T∕CI 011-2021 细菌生物被膜的培养、观测和耐药性评测技术指南

1、ICS 07.100.01CCS C50准T/CI 0112021细菌生物被膜的培养、观测和耐药性评测技术指南Technical Guidelines on Biofilm Cultivation, Examination andResistance Evaluation2021-8-5 实施2021-8-5 发布中国国际科技促进会 发布1. 适用范围12. 术语和定义12.1生物被膜：12.2交叉感染：12.3 Colony Forming Unit (CFU):12.4群体感应：12.5 SEM13. 细菌生物被膜培养与观测方法归类表24. 细菌生物被膜培养方法与技术标准44.1体外静态生

2、物被膜培养44.1.1孔板培养法54.1.2玻璃珠培养法64.1.3玻片培养法84.1.4 Peg-lid 培养法94.2体外动态生物被膜培养114.2.1 管式培养法(tubing-biofilm) 114.2.2 池式培养法(flow-cell biofilm) 145. 细菌生物被膜定量与观测技术与标准165.1结晶紫染色法165.1.1实验材料165.1.2操作流程17T/CI 01120215.1.3观察与定量结果展示175.1.4技术要点175.2死活菌细胞染色法185.2.1实验材料185.2.2操作流程185.2.3观察与定量结果展示195.2.4技术要点195.3 CFU计数

3、法195.3.1实验材料205.3.2操作流程205.3.3观察与定量结果展示215.3.4技术要点215.4干重/湿重定量法215.4.1实验材料225.4.2操作流程225.4.3观察与定量结果展示235.4.4技术要点235.5 3D荧光成像定性定量法235.5.1实验材料235.5.2操作流程245.5.3观察与定量结果展示245.5.4技术要点24245.6激光共聚焦荧光显微镜观测法5.6.1实验材料245.6.2操作流程245.6.3观察与定量结果展示255.6.4技术要点255.7电子显微镜观测法255.7.1实验材料255.7.2操作流程255.7.3观察与定量结果展示265.

4、7.4技术要点266. 生物被膜耐药性检测方法与评定标准266.1最小抑菌浓度法266.1.1实验材料276.1.2操作流程276.1.3技术要点276.2流动式抑菌法286.2.1实验材料286.2.2操作流程286.2.3技术要点29附录Xa孔板生物被膜培养法培养步骤i附录Xb玻璃珠生物被膜培养法培养步骤ii附录Xc玻片生物被膜培养法培养步骤iii附录XdPeg-lid生物被膜培养法培养步骤iv附录Xe生物被膜管式培养法(Tubing biofilm)培养步骤V附录Xf生物被膜池式培养法(flow-cell biofilm)培养步骤vi附录Xg结晶紫染色法分析孔板培养生物被膜的操作流程vi

5、i附录Xh结晶紫染色法分析玻璃珠培养生物被膜的操作流程viii附录Xi结晶紫染色法分析玻片培养生物被膜的操作流程ix附录Xj结晶紫染色法分析peg lid培养生物被膜的操作流程x附录Xk孔板培养的生物被膜死活菌细胞染色步骤xi附录XI玻片培养的生物被膜死活菌细胞染色步骤xii附录Xm池式培养的生物被膜死活菌细胞染色步骤xiii附录Xn孔板培养的生物被膜CFU测定的操作流程xiv附录Xo玻璃珠培养的生物被膜CFU测定的操作流程xv附录Xp玻片培养的生物被膜CFU测定的操作流程xvi附录Xq peg lid培养的生物被膜CFU测定的操作流程xvii附录Xr管式培养的生物被膜CFU测定的操作流程xv

6、iii附录Xs干重/湿重定量法测定玻片培养生物被膜xix附录Xt干重/湿重定量法测定管式培养生物被膜xx附录Xu生物被膜3D荧光成像定性定量法操作步骤xxi附录Xv最小抑菌浓度法检测孔板培养的生物被膜耐药性的操作流程xxiii附录Xw最小抑菌浓度法检测玻璃珠培养的生物被膜耐药性的操作流程xxiv 附录Xx最小抑菌浓度法检测peg lid培养的生物被膜耐药性的操作流程xxv 附录Xy流动式抑菌法分析管式培养的生物被膜xxviill库七七 标准下载附录Xz流动式抑菌法分析池式培养的生物被膜xxvii实验材料与耗材总表xxvii i本标准按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文

7、件的结构和起草规则 起草。为培养与观测细菌生物被膜、评测细菌生物被膜耐药性等工作，制定本技术指南。本指南是对运用体外静态生物被膜、流式生物被膜、最小抑菌浓度检测等技术进行细菌 生物被膜培养、观测和耐药性评测的指导性文件，可供实验室细菌生物被膜培养与观测工作、 细菌生物被膜耐药性评定等工作为参考。本指南为首次发布，今后将根据细菌生物被膜实验要求及技术发展情况适时修订。 本标准由中国国际科技促进会归口。本指南由南方科技大学医学院负责管理，由南方科技大学医学院杨亮课题组负责具体技 术内容的解释。为了提高指南质量，请各单位在使用过程中，总结经验和积累资料，及时将 发现的问题和意见反馈给南方科技大学医学

