正交实验设计优化血脉疏通口服液水提工艺-

1、正交实验设计优化血脉疏通口服液水提工艺易生富1,陈兵2,孙亚楠1(1.湖北中医药高等专科学校,荆州434020;2.湖北省荆州市中医院药剂科,荆州434010摘要目的优化血脉疏通口服液水提工艺方法以加水量煎煮时间煎煮次数为考察因素进行正交实验,采用3因素3水平正交设计,以黄芪甲苷总多糖及80%醇浸出物量作为指标值结果煎煮次数和加水量对黄芪甲苷总多糖及80%醇浸出物量具显著影响,优选煎煮提取工艺为煎煮3次,加12倍量水,煎煮0.5h结论该实验确定了血脉疏通口服液的最佳提取工艺关键词血脉疏通口服液;正交实验;水提工艺;黄芪甲苷中图分类号R286;TQ460.1文献标识码A文章编号1004-0781

2、(201403-0382-04血脉疏通口服液为湖北省荆州市中医院自制中药制剂(自制制剂批准文号:鄂药制字Z20110885,由赤芍黄芪牛膝防风桃仁地龙葛根石菖蒲等组成,具益气活血通脉的作用,用于治疗因气虚血瘀所致的冠心病心绞痛及脂肪肝有很好疗效,治疗冠心病心绞痛患者70例,总有效率93.33%;治疗脂肪肝患者176例,总有效率89.16%12方中牛膝黄芪赤芍葛根桃仁等药含皂苷类黄酮类和多糖类,考虑水煎煮法提取;石菖蒲防风含挥发油,在提取挥发油后,再与赤芍黄芪牛膝葛根桃仁等药合煎为了保证制剂质量,笔者在本实验中采用正交实验设计法,优化血脉疏通口服液煎煮提取工艺1仪器与试药1.1仪器Waterse

3、2695高效液相色谱仪,Empower 工作站,Waters2424蒸发光散射检测器(美国沃特士公司;OhausAR124CN型电子分析天平(奥豪斯仪器上海有限公司;UV3000型可见紫外分光光度计(日本岛津;高速离心机(美国MICRO12-241.2试药黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110683200916,血脉疏通口服液(自制,批号:20120119,规格:每支10mL,乙腈为色谱纯,葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110976200903,其他试剂为分析纯2方法与结果2.1样品的制备按处方比例,称取石菖蒲6g防风8g,按提油工艺提油,滤过得药液和药渣备用按处方

4、比例,称取黄芪30g赤芍10g牛膝10g桃仁8g葛根10g地龙8g与石菖蒲防风提油后的药渣混合,按规定的加水量煎煮时间煎煮次数提取过滤收稿日期2013-07-05修回日期2013-08-22作者简介易生富(1966-,男,湖北荆州人,主任药师,学士,主要研究方向:中药制剂电话:0716-*,Email: yishenfu浓缩并定容至100mL(每毫升含生药0.9g2.2单因素实验按 2.1”项样品的制备方法,分别调整加水量8,10,12,14倍,煎煮时间0.5,1.0,1.5, 2.0h,煎煮次数1,2,3,4次,进行单因素实验2.2.1加水量的影响在煎煮时间为1h,煎煮1次,加水量从8倍增加

5、到12倍时,总多糖含量黄芪甲苷含量80%醇浸出物量增加较多但当加水量增至14倍后,总多糖含量黄芪甲苷含量近乎没有变化,80%醇浸出物量增加缓慢因此,加水量应选定为约12倍宜2.2.2煎煮次数的影响在加水量为12倍,煎煮时间1h,随着煎煮次数的增加,总多糖含量黄芪甲苷含量80%醇浸出物量相应增加当煎煮次数增加到4次以后,总多糖含量黄芪甲苷含量增加缓慢,80%醇浸出物量有增加但杂质增加较多因此煎煮次数选为3次宜2.2.3煎煮时间的影响在加水量为12倍,煎煮3次的条件下,随着煎煮时间的延长,总多糖含量黄芪甲苷含量80%醇浸出物量增加缓慢,考虑到节约工时,煎煮时间选为0.5h2.3正交实验设计选取煎煮

6、时间加水量煎煮次数3个因素,各取3个水平进行L9(34正交实验黄芪是方中君药,黄芪甲苷是其主要有效成分,以黄芪甲苷含量评价指标,权重系数定为0.5;黄芪中多糖为有效成分,方中牛膝葛根防风也含有多糖,因此总多糖含量作为另一个评价指标,权重系数定为0.3;80%醇浸出物为大类成分作为间接控制的指标,权重系数定为0.2,以此筛选最佳提取工艺3综合评分=0.5×黄芪甲苷含量+0.3×总多糖含量+0.2×80%醇浸出物量正交实验表见表1,22.4黄芪甲苷的含量测定2.4.1分析方法的选择黄芪甲苷含量测定方法文献报道有高效毛细管电泳法薄层扫描法高效液相色谱蒸发光散射检测法半高

