生物化学实验课件：实验五 DNS法分析蛋白质N-末端氨基酸

1、DNS法分析蛋白质法分析蛋白质N-末端氨基酸末端氨基酸 标准氨基酸和所分析蛋白质的DNS化 DNS蛋白质的酸水解（水解管封管、温度等） 聚酰胺薄膜层析（展层剂的选择和配制、毛细管点样、展层装置） 紫外灯下的观察蛋白质结构分析有关方法 蛋白质要求很纯 一级结构分析（氨基酸序列分析）：N、C-末端的测定判断肽链数；拆分肽链；各肽链氨基酸序列分析；二硫键位置的确定。 立体结构分析：各种光谱分析；X-光衍射分析；质谱及核磁共振等分析。有关资料序列测定序列测定（sequencing）已有50多年的历史，但开始时进展十分缓慢。最初，人们致力于建立蛋白质蛋白质和多肽的多肽的分离技术，并确定其氨基酸种氨基酸种

2、类及含量。1945以前，没有任何蛋白质序列定量测定的方法。以后十年中，由于色谱技术和标记方法的快速进展，第一个多肽激素（胰岛素）的全序列测定于1955年完成（Ryle等，1955）。五年后，第一个酶（核糖核酸酶）序列测定完成（Hirs等，1960年）。1965年，约有20个含100多个残基的蛋白质序列被确定。截止1980年，这一数字已达1500个。而今天，已测定的蛋白质序列已达30万个，这在50年前是难以想象的。 最初，蛋白质序列测定主要采用手工的埃德曼降解和环甲基埃德曼降解和环甲基化化（Edman deglation - dansylation）方法（Edman，1950年）。蛋白质序列测定

3、的快速进展，应该归功于自动测序仪的研制成功。与埃德曼和贝格于1967年发明的测序法相比，1980年开始使用的自动测序仪的灵敏度提高了近1万倍。质谱技术的发展为蛋白质序列测定开辟了新的途径。第一次用这种方法测定完整的蛋白质分子是在1997年。质谱法测序的突出优点是可以识别翻译后修饰翻译后修饰而得到的特殊氨基酸。用其它方法进行蛋白质序列测定时，这种修饰信息无法获得。正是利用了质谱技术，人们得出了r-氨基丁酸处于凝血素N-末端的重要结论。DNS法分析蛋白质法分析蛋白质N-末端氨基酸的原理末端氨基酸的原理 蛋白质的-氨基与丹磺酰氯（DNS-Cl是一种荧光物质）在碱性条件下反应，生成DNS-蛋白质，经酸

4、水解可生成DNS-氨基酸。通过聚酰胺薄膜层析分析DNS-氨基酸，可确定蛋白质的N-末端氨基酸。此法灵敏度高，也可用于蛋白质的氨基酸组成的测定。1、-氨基与丹磺酰氯的反应反应条件：pH9.0-9.5，室温2-4小时或40中反应2小时。2、 DNS-蛋白质的酸水解1、DNS氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105水解22小时，除DNS色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77)，丝氨酸(35)，甘氨酸(18)，丙氨酸(7)部分被破坏外，其余DNS氨基酸很少破坏。2、DNSC1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、-氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-赖氨酸和DNS-O酪氨酸

5、较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，层析后在层析图谱的位点上，都与DNS-氨基酸有区别。3、DNS-C1在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，在DNS-C1过量时，会产生DNSNH2，DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开。 3、乙酸乙酯抽提 DNS-氨基酸在酸性条件下(pH23)一般都可被乙酸乙酯抽提，然后取乙酸乙酯层点样层析，这样大量DNS-C1的反应副产物DNS-OH可留于水相，干扰因素减少，所得层析图谱清晰。但若是DNS-精氨酸，DNS-天冬氨酸，DNS-谷氨酸，DNS-苏氨酸，DNS-丝氨酸则它们

6、大部分或部分留于水相，往往会被遗漏，而导致错误结论。这时可将样品浓缩干，用甲醇直接溶解后点样，由于上述DNS-氨基酸的层析位置都位于DNS-OH的下侧，影响不大，这一点在测定多肽或蛋白质的N末端时要特别注意。1、DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为001g。聚酰胺薄膜层析是1966年后发展起来的一种新层析技术。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。2、聚酰胺是类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)，对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能达到分离物分离的目的。3、聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶薄膜制成的。4、聚酰胺薄膜层析实验方法聚酰胺薄膜层析点样 层析注意事项1、点样斑点不宜太大，用毛细管可分2