第一讲分光光度技术

1、高级生化与分子生物学技术高级生化与分子生物学技术食品与生物工程学院生物工程教研室主讲人：李爱贞 杜翠红第一讲第一讲 分光光度技术分光光度技术1 概述2 朗白比尔定律3 显色反应4 显色剂5 测量误差及测量条件6 紫外-可见分光光度计7 分光光度技术的应用 非光谱法： 如折射法，浊度法，旋光法不以光的波长为特征讯号，比较有色溶液颜色深浅。 光谱法：光光学学分分析析法法1 1 概述概述在光（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来来鉴别物质或测定其含量的技术。分为：吸光光度法，发射光谱法真空紫外光度法：10200 nm（远紫外光） 紫外吸光光度法：200400

2、nm（近紫外区） 可见吸光光度法：400750 nm 红外光度法：2.51000 m4电磁波谱波谱区名称 波长范围频率范围(MHZ)跃进能级类型 射线 0.0050.14nm6101421012核能级X射线0.000110nm3101431010 内层电子能级远紫外光10200nm 310101.5109 内层电子能级近紫外光200400nm1.51097.5108原子及分子的阶电子或成键电子能级可见光 400750nm7.51084.0108原子及分子的阶电子或成键电子能级近红外光 0.752.5m4.01081.2108分子振动能级中红外光 2.550m1.21086.0106分子振动能级

3、远红外光 501000m6.01063105分子转动能级微波 0.1100cm31053102分子转动能级射频 11000m31020.3电子自旋/核自旋 当光线通过某种物质的溶液时，透过当光线通过某种物质的溶液时，透过光的强度会减弱。因为它分成了三部光的强度会减弱。因为它分成了三部分：在溶液的表面反射或分散；溶液分：在溶液的表面反射或分散；溶液中物质所吸收；透过溶液。入射光中物质所吸收；透过溶液。入射光= =反反射光射光+ +分散光分散光+ +吸收光吸收光+ +透过光透过光 “空白空白”校正：在检测过程中，若用蒸馏水或待测溶液校正：在检测过程中，若用蒸馏水或待测溶液的溶剂作为的溶剂作为“空白

4、空白”校正反射、分散等因素所造成的入校正反射、分散等因素所造成的入射光的损失，则：射光的损失，则：入射光入射光( (I I。)=)=吸收光吸收光+ +透过光透过光( (I) I)光谱分析技术的分类光谱分析技术的分类 分子吸收法: 可见与紫外分光光度法、红外光谱法 分子光谱 分子发射法: 分子荧光光度法光谱技术 原子吸收法：原子吸收法 原子光谱 原子发射法：发射光谱分析法、原子荧光法等 透过光强度与有色溶液中吸收物质的分子数量c以及透过溶液的厚度L有关。是紫外可见吸收法定量分析的基础。 I0：入射光强度 C:溶液浓度 b:液层厚度 I:透射光强度 T:透光度 A:吸光度 k:吸光系数kbcIIT

5、100kbcTIIIITA1lglglglg00bI0I2 朗伯-比尔定律 1.入射光为单色光单色光。波长范围越大，单色光纯度越低，偏离越大； 2.溶液中邻近分子的存在并不改变每一给定分子的特性，即分子间互不干扰。 3.适用于分子吸收和原子吸收分子吸收和原子吸收。朗伯-比尔定律的适用条件9吸光度可加性原理员工队伍规划现有员工队的描述未来的员工队伍预测差距分析 某一波长的入射光通过几个相同厚度的不同溶液，其总的吸光度为各溶液吸光度之和。同样如果溶液中含同样如果溶液中含有不同的吸光物质，只要各组分间没有相互作用，溶液有不同的吸光物质，只要各组分间没有相互作用，溶液的总吸光度为各组分吸光度之和的总吸

6、光度为各组分吸光度之和。 吸光度可加性原理是十分有用的，例如进行光度分进行光度分析时，试剂或溶剂有吸收，则可从所测总吸光度中直接析时，试剂或溶剂有吸收，则可从所测总吸光度中直接进行扣除，进行扣除，这就是以试剂或溶剂做空白的依据。10 3 3 显色反应及其影响因素显色反应及其影响因素分光光度法对显色反应的要求分光光度法对显色反应的要求l 选择性好、干扰少或干扰容易消除。l 灵敏度高。一般选择生成有色化合物的摩尔吸光系摩尔吸光系数高数高的显色反应。 l 有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。 l 有色化合物的化学性质应足够稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度变化很小。 l 有色化合物与显色剂之