8、院杨亮课题组，以供后续修订时参考。联系方式： 广东省深圳市南山区西丽学苑大道1088号，邮编：518055； E-mail： yanglo 本指南起草单位：南方科技大学、中山大学深圳分校、中国科学院南海海洋研究所、 西北大学、复旦大学、南京农业大学、中国科学院北京微生物研究所、南开大学、华 南理工大学、南方科技大学第三附属医院、青岛农业大学。本指南主要起草人：杨亮，邓音乐，王晓雪，梁海华，瞿涤，钱国良，马旅雁，吴卫辉， 白芳，徐振波，刘洋，蔡瞾，张莹丹，段湘科，刘茜，于恺威，谭玉龙。T/CI 0112021细菌生物被膜的培养、观测和耐药性评测技术指南1. 适用范围本指南规定了细菌生物被膜培养、

9、观测和耐药性评测技术的实验条件要求、实验设计、 实施与验证等技术要求。本指南适用于研究机构、教育机构以及其他生物技术相关机构或公 司内需培养、观测细菌生物被膜，并检测细菌生物被膜耐药性的实验操作人员阅读并参考使 用。本指南亦适用于临床和食源性分离细菌菌株生物被膜形成能力的鉴定、临床和食源性分 离菌株生物被膜耐药性的测定、细菌生物被膜形成和耐药分子机制的探究、细菌生物被膜防 控方法及药物的研发等领域。本指南可作为实验室细菌生物被膜培养与构建、观测与定量、以及耐药性评估等工作的 技术依据。根据中华人民共和国专利法，对于本指南中所涉及专利技术(US9988380B2， US10416153B2, Z

10、L201711231930.8, CN110974838A)的使用，需获得专利权所有人书面许 可。2. 术语和定义2.1生物被膜：生物被膜指细菌粘附于生物或非生物基质表面，分泌胞外多糖、蛋白质、胞外DNA等， 将细菌细胞保护于其中而形成的膜状细菌群落。2.2交叉感染：细菌或其他微生物从一种物质或物体转移到另一种物质或物体并产生有害影响的过程。2.3 Colony Forming Unit (CFU):菌落形成单位，是一种活细菌细胞数量的测量方法，以CFU/mL为单位。2.4群体感应：指一种细菌细胞间的信号转导系统，群体感应在多种致病菌中控制毒力因子的合成。2.5 SEM扫描电子显微镜，Scan

11、ning Electron Microscope。T/CI 01120213. 细菌生物被膜培养与观测方法归类表表1.细菌生物被膜培养方法归类细菌生物被膜培养方法体外静态生物被膜培养体外动态生物被膜培养孔板培养法玻璃珠培养法玻片培养法Peg-lid培养法管式培养法池式培养法适用范围检测生物被膜形成能 力；检测药物抑生物 被膜浓度等检测药物清除生物 被膜效果等观察生物被膜形 态，检测生物被膜 形成能力等大量、多种细菌成膜能力比较；药物筛选生物被膜样品收集，EPS收集，生物转化 等生物被膜形态观察，药 物对生物被膜形态的 影响等表2.细菌生物被膜定量与观测技术归类细菌生物被膜定量与观测技术结晶紫染

12、色法死活菌细胞染色 法CFU计数法干重/湿重定量 法3D荧光成像定性 定量法激光共聚焦荧光显微 镜观测法电子显微镜观测 法适用范围原料简单，通量高 的定量对生物被膜形态 的观察原料简单，可结 合筛选平板培 养的定量直接测定整体生物被膜绝对 重量对生物被膜量、厚 度、粗糙度等一系 列表型特征的定 量，定位生物被膜 内不同菌种，分析 菌种间互作关系对生物被膜量、厚度、 粗糙度等一系列表型 特征的定量，定位生 物被膜内不同菌种， 分析菌种间互作关系对生物被膜胞外 大分子聚合物、菌 体接合等细节的 定量观察对样品的需求适用于孔板培养、玻璃珠培养或玻 片培养的样品适用于玻片培养 或者在共聚焦培 养皿的孔

13、板培养 的样品，或池式 培养的样品适用于孔板培 养、玻璃珠培 养、玻片培养和 管式培养的样 品适用于玻片培 养的生物被膜 样品和管式培 养的生物被膜 样品适用于玻片培养或 者在共聚焦培养皿 的孔板培养的样 品，或池式培养的 样品适用于玻片培养或者 在共聚焦培养皿的孔 板培养的样品，或池 式培养的样品适用于管式培养 和玻片培养的生 物被膜样品3T/CI 01120214. 细菌生物被膜培养方法与技术标准以下生物被膜培养方法与技术标准均以铜绿假单胞菌为模式菌株撰写，其他菌种培养以 及实验条件可按需求适当调整。铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的革兰氏阴性条件致病菌

14、，在正 常人皮肤、呼吸道、肠道以及多种自然环境如水、土壤中广泛分布。此菌为杆状单鞭毛形态， 适宜生长温度为25-37°C,在42°C也可生长，于LB培养基上呈青绿色圆形菌落且极易附着 在不同基质表面形成生物被膜。铜绿假单胞菌是医院内感染的主要致病菌之一，可在免疫力 低下的患者不同部位形成生物被膜引起长期慢性感染，包括烧伤伤口感染、呼吸道感染和尿 路感染等，并可引发菌血症和败血症等致命并发症。此菌对多种抗生素耐药，并且耐药机制 非常复杂，包括形成生物被膜、加强外排泵系统、改变细胞膜通透性与药物作用靶点、以及 分泌抗菌酶等。铜绿假单胞菌生物被膜的形成机制也相当复杂，例如通过过量

