的一种方法。 烘箱：又称干燥箱，适用于各类物料的干燥或干热灭菌，小批量生产。 烘房：是供大量生产用的烘箱，其结构原理和烘箱一致，但由于容量大，在设计上更应该注意温度、气流路线及流速等因素的相互影响，以保证干燥速率。n减压干燥法：是在密闭的容器中抽去空气减压而进行干燥的一种方法。 其特点是适用于热敏性物料，获高温下以氧化，或排出的气体有使用价值、