7、间的颜色差别要大。 11 显色剂的用量 溶液的酸度 显色温度 显色时间 溶剂 溶液中共存离子的影响 影响显色反应的因素影响显色反应的因素 4 4 显色剂显色剂无机显色剂 因生成的络合物不够稳定，灵敏度和选择性不高，目前应用较少。常用的有硫氰酸盐、钼酸铵和过氧化氢等。有机显色剂 该类显色剂大都属于含有生色团和助色团的化合物。在有机化合物分子中，一些含有不饱和键的基团，它们能吸收大于200nm波长的光，这种基团称为广义的生色团。大多数有机显大多数有机显色剂与金属离子生成极稳定的鳌合物，且具有特征的颜色，故色剂与金属离子生成极稳定的鳌合物，且具有特征的颜色，故选择性和灵敏度都较高。选择性和灵敏度都较

8、高。不少鳌合物宜溶于有机溶剂，可以进行萃取比色，这对进一步提高灵敏度和选择性很有利。 5 测量误差和测量条件的选择测量误差和测量条件的选择 测量误差测量误差 化学误差（经化学反应将待测组分转变为包括有色化合物及各种络合物的过程）、仪器的误差、人为的误差。 测量条件的选择测量条件的选择 pH、溶剂、温度、测定时间（时间曲线）、入射光波长（最大吸收峰波长、次吸收峰波长）、参比溶液。14 测量相对误差与吸光度的关系测量相对误差与吸光度的关系 分光光度计都有一定的测量误差，实践证明，吸光度在0.200.80内测量的相对误差较小。相对误差的最小的部分在透光度为36.8处(或吸光度为O.4343处)。解决

9、办法： 控制被测溶液的浓度 选择不同的比色皿（比色皿的光程长度为10、30、50、100mm，吸光度小的要用长的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。） 15 参比溶液的选择参比溶液的选择被测液中仅显色剂与待测组分生成有色化合物，而显色剂与其他试剂无色，溶液中亦无其他有色离子时，可用蒸馏水或去离子水作为参比溶液。除显色剂与待测组分所生成的化合物有色外，溶液中亦存在其他有色离子，而且显色剂无色，此时可用不加显色剂的被测液作为参比溶液。当显色剂本身具有颜色时，则用显色剂溶液作为参比溶液。如果显色剂和被测溶液都有色时，可将一份试液加入适当掩蔽剂，把被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂反应，再加入与

10、被测溶液相等的显色剂和其他试剂，这样的参比溶液能消除共存组分的干扰。6 6 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计 分光光度计分光光度计: :能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器。 分析精密度高分析精密度高 测量范围广测量范围广 分析速度快分析速度快 样品用量少样品用量少 射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光根据使用的波长范围不同分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。紫外紫外- -可见分

11、光光度计：可见分光光度计：工作波段在工作波段在200nm200nm800nm800nm的分光光度计。的分光光度计。 200nm200nm400nm400nm为为紫外光区紫外光区。 400nm400nm800nm800nm为为可见光区可见光区。 721 可见分光光度计可见分光光度计 722系列系列 可见分光光度计可见分光光度计 SP-756P紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 TENSOR系列红外光谱仪系列红外光谱仪 0.208紫外紫外- -可见分光光度计的基本结构和工作原理可见分光光度计的基本结构和工作原理紫外紫外- -可见分光光度计的基本结构示意图可见分光光度计的基本结构示意图 光源（光源

12、（light sourcelight source）：）：提供入射光的装置。 要求: 1.能在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱； 2.有足够的辐射强度并能长时间稳定。常用的光源有热辐射灯（钨灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等。几种常见光源比较几种常见光源比较光源波长范围(nm) 特 点3202500钨丝易蒸发，寿命短。用于可见光区卤钨灯3202500加入卤素使用寿命延长，稳定性好185375用于紫外区氘灯185375发光强度比氢灯高35倍汞灯254734用于紫外或荧光分析仪单色器（单色器（MonochromatorMonochromator）：）：是将