15、分泌胞外多糖、 积累胞外DNA、降低运动能力、调节群体感应系统等。作为研究生物被膜的模式菌株，铜 绿假单胞菌早已被广泛应用于构建生物被膜、检测其耐药性并开发用药方案的研究中，是以 本指南以铜绿假单胞菌为模式菌株撰写，其他菌种的培养及实验条件可按需适当调整以达到 最佳实验结果。4.1体外静态生物被膜培养本指南囊括四种常用的体外静态生物被膜培养方法，包括孔板培养法、玻璃珠培养法、 玻片培养法和Peg-lid培养法。（1）孔板培养法（4.1.1）将稀释菌液在96孔板或24孔板中培养，生物被膜附着于孔壁上， 移除悬浮液并洗脱浮游菌体可得到生物被膜用于后续实验。孔板培养法一般用于检测菌种生 物被膜形成能

16、力、生物被膜定量、生物被膜耐药性和药物最小抑菌浓度等实验。此培养法可 与多种染色法结合用于定量生物被膜，培养出的生物被膜结构可用不同显微镜观察。此培养 法具有通量高、培养时间短和操作简单等优势，但培养的生物被膜厚度与硬度较低，浮游菌 体不易洗脱造成平行间差异较大。（2）玻璃珠培养法（4.1.2）在24孔板中将玻璃珠置于稀释菌液内培养，生物被膜附着于玻 璃珠表面，洗脱浮游菌体可得到生物被膜用于后续实验。此培养法与孔板培养法类似，一般 用于检测菌种生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐药性和药物最小抑菌浓度等试 验。此培养法可与多种染色法结合用于定量生物被膜，但不易在显微镜下观察。此培养法具

17、有通量高、培养时间短等优势，但操作略复杂。此方法培养的生物被膜厚度与硬度较高，浮 游菌体较易清洗，平行间差异较小。（3）玻片培养法（4.1.3）将玻片插入菌液培养，生物被膜附着于玻片表面，去除拨片并洗 脱浮游菌体得到生物被膜用于后续实验。此方法一般用于检测菌种生物被膜形成能力、观察 生物被膜结构与形态，可与多种染色方法和多种显微镜结合使用观测生物被膜构态。此方法 通量高、培养时间短，但操作略复杂。此方法培养的生物被膜量较大、厚度与硬度高，浮游 菌体易清洗，平行间差异较小。（4）Peg-lid培养法（4.1.4）将带有凸起楔子（peg）的96孔板盖置于装有菌液的96孔板 中培养，生物被膜附着于p

18、eg中下端，取下盖子并洗脱peg上的浮游菌体可得到生物被膜用 于后续实验。此方法与孔板培养法类似，一般用于检测菌种生物被膜形成能力、生物被膜定 量、生物被膜耐药性和药物最小抑菌浓度等试验。此培养法可与多种染色法结合用于定量生 物被膜，但培养出的生物被膜由于在楔子顶端，不易于显微镜观察。此培养法具有通量高、 培养时间短和操作简单等优势，培养的生物被膜厚度与硬度较高，浮游菌体较易洗脱、平行 间差异较小。每种培养与观测方法细节请见下文。4.1.1孔板培养法稀释至 ODqqMJ.O 1 -0.05适用范围：孔板生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）需要检测不同菌种（野生 菌种和突变菌种）间生物被膜形

19、成能力，（2）需要检测不同菌株在生物被膜状态下对药物 的敏感/耐受性。针对孔板培养的生物被膜的分析方法主要包括:生物被膜定量（章节5.1.2a）、 生物被膜耐药性和药物最小抑菌浓度（章节6.1）。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌 （PA）为模式菌株，在耗氧培养条件下进行示例：卜n厂ph/胭OD60U=0.01-0.05的菌液细菌生物被膜细菌生物被膜 生理盐水96孔板在所需温度培养至少16小时移除菌液使用生理盐水或ddH2O洗涤过夜培养后稀释图1.体外静态生物被膜培养方法（孔板培养法）4.1.1.1实验材料：a. 无菌96孔板（或24孔板，Nest/Coming）；b. 无菌储液器；c. 10

20、0 |iL排枪移液器（或1 mL移液器）；d. 15 mL无菌摇菌管；e. 100 （或1 mL）移液器枪头;5T/CI 0112021f. LB培养基（可按需使用其他培养基）：g. 所需菌株；h. 废液桶；i. 75%酒精;j. 无菌 ddlhO;k. 无菌生理盐水。4.1.1.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将目标菌株接种至LB培养基中培养过夜。在无菌操作台中，用新鲜培养基将菌液 按一定比例稀释，随后将稀释好的菌液倾倒入无菌储液器，再用排枪移液器将稀释菌液加入 96孔板或24孔板孔洞中，并置于所需温度下静置培养生物被膜。实验菌种和对照菌种均按 照附录Xa的培

21、养步骤进行接种、培养（附录Xa），随后对生物被膜进行分析（章节5）。 4.1.1.3技术要点a. 所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操 作台以及所使用的器具，避免交叉污染；b. 在将菌液加入孔板前，轻轻摇晃储液器将菌液混合均匀，并用排枪反复轻轻吹打菌液， 以减小实验误差；c. 孔板培养生物被膜需保证培养后孔洞内剩余菌液体积基本一致，培养时需用透气封口膜 密封孔板防止液体蒸发；d. 移除废液以及清洗生物被膜时须注意不可用枪头触碰生物被膜，以保证生物被膜完整性。 4.1.2玻璃珠培养法适用范围：玻璃珠生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）用于循环培养生物被