7、效液相色谱质谱串联法等47本实验采用HPLCELSD检测法8表1正交实验因素水平表水平加水量(A/倍煎煮时间(B/h煎煮次数(C/次180.51210 1.02312 1.532.4.2色谱条件色谱柱:Kromasil C18柱(250mm×4.6mm,5m;流动相:乙腈水(3565;检测器:蒸发光散射检测器200s;柱温35;漂移管温度65;气体流量:1Lmin-1;进样量:10L;理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于30002.4.3对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的黄芪甲苷标准品2mg于10mL量瓶,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀即可得到0.2mgmL-1对照品溶液2.4.4供试品

8、溶液的制备精密吸取各正交实验样品溶液10mL,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20mL,合并正丁醇液,用氨试液洗涤2次,每次20mL,弃去氨液,正丁醇液水浴蒸干,残渣加水5mL 使溶解,通过D101型大孔吸附树脂(内径1.5cm,长12cm,用水50mL洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30mL洗脱,弃去40%乙醇洗脱液,继用70%乙醇50mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并转移至2mL量瓶,加甲醇至刻度,摇匀即得9102.4.5标准曲线的绘制精密量取对照品溶液1,2, 4,6和8mL分别置于10mL量瓶,分别加甲醇稀释定容,摇匀,即得0.02,0.04,0.08,0.12和0.16mgmL

9、-1对照液取以上溶液各20L注入高效液相色谱仪,记录色谱峰以峰面积(Y与浓度( X,gmL-1进行回归,绘制标准曲线,得回归方程: Y=58102X+1052.7,r=0.9993(n=5结果表明,样品在0.43.2gmL-1浓度范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系2.4.6阴性干扰的判断照供试品溶液的制备方法制备缺黄芪的阴性对照品溶液,依照上述色谱条件进行测定,供试品溶液色谱图中,在与对照品溶液色谱图相应的位置上有相同的色谱峰,而阴性对照品溶液无相应的色谱峰2.4.7精密度实验对已配制的1.6gmL-1黄芪甲苷标准品溶液,在色谱条件下连续进样5次,分别测定峰面积,计算RSD为0.58%(n=

10、52.4.8稳定性实验取供试品溶液,分别在0,2,4, 6,8,10,12h测定进样10L,记录峰面积,计算RSD,结果RSD为0.47%(n=7,表明供试品溶液在12h 内稳定2.4.9重复性实验取1.6gmL-1黄芪甲苷标准品溶液5份,在色谱条件下进样测定峰面积,RSD为0.53%(n=5,重复性良好2.4.10加样回收率实验量取供试品溶液20L5份,各加入不同量的对照品溶液,按 2.4.5”项方法测定峰面积,计算回收率结果见表3平均加样回收率98.8%,RSD=1.02%2.4.11样品含量测定精密量取各供试品溶液20L注入高效液相色谱仪,在色谱条件下记录色谱峰,将峰面积代入回归方程中,

11、得到溶液中黄芪甲苷的浓度,进一步计算得到黄芪甲苷的含量结果见表22.5总多糖含量测定总多糖含量测定方法文献报道有蒽酮硫酸法苯酚硫酸法3,5二硝基水杨酸法(DNS法等1113笔者在本实验中采用苯酚硫酸法2.5.1对照品溶液的制备精密称取105干燥至恒重的无水葡萄糖标准品60mg置于100mL量瓶,加纯化水溶解至刻度,即得0.6mgmL-1对照品溶液2.5.2苯酚溶液的配制精密称取苯酚4.0g于100mL量瓶,加水溶解至刻度,即得4%苯酚溶液,移至棕色瓶中保存2.5.3标准曲线的绘制精密量取对照品溶液0.0, 1.0,1.5,2.0,3.0,4.0mL分别转移到50mL量瓶,加水稀释至刻度,摇匀精

12、密量取上述各溶液2.0mL置10mL具塞试管,分别精密加入4%苯酚溶液1.0mL,摇匀,迅速精密加入浓硫酸7.0mL,摇匀,沸水保温15min,取出后迅速用冷水冷却至室温,以第一份为空白对照液,在400600nm波长范围内扫描,得最大吸收波长为487nm在487nm波长处,测定各对照品吸光度,以浓度(Y为横坐标吸光度(X为纵坐标绘制标准曲线,回归方程为Y=0.0226X+0.0089,r= 0.9996(n=52.5.4样品溶液的配制精密吸取各样品浓缩液,加无水乙醇4mL,边加边振摇,使含醇量达80%, 2000rmin-1离心20min,沉淀以水溶解,转移到50mL量瓶,加水稀释至刻度,摇匀