13、来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的装置。 入射狭缝：限制杂散光进入； 色散元件：将复合光分解为 单色光，有棱镜和光栅两种； 准直镜：将来自色散元件的 平行光束聚集在出射狭缝上； 出射狭缝：将固定波长范围 的光射出单色器，可以限制 通带宽度。吸收池（吸收池（absorption cellabsorption cell）：）：是用来盛放被测溶液的器件。在可见光区常用无色光学玻璃或塑料制作；在低于低于350 350 nmnm的的紫外区需用能透紫外线的石英或熔凝石英制作。 同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射应严格保持一致。 指纹、油污及池壁上的沉淀物都会影响吸收池的透光性能。

14、微型吸收池（微型吸收池（Microdrill absorption cellMicrodrill absorption cell） ：“光程/体积比”提高了近10倍。 多光路吸收池（多光路吸收池（Multipie-path absorption Multipie-path absorption cellcell）：）：在吸收池壁上装有反射镜，使光线在溶液中经多次反射后才离开吸收池，大大增加了有效光程，提高了测定的灵敏度。通过改进吸收池的几何形状，可提高“光程/体积比”，即尽可能延长单位体积的光程。常用的有：检测器：检测器：把光信号转换为电信号的装置。 对检测器的要求： 产生的电信号与照射到它上

15、面的光强有恒定的函数关系； 波长响应范围大； 灵敏度高； 响应速度快，一般要求小于10-8s； 产生的电信号易于检测、放大，噪声低。几种常用检测器比较几种常用检测器比较检测器 工 作 原 理 特 点光电管外光电效应简单,灵敏度低光电倍增管外光电效应与多级二次发射体相结合灵敏度比光电管高200多倍光电二极管阵列外光电效应，由一行光敏区和二行读出寄存器构成可同时检测多个波长的光强度。寿命长、光谱响应范围宽、可靠性高、读出速度快光电池内光电效应结实、便宜、使用方便。但产生的电流大小不稳定电荷耦合器件模拟集成电路芯片能同时多谱线检测，极大地提高分析速度7 7 分光光度技术的应用分光光度技术的应用 A

16、测定溶液中物质的含量测定溶液中物质的含量比色法比色法：测定标准溶液(浓度已知的溶液)和未知液(浓度待测定的溶液)的吸光度，将两者进行比较。 Ax/As=KCxL/KCsL，即：即： Cx=AxCs/As式中式中Cx代表未知液的浓度，代表未知液的浓度，Cs代表标准液的浓度，代表标准液的浓度，Ax和和As分别代表未知液和标分别代表未知液和标准液所测得的吸光度值，式中只有准液所测得的吸光度值，式中只有Cx是未知的，可由上式计算得之。是未知的，可由上式计算得之。分光度法：分光度法： 先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制绘制标准曲线，标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线。 测定出未知液的吸

17、光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。 含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，最大吸收波长，原因： 灵敏度大灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异； 可以避免其他物质的干扰避免其他物质的干扰。 B 用紫外光谱鉴定化合物 使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法：用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度。以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。 各种物质有其特定的吸收光谱曲线 通过比较未知物质与已知物质的吸收光谱曲线形状（吸收高峰和低谷的波长）来确定 紫外光吸收是由不饱和的结构不饱和的结构造

18、成的，含有双键双键的化合物能表现出吸收峰。 紫外光吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外光吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。 除了特殊情况外，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个未知物的结构，必须与其他方法配合。 紫外光吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度定量分析和纯度分析。分析。使用分光光度计注意事项 仪器须安放在稳固的工作台上，不能随意搬动。严防震动，潮湿和强光直射。 盛装比色液时，约达比色皿2/3体积，不宜过多或过少。若不慎使溶液流至比色皿外面须用棉花或拭镜纸擦干，才能放入比色架。拉比色杆时要轻，以防溶液溅出，腐蚀机械。 千万不可用手或滤纸等物摩擦比色皿的透光面。 比色皿用后应立即用自来水冲洗干净，若不能洗净，用5%中性皂溶液或洗衣粉溶液浸泡，也可用新鲜配制的重铬酸钾洗液短时间浸泡，然后用水冲洗干净，倒置晾干。 每套分光光度计上的比色皿和比色皿架不得随意更换。 试管或试剂不得放置于仪器上，以防试剂溅出腐蚀机壳。 如果试剂溅在仪器上，应立即用棉花或纱布擦干。 测定溶液浓度的光密度值宜在0.10.8之间最符合光吸收定律，线性好，读数误差较小。如光密度超过0.11.0范围，可调节比色液浓度，适当稀释或加浓，再进行比色。