22、膜 进行压力条件进化实验，（2）需要检测不同菌株在生物被膜状态下对药物的敏感/耐受性。 针对玻璃珠培养的生物被膜的分析方法主要为：CFU计数法（章节5.3.2b）。以下示意装置 和操作均以铜绿假单胞菌（PA）为模式菌株，在耗氧培养条件下进行示例：T/CI 0112021图2.体外静态生物被膜培养方法（玻璃珠培养法）4.1.2.1实验材料:a. 无菌24孔板；b. 无菌储液器；c. 1 mL移液器d. 15 mL无菌摇菌管；e. 1 mL移液器枪头；f. LB培养基（可按需使用其他培养基）；g. 无菌ddH2O （可按需使用PBS溶液或生理盐水）；h. 所需菌株；i. 废液桶；j. 75%酒精；

23、k. 慑子；l. 3-5 mm玻璃珠。4.1.2.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将目标菌株接种至LB培养基中培养过夜，用新鲜培养基将菌液按一定比例稀释， 随后将稀释好的菌液转移至24孔板孔洞中，并加入两颗无菌玻璃珠，37°C 100 rpm转速摇 晃培养过夜。实验菌种和对照菌种均按照附录Xa的培养步骤进行接种、培养（附录Xb）， 随后对生物被膜进行分析（章节5）。7T/CI 01120214.1.2.3技术要点a. 所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操 作台以及所使用的器具，避免交叉污染；b. 在将菌液加入孔板

24、前，轻轻摇晃储液器将菌液混合均匀，并用移液器反复轻轻吹打菌液， 以减小实验误差；c. 孔洞内菌液不可过多，以免摇晃培养时菌液溅出造成交叉污染；d. 用无菌镊子转移玻璃珠时，需尽量减少镊子与玻璃珠接触面，以保证生物被膜完整性；e. 孔板培养生物被膜需保证培养后孔洞内剩余菌液体积基本一致，培养时需用透气封口膜 密封孔板防止液体蒸发。4.1.3玻片培养法适用范围：玻片生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）需要检测不同菌种（野生 菌种和突变菌种）间生物被膜形成能力，（2）需要检测不同菌株在生物被膜状态下对药物 的敏感/耐受性。针对玻片培养的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章节5.1.2c）

25、 和生物被膜耐药性（章节5.3.2c）。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌（PA）为模式菌 株，在耗氧培养条件下进行示例：50mL培养管od600=o.oi 的菌液hllhllhli50mL培养管载玻片置入培养管在所需条件下培养至少16小时取出载玻片ddH2O在新的培养皿中使用ddH2O清洗至少三次载玻片细菌生物被膜生物被膜附着于载玻片的表面图3.体外静态生物被膜培养方法（玻片培养法）T/CI 01120214.1.3.1实验材料：a. 无菌培养皿（静置培养需准备6孔板）；b. 15 mL无菌摇菌管；c. LB培养基（可按需使用其他培养基）：d. 无菌ddH2O （可按需使用PBS溶液或生理盐

26、水）e. 所需菌株；f. 废液桶；g. 75%酒精；h. 慑子；i. 载玻片。4.1.3.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将目标菌株接种至LB培养基中培养过夜，用新鲜培养基将菌液按一定比例稀释， 随后将稀释好的菌液转移至培养皿，并加入无菌载玻片，37 °C 100 rpm转速摇晃培养过夜。 实验菌种和对照菌种均按照附录Xa的培养步骤进行接种、培养（附录Xc），随后对生物 被膜进行分析（章节5）。4.1.3.3技术要点a. 所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操 作台以及所使用的器具，避免交叉污染；b. 培养皿内菌液

27、不可过多，以免摇晃培养时菌液溅出造成污染；c. 用无菌镊子转移载玻片时，需尽量减少镊子与玻璃珠接触面，以保证生物被膜完整性；d. 摇晃培养时需用透气封口膜密封培养皿防止液体蒸发。4.1.4 Peg-lid 培养法适用范围：Peg-lid生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）需要检测不同菌种（野 生菌种和突变菌种）间生物被膜形成能力，（2）需要检测不同菌株在生物被膜状态下对药 物的敏感/耐受性。针对Peg-lid培养的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章节 5.1.2c）和生物被膜耐药性（章节5.3.2c）。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌（PA） 为模式菌株，在耗氧培养条件下进行示

28、例：9T/CI 011202196孔板 / 96-peg lidOD600=0.01-0.05 的菌液加入稀释后的菌液细菌生物被膜ddH2O将peg-lid盖入所需温度下lOOrpm震荡培养 移除菌液至少16小时使用ddH2O清洗两次图4.体外静态生物被膜培养方法（peg lid培养法）4.1.4.1实验材料：a. 96孔板；b. Peg lid盖子（见附录图三）；c. 无菌储液器；d. 100 |iL排枪移液器；e. 15 mL无菌摇菌管；f. 100吣（或1 mL）移液器枪头；g. LB培养基（可按需使用其他培养基）；h. 所需菌株；i. 废液桶；j. 75%酒精；k. 无菌ddH2O （