13、2.5.5精密度实验按 2.5.3”项方法重复测定同一浓度葡萄糖对照品溶液5次,计算测定结果RSD为0.61%2.5.6稳定性实验取样品溶液,按 2.5.3”项方法表2正交实验结果表序号A B C D评价指标/%黄芪甲苷/(mgmL-1总多糖/(mgmL-180%醇浸出物综合评价111129.9922.41 6.423.0122246.4027.007.932.9133356.0232.657.639.3212340.0138.938.933.5223156.9644.277.943.4231241.3123.527.229.2313259.4835.898.642.2321342.9227.

14、247.931.3332155.7836.439.240.6J95.298.783.5107.0CT=11053.02J106.1107.6107.0104.3J114.1109.1124.9104.1JJ31.732.927.835.7JJ35.435.935.734.8JJ38.036.441.634.7R J 6.3 3.513.8 1.0Q11113110741134011054SS6021.07287.4 1.75A:加水量(倍;B:煎煮时间(h;C:煎煮次数(次;D:空白在室温每隔30min测定一次,连续3h考察其稳定性,计算测定结果的RSD为1.21%2.5.7样品含量测定精密吸

15、取项样品溶液2.0mL,置10mL具塞试管,分别精密加入4%苯酚溶液1.0mL,摇匀,迅速精密加入浓硫酸7.0mL,摇匀,沸水保温15min,取出后迅速用冷水冷却至室温以纯化水为空白,同法制得空白对照品液在487nm波长处测定吸光度,根据标准曲线回归方程计算总多糖含量结果见表22.680%醇浸出物量测定取各正交实验号浓缩液10mL,加无水乙醇40mL,使乙醇浓度达到80%,静置过夜,取上清液于干燥蒸发皿中,水浴蒸干,105烘箱干燥34h至恒重,取出,迅速移至干燥器中放冷,取出精密称重即得结果见表2表3黄芪甲苷加样回收率实验结果mg,n=5样品量加标量测得量mg回收率/% 0.0480.050.

16、099102.0 0.0500.050.09998.0 0.0490.050.09796.0 0.0510.050.101100.0 0.0490.050.09898.02.7方差分析对正交实验结果作直观分析和方差分析方差分析见表4表4方差分析表方差来源离差平方和SS自由度V方差M SF P 60.00230.0034.09<0.0521.70210.5311.97>0.05287.102143.70163.30<0.01误差 1.7520.88F0.05(2,2=19.00,F0.01(2,2=99.00由直观分析可知,影响提取效果的因素顺序为:煎煮次数加水量煎煮时间经方差

17、分析,煎煮时间对提取效果无显著影响,为节约工时,定为B1,煎煮次数和加水量有显著影响,以A3C3为宜2.8验证实验验证3批结果见表5RSD值< 3%,表明所筛选的提取工艺条件基本稳定3讨论方中黄芪为君药,黄芪甲苷和多糖为黄芪的主要有效成分14,现代药理研究表明黄芪甲苷具有保护心脏和肝脏抗细胞凋亡免疫调节改善血液流变学等作用15,黄芪多糖具有增强免疫系统保肝降血糖表5验证实验结果%,n =3成分123均值(mgmL -1RSD /%黄芪甲苷59.6159.0260.3359.65 1.1总多糖36.5635.5035.8335.96 1.580%醇浸出物8.69.18.98.82.2降血脂

18、抗氧化延缓衰老等药理活性16,故将黄芪甲苷含量作为评价工艺优劣的重要指标方中臣药牛膝,佐药葛根防风也含有多糖,因此将总多糖含量作为提取工艺的另一个评价指标,80%醇浸出物为大类成分,作为间接控制指标,以此筛选最佳提取工艺具有一定的科学性按正交实验所筛选的最佳提取条件,本实验还比较了石菖蒲防风二药提油后药渣不再与黄芪赤芍等药合煎水提和二药提油后药渣与黄芪赤芍等药合煎水提两种方法主要有效成分的影响结果表明,分煎后出膏率降低近10%,黄芪甲苷含量无影响,总多糖含量近无影响,为降低出膏率,给后续除杂工艺降低难度,可以考虑将提取路线定为:石菖蒲防风二药提油后药渣弃去,药液与黄芪赤芍等药水提液合并参考文献

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