29、可按需使用PBS溶液或生理盐水）；l. 无菌生理盐水。4.1.4.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将目标菌株接种至LB培养基中培养过夜，用新鲜培养基将菌液按一定比例稀释， 随后将稀释好的菌液转移至96孔板中，再将peg lid小心盖入菌液中。37°C lOOrpm转速摇 晃培养过夜。实验菌种和对照菌种均按照附录Xa的培养步骤进行接种、培养（附录Xd）， 随后对生物被膜进行分析（章节5）。4.1.4.3技术要点a. 所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操 作台以及所使用的器具，避免交叉污染；T/CI 0112021b

30、. 在将菌液加入孔板前，轻轻摇晃储液器将菌液混合均匀，并用排枪反复轻轻吹打菌液， 以减小实验误差；c. 孔洞内菌液不可过多，以免置入peg lid或震荡培养时菌液溅出造成污染；d. 需保证培养后孔洞内剩余菌液体积基本一致，培养时需用透气封口膜密封孔板防止液体 蒸发；e. 移除废液以及清洗生物被膜时须注意不可触碰生物被膜，以保证生物被膜完整性。 4.2体外动态生物被膜培养本指南囊括两种常用的体外静态生物被膜培养方法，包括管式培养法和池式培养法，详 细介绍如下：（1）管式培养法将菌液注入硅胶管内静置附着后，将培养基以匀速注入硅胶管，流动培养 生物被膜，生物被膜附着于管壁上。此方法一般应用于对生物被

31、膜样品需求量大的实验，如 生物被膜样品收集，胞外多糖收集生物转化（biotransformation）等。此方法可形成大量生 物被膜，生物被膜结构厚，通量较高，但培养时间较长，操作较复杂，并不易用显微镜观察 生物被膜结构。（2）池式培养法将菌液注入培养池通道内，翻转静置待细菌附着与盖子上之后，将培养基 以匀速注入培养通道，流动培养生物被膜，生物被膜附着于三通道池盖上。此方法一般应用 于生物被膜形态观察、药物对生物被膜形态的影响等实验，此方法形成生物被膜形态与结构 完整，可结合有荧光标记的菌株或不同染色法，直接在显微镜下观测生物被膜形态与结构， 但通量较低，操作复杂，培养时间较长。4.2.1 管

32、式培养法（tubing-biofilm）适用范围：管式生物被膜培养法通常适用于以下场景：（1）需要模拟管道内生物被膜 生长环境的研究，（2）需要相对大量生物被膜样品的研究，（3）生物被膜对药物/化合物 代谢（biotransformation）的相关研究等。针对管式培养的生物被膜的分析方法主要包括： 干重/湿重分析（章节5.4）、基因组/转录组/蛋白组提取和测序分析、电子显微镜观察（章 节5.7）、氧气探针/化合物探针监测等。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌（PA）为 模式菌株，在耗氧培养条件下进行示例：管式生物被膜培养法具有较高通量，可以一次性培养多通道生物被膜样品；该方法能够 一次性产出

33、大量生物被膜样品，常用于干重/湿重分析、基因样本提取，EPS等代谢产物提 取、电子显微镜观察和氧气探针/化学探针观察等。11T/CI 0112021图5.体外动态生物被膜培养方法（管式培养法）4.2.1.1实验材料：a. 15 mL无菌摇菌管；b. 长50 cm,内直径1.0 mm硅胶管（润泽）；c. 长2520 cm,内直径1.0 mm硅胶粟管（润泽）；d. 长15 cm,内直径1.0mm硅胶管（润泽）；e. 长10 cm,内直径3.2 mm硅胶管（润泽）；f. 长30 cm,内直径1.0 mm硅胶粟管（润泽）；g. 等径直通接头（润泽）；h. 变径直通接头（润泽）；i. 鲁尔接头（润泽）；

34、j. 2个2L玻璃培养瓶；k. 10% LB培养基（可按需使用其他培养基）；l. 过滤器（过滤孔0.22 |im）；m. 蠕动粟 (aperistaltic pump, MasterFlex)；T/CI 0112021n. 所需菌株；o. 医用尖锐物处理容器；p. 75%酒精；q. 慑子；r. 5 mL及1 mL无菌针管；s. 无菌针头；t. 移液器；U.无菌移液管。4.2.1.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将装有培养基的玻璃培养瓶、硅胶管、除泡器和镊子在121°C高温高压灭菌15分 钟，取出并将硅胶管、除泡器和镊子干燥备用。如图一所示，在无菌操作台

35、中按顺序用安装 双向接头的硅胶管b连接装有培养基的玻璃培养瓶、无阻泵、过滤器、硅胶管c、d、e、f, 2L废液罐，同个装置内至少三个平行（图内展示一个平行），将整个系统置于恒温培养箱 内。将目标菌株接种至适当体积的LB培养基中，在所需温度下200 rpm摇晃培养过夜。在 无菌操作台中，用新鲜LB培养基将菌液稀释至OD_nm=0.1，用无菌针管吸入2mL稀释菌 液，并将稀释菌液分别注入硅胶管b平行装置中，用硅胶封口后静置培养2小时使细菌细胞 粘附于管壁，用10% LB流动培养基培养3至7天，建立生物被膜。首先将生物被膜管式培养装置进行灭菌和组装，在用药组的培养基玻璃瓶中加入工作浓 度的目标抗生素

36、并混合均匀；在阳性对照组的培养基玻璃瓶中加入已知具有抑菌抑生物被膜 浓度的粘菌素colistin并混合均匀；在阴性对照组的培养基玻璃瓶中加入等体积的用药组抗 生素的溶剂并混合均匀。用药组、阳性对照组和阴性对照组均按照附录X的培养步骤进行 接种、培养（附录Xe），后收集生物被膜进行观察。4.2.1.3技术要点a. 所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操 作台以及所使用的器具，避免交叉污染；b. 使用针管与针头吸取菌液后，针头不可朝向操作人，不可盖回针头盖子，以免误伤操作 人员；c. 将使用过的针管与针头丢弃入医用尖锐物处理容器统一处理，避免误伤操作人员；d.

37、 保证无阻泵运行速度一致，避免液体回流造成污染；e. 保证硅胶管管壁厚度适宜，造成管壁破裂，影响生物被膜形成;13T/CI 0112021f. 在培养过程中如需添加培养基，须用酒精消毒瓶口与邻近装置表面，避免污染；g. 培养瓶口须用透气封口膜密封防止培养基蒸发。4.2.2 池式培养法(flow-cell biofilm)池式培养系统GrowthmediumFlow-cell biofilm reactor善.适用范围：池式生物被膜培养法通常适用于以下场景：(1)需要实时观察生物被膜形 态的相关研究，(2)需要实时观察生物被膜中标记蛋白/基因表达及分布的相关研究，(3) 需要实时观察生物被膜群落

38、中不同菌种相对位置关系的研究等。针对池式培养的生物被膜的 分析方法主要包括：死活菌细胞染色法(章节5.2)、激光共聚焦荧光显微镜观测法(章节 5.6)、3D荧光成像定性定量法(章节5.5)等。以下示意装置和操作均以铜绿假单胞菌(PA) 为模式菌株，在耗氧培养条件下进行示例：池式生物被膜培养法通常适用于以下场景：(1) 培养基玻璃瓶硅胶管e (I. D 硅胶管c (I.D = 1 mm)三通道培养池 硅胶泵管d (I.D = 1. 02 mm)硅胶管f (I. D = 1 mm) 无阻泵废液瓶 过滤器(0. 22 pm)图6.体外动态生物被膜培养方法(池式培养法)4.2.2.1实验材料：a. 1

39、5 mL无菌摇菌管；b. 三通道培养池(3-channel flow-cell)与树脂盖；c. 盖玻片；d. 硅胶胶水；长50 cm,内直径1.0 mm硅胶管;T/CI 0112021f. 长25 cm长20 cm,内直径1.0 mm硅胶泵管，双端安装;g. 长15 cm,内直径1.0 mm硅胶管；h. 长30 cm,内直径1.0 mm硅胶泵管；i. 等径直通接头；j-鲁尔接头；k.2个2 L玻璃培养瓶；l. 10% LB培养基（可按需使用其他培养基）；m. 过滤器（过滤孔0.22 jim）；n. 蠕动泵（aperistaltic pump）；o. 所需菌株；p. 医用尖锐物处理容器；q. 7

40、5%酒精；r. 慑子；s. 5 mL及1 mL无菌针管；t. 无菌针头；u. 移液器;V.无菌移液管。4.2.2.2培养步骤【附录以protocol/SOP模式进行详细阐述】首先将生物被膜池式培养装置进行灭菌和组装，在用药组的培养基玻璃瓶中加入工作浓 度的目标抗生素并混合均匀；在阳性对照组的培养基玻璃瓶中加入已知具有抑菌抑生物被膜 浓度的粘菌素colistin并混合均匀；在阴性对照组的培养基玻璃瓶中加入等体积的用药组抗 生素的溶剂并混合均匀。用药组、阳性对照组和阴性对照组均按照附录X的培养步骤进行 接种、培养（附录Xf），后收集生物被膜进行观察。4.2.23技术要点a. 所有操作须严格遵守无菌

41、操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操 作台以及所使用的器具，避免交叉污染；b. 使用针管与针头吸取菌液后，针头不可朝向操作人，不可盖回针头盖子，以免误伤操作 人员；c. 将使用过的针管与针头丢弃入医用尖锐物处理容器统一处理，避免误伤操作人员;15T/CI 0112021d. 保证无阻泵运行速度一致，避免液体回流造成污染；e. 保证培养池翻转状态，以免影响生物被膜形成；f. 黏结培养池与池盖时须小心不可将池盖压破，并须保证培养池与池盖完全密封，避免菌 液与培养基溢出造成污染；g. 保证培养池所有通道畅通，避免堵塞造成液体回流与污染；h. 在培养过程中如需添加培养基，须用酒精消毒

42、瓶口与邻近装置表面，避免污染；i. 培养瓶口须用透气封口膜密封防止培养基蒸发。5. 细菌生物被膜定量与观测技术与标准5.1结晶紫染色法结晶紫溶液为一种可与细胞DNA结合的碱性染液，此染色法利用结晶紫溶液将整体生 物被膜，包括死活细菌进行染色。此方法一般用于整体生物被膜定量，适用于本指南涵盖的 四种体外静态培养的生物被膜（4.1），并按结晶紫吸光度（OD55onm）进行生物被膜相对定 量。此方法原料与操作简单、时间短、通量高，可应用于多种方法培养的生物被膜，但操作 不当易造成平行间差异较大、并且无法区分生物被膜内的死活细菌。5.1.1 实验材料a. 孔板培养、玻璃珠培养、玻片培养和Peg-lid

43、培养的生物被膜样本（参考4.1、41.1、4.1.2、 4.1.3和4.1.4培养方法）；b. 1%结晶紫溶液；c. ddH。；d. 30%冰醋酸；e. 96孔板；f. 24孔板；g. 100 |iL排枪移液器（或1 mL移液器）；h. 100 pL （或1 mL）移液器枪头；i-慑子；j. 废液罐。T/CI 01120215.1.2操作流程a. 孔板培养的生物被膜：生物被膜首先用结晶紫染色，随后用ddH2O冲洗，在室温风干后， 加入30%冰醋酸溶解结晶紫。再用酶标仪在OD55Qnm测量结晶紫染色吸光度来相对定量生物 膜形成（详细信息参照附录Xg）；b. 玻璃珠培养的生物被膜：玻璃珠生物被膜经

44、ddH2O清洗后，转移至新24孔板中，并加入 结晶紫染色。随后将染色后的玻璃珠生物被膜转移至新24孔板中，用ddH2O清洗后，室温 风干。最后加入30%冰醋酸，溶解后取溶液用酶标仪在在OD550nm测量结晶紫染色吸光度来 相对定量生物膜形成（详细信息参照附录Xh）；c. 玻片培养的生物被膜：玻片生物被膜经ddH2O清洗后，并加入结晶紫染色。随后用ddH2O 清洗后，室温风干。最后加入30%冰醋酸，溶解后取溶液用酶标仪在在OD55Qnm测量结晶紫 染色吸光度来相对定量生物膜形成（详细信息参照附录Xi）；d. Peg lid培养的生物被膜：将lid上的生物被膜经结晶紫染色后，用ddH2O清洗，室温

45、风干 后加入30%冰醋酸，溶解后取溶液用酶标仪在在OD55Qnm测量结晶紫染色吸光度来相对定量 生物膜形成（详细信息参照附录Xj）。5.1.3观察与定量结果展示osao uollonpojd Esom5.1.4技术要点a. 所有操作须严格遵守标准操作流程，在操作醋酸过程中，需严格遵守标准操作流程，避 免误伤操作人员；b. 染色过程中，结晶紫溶液体积须覆盖全部生物被膜生长区域，减少误差；c. 染色后，须彻底冲洗悬浮的结晶紫溶液，减少误差；d. 移液过程中，须注意不可用移液器枪头直接触碰生物被膜，以保持生物被膜完整性;17T/CI 0112021e. 结晶紫溶液废液与醋酸溶液废液须分别倾倒至指定废

46、液罐内另行处理，不可随意倾倒或 按照普通液体处理。5.2死活菌细胞染色法死活菌细胞染色法（Syto9/PI）利用Syto9和PI两种荧光染料的特性将死菌与活菌分别 染色。Syto9可穿透活菌细胞壁与DNA结合在激光激发下呈绿色荧光，PI透过死菌的不完 整细胞壁与DNA结合在激光激发下呈红色荧光。此方法适用于结合荧光显微镜（5.5, 5.6） 观察生物被膜形态，并可分辨并定位生物被膜内的死活菌体，利用Comstat2或Imaris软件 （5.5.2）将荧光染色的生物被膜进行定量。本方法适用于玻片培养（4.1.3）、共聚焦培养皿 的孔板培养（4.1.1）、或池式培养（4.2.2）的样品，但此方法通

47、量较低，操作略复杂。 5.2.1实验材料a. 孔板培养、玻片培养和流式培养的生物被膜样本（参考4.1.1、4.1.3和4.2培养方法）；b. 96孔板；c. 培养皿；d. 100 移液器（或1 mL移液器）；e. 100 （或1 mL）移液器枪头；f. 注射器及注射针头；g. 慑子；h. 废液罐；i. 活死细胞染色试剂盒（L7012, Thermofisher, USA）或 Syto9/PI 染色剂（S34854, P3566, Thermofiser, USA）；j. 0.85%氯化钠溶液。5.2.2操作流程a. 孔板培养的生物被膜:将每个附着有生物被膜的96孔板孔洞冲洗后，加入125 Sy

48、to9/PI 染色剂（储存浓度为3.34 M/20 mM）室温静置避光染色15分钟。用荧光显微镜观察生物 被膜形态并相对定量（详细信息参照附录Xk）:b. 玻片培养的生物被膜：将附着有生物被膜的玻片置于培养皿中，加入适量Syto9/PI染色 剂（储存浓度为3.34 M/20 mM），以覆盖住生物被膜生长区域为宜，室温静置15分钟染 色。用荧光显微镜观察生物被膜形态并相对定量（详细信息参照附录XI）:c. 池式培养的生物被膜：用燕尾夹将附着有生物被膜的培养池流入端和流出端的硅胶管固 定后，将培养池从培养系统中小心取出，置于水平台面上。将流出端燕尾夹移除，用注射器 将0.5 mL Syto9/PI

49、染色剂（储存浓度为3.34 M/20mM）缓慢地从流入端注射进入培养池中，T/CI 0112021注射完毕后将流出端用燕尾夹固定。室温静置避光染色15分钟染色。用荧光显微镜观察生 物被膜形态并相对定量(详细信息参照附录Xm)。5.2.3观察与定量结果展示图8.死活菌细胞染色5.2.4技术要点a. 用荧光显微镜观察生物被膜需要使用共聚焦培养皿类的平板，例如8-well -slides (80826, ibidi)；b. 所有操作须严格遵守标准操作流程，在操作染色剂过程中，需严格遵守标准操作流程， 避免误伤操作人员；c. 染色过程中，染色液体积须覆盖全部生物被膜生长区域，减少误差；d. 移液过程中

50、，须注意不可用移液器枪头直接触碰生物被膜，以保持生物被膜完整性；e. 染色完成后，应避免剧烈震荡，并须注意在三小时内进行荧光显微镜观察，以免生物被 膜结构收到损伤而造成误差；f. 染色液废液须倾倒至指定废液罐内另行处理，不可随意倾倒或按照普通液体处理。5.3 CFU计数法CFU计数法基于将生物被膜稀释到一定浓度后涂布在琼脂培养基上培养后进行活菌形 成的菌落计数。此方法适用与间接测定生物被膜内的活菌数量，操作简单并可结合筛选平板 培养，适用于孔板培养(4.1.1)、玻璃珠培养(4.1.2)。玻片培养(4.1.3)、peg-lid培养19T/CI 0112021（4.1.4）和管式培养（4.2.1

51、）的生物被膜样本，但此方法通量较低、结果误差较大、不能反 映生物被膜内的死活菌体总量。5.3.1实验材料a. 孔板培养、玻璃珠培养、玻片培养、peg lid培养和管式培养的生物被膜样本（参考3.1.1、3. 1.2、3.1.3、3.1.4 矛口 3.2.1 培养方法）；b. 24孔板；c. 无菌培养皿；d. 无菌刮刀；e. 2 mL和10 mL无菌离心管；f. 无菌ddH2O （可按需使用PBS溶液或生理盐水）；g. LB琼脂平板（或按菌株需要，准备其他培养基琼脂平板）h. 100 移液器和1 mL移液器；i. 100 |iL和1 mL移液器枪头；j. 10 mL无菌针管；k. 慑子；l. 废

52、液罐；m. 超声水浴仪（Elma,Elmasonic P120H）。5.3.2操作流程a. 孔板培养的生物被膜：吸去孔板内悬浮细菌后，用ddH2O清洗，水浴超声后，10倍梯度 稀释，在LB琼脂平板上测定CFU （详细信息参照附录Xn）:b. 玻璃珠培养的生物被膜：吸去孔板内悬浮细菌后，用ddH2O清洗，再将玻璃珠转移至含 lmLddH2O的2mL离心管中，经涡旋振荡和水浴超声后，10倍梯度稀释，在LB琼脂平 板上测定CFU （详细信息参照附录Xo）；c. 玻片培养的生物被膜：将玻片上生物被膜刮下后，转移至2mL无菌离心管内，再用ddH2O 吹打混匀，经水浴超声后，10倍梯度稀释，在LB琼脂平板

53、上测定CFU （详细信息参照附 录 Xp）；d. Peg lid培养的生物被膜：将lid上生物被膜用ddH2O清洗后，经水浴超声后，10倍梯度 稀释，在LB琼脂平板上测定CFU （详细信息参照附录Xq）:T/CI 0112021e. 管式培养的生物被膜：将管内生物被膜洗脱后，转移至10mL禺心管内，ddH20清洗后， 离心收集，用lmLddH2O重悬。经水浴超声后，10倍梯度稀释，在LB琼脂平板上测定 CFU （详细信息参照附录Xr）。5.3.3观察与定量结果展示11-1psq/nu-o5601图9.玻璃珠生物被膜CFU测定5.3.4技术要点a. 所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注

54、意须使用灭菌器具并用酒精消毒操 作台以及所使用的器具，避免交叉污染；b. 所有超声破碎步骤须在冰上操作或在仪器中加入碎冰以保持低温，避免温度过高影响细 菌活性；c. 此处使用的超声水浴条件只限于CFU计数法使用，如后续需进行其他步骤，超声条件须 按需调整；d. 涂布稀释菌液须选择多个稀释浓度，静置培养后选择菌落数量在30-300个的稀释浓度作 为计数浓度，避免菌落数量过低或过高导致误差；e. 涂布好的平板在培养前须晾干表面，并在培养过程中倒置与培养箱内，避免生成水珠滴 在平板表面，影响计数结果；f. 如细菌须36小时以上的培养时间，须用透气封口膜密封平板，防止琼脂蒸发造成干裂影 响计数结果。5

55、.4干重/湿重定量法干重/湿重定量法将整体生物被膜包括胞外聚合物和死活菌体的干重或湿重定量。本方 法适用于直接测定整体生物被膜绝对重量，用于比较生物被膜形成能力、数据均一化等实验 21T/CI 0112021与分析。此方法原料与操作简单，适用于玻片培养（4.1.2）与管式培养（4.2.1）的生物被膜 样品，但通量较低。误差较大，并且无法分辨死菌与活菌数量。5.4.1实验材料a. 玻片培养和管式培养的生物被膜样本（参考3.1.3和3.2.1培养方法）；b. 无菌培养皿；c. 无菌刮刀；d. 无菌ddH2O （可按需使用PBS溶液或生理盐水）；e. 2 mL和10 mL无菌离心管；f. 100 |iL移液器和1 mL移液器；g. 100 和ImL移液器枪头；h. 10 mL无菌针管；i. 废液罐；j. SpeedVac恒温干燥仪。5.4.2操作流程a. 玻片培养的生物被膜：将玻片上生物被膜刮下后，转移至2mL无菌离心管内，离心后移 除上清，测定生物被膜湿重，若需测定生物被膜干重，则将生物被膜SpeedVac恒温状态下 将生物