第3章紫外可见分光光度法

1、第一节、紫外第一节、紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱第二节、朗伯第二节、朗伯-比尔定律比尔定律第三节、紫外可见分光光度计第三节、紫外可见分光光度计第四节、分析条件的选择第四节、分析条件的选择第五节、第五节、 测定方法测定方法 紫外可见分光光度法是利用被测物质对光紫外可见分光光度法是利用被测物质对光的的吸收特征吸收特征和和吸收强度吸收强度对物质进行对物质进行定量定量和和定性定性的分析方法。按吸收光的波长区域不的分析方法。按吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外可见分光度法。法，合称为紫外可见分光度法。 l(1)灵敏度较高灵敏度较高(

2、10-410-6g/ml) l(2)精密度和准确度较高精密度和准确度较高(0.20.5%) l(3)选择性较好选择性较好l (4)仪器设备简单、费用少、分仪器设备简单、费用少、分l 析速度快、易于掌握和推广析速度快、易于掌握和推广l (5)应用范围广应用范围广第一节、紫外第一节、紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱一、电子跃迁类型一、电子跃迁类型 2.分子轨道分子轨道 轨道轨道： 电子围绕分子或原子运动的几率。电子围绕分子或原子运动的几率。 分子轨道分子轨道：当两个原子靠近而结合成分子时，两当两个原子靠近而结合成分子时，两 个原子个原子 的原子轨道以线性组合而成。的原子轨道以线性组合而成。COHnp

3、 ps sH1.分子中价电子类型：分子中价电子类型：电子，电子， 电子，n电子3.有机化合物常见的跃迁类型有：有机化合物常见的跃迁类型有： * 、 n* 、*、n* 其相对能量大小次序为：其相对能量大小次序为：* n* *n*。成键轨道成键轨道：两个分子轨道中能量较低：两个分子轨道中能量较低 的轨道，如的轨道，如 、 。反键轨道反键轨道：两个分子轨道中能量较高：两个分子轨道中能量较高 的轨道，如的轨道，如 * 、 * 。非键轨道非键轨道：n电子能级基本保持不变电子能级基本保持不变 。s sp p *s s *RKE,Bnp p En*跃迁跃迁特征：发生在饱和烃；需要特征：发生在饱和烃；需要辐射

4、能量很大；辐射能量很大； 吸收峰在远紫外区，吸收峰在远紫外区， max 104，属于强吸收；孤立，属于强吸收；孤立*跃迁吸收峰在跃迁吸收峰在200nm左右；随着共轭双键的增左右；随着共轭双键的增多，所需能量越小，吸收峰长移；多，所需能量越小，吸收峰长移； max随溶剂极性增随溶剂极性增加而向长波方向移动加而向长波方向移动，称为红移，称为红移(长移长移)。*跃迁跃迁特征：发生在含有杂原子的不饱和化合物中；特征：发生在含有杂原子的不饱和化合物中；比较小，比较小，10100；吸收峰在近紫外区，；吸收峰在近紫外区， 200400nm ；max随溶剂极性增加而向短波方随溶剂极性增加而向短波方向移动向移动

5、，称为紫移，称为紫移(或蓝移、短移或蓝移、短移)。n*跃迁（跃迁（200400nm）l1.吸收曲线：l2.峰：l3.谷：l4.肩峰：l5.末端吸收：l6.生色团(chromophore)：l含有*跃迁，跃迁， n*跃迁的基团跃迁的基团7.助色团助色团(auxochrome) ：含有非键电子的杂原子饱和基团8.红移：红移： max向长波方向移动9.紫移紫移: max向短波方向移动一些助色团一些助色团- -OH、- -NH2、 - -OR、- -SH、- -Cl，当它们与，当它们与生色团相连时，使生色团的生色团相连时，使生色团的max红移，且红移，且增大。增大。10.增色效应：增色效应：吸收强度增

6、加吸收强度增加11.减色效应：减色效应：吸收强度减弱吸收强度减弱12.强带：强带： max10413.弱带：弱带： max102 在金属配合物中，一个电子从配位体轨道跃迁到中心离子的轨道上去，产生的光吸收谱带在紫外可见区域。这种光谱带的max 很大，用这类光谱进行定量分析可以得到很高的测定灵敏度。所以，在实际的分析工作中，常将待测的金属离子在实际的分析工作中，常将待测的金属离子与某种配体与某种配体(显色剂显色剂)作用，使之生成具有电荷迁作用，使之生成具有电荷迁移的配合物，然后进行测定。移的配合物，然后进行测定。无机化合物对光的吸收无机化合物对光的吸收1f电子跃迁吸收光谱：镧系和锕系元素；电子跃

7、迁吸收光谱：镧系和锕系元素；2d电子跃迁吸收光谱：过渡金属离子的电子跃迁吸收光谱：过渡金属离子的d电子电子3电荷迁移光谱电荷迁移光谱lR带：由n*跃迁引起，是杂原子的跃迁引起，是杂原子的不饱和基团的特征。不饱和基团的特征。 max 300nm，l 104， max随溶剂极性增加而向长波方向移动K K R R p pp pp p n p p B带：芳香族化合物的特征吸收带。的特征吸收带。 max 230-270 nm =200， p p p p*与与苯环苯环骨架振动引起；含取代基时，骨架振动引起；含取代基时， B带红移，简化。带红移，简化。 max（nm） max苯254200甲苯261300间

8、二甲苯2633001，3，5-三甲苯266305六甲苯272300E带：芳香族化合物的特征吸收带。的特征吸收带。 由苯环中三个乙烯的环状共轭结构的由苯环中三个乙烯的环状共轭结构的p p p p*引起，分引起，分为为E1(180 nm =4.7104)，E2(200 nm 7000)带。带。苯和取代苯在异丙烷溶液中的紫外吸收图谱双键羰基与苯环共扼,使得：(1) K带强；苯的E2带与K带合并，红移；(2)取代基使B带简化苯环上助色基团对吸收带的影响苯环上助色基团对吸收带的影响四、影响紫外四、影响紫外-可见吸收光谱的因素可见吸收光谱的因素在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。在低在室温范围内，温度

9、对吸收光谱的影响不大。在低温时，由于分子的热运动降低，邻近分子间的能量温时，由于分子的热运动降低，邻近分子间的能量交换减少，产生红移，吸收峰变得比较尖锐，吸收交换减少，产生红移，吸收峰变得比较尖锐，吸收强度有所增大。温度较高时，分子的碰撞频率增加，强度有所增大。温度较高时，分子的碰撞频率增加，谱带变宽，谱带精细结构消失。谱带变宽，谱带精细结构消失。1温度温度 CCHHCCHH顺式顺式 max=283nm；max=12300反式：反式： max=295 nm；max=25000共平面产生最大共轭效应，共平面产生最大共轭效应， max大大p p电子电子作用，使得相当于作用，使得相当于n*跃迁的跃迁

10、的R带波长长移，同时带波长长移，同时吸收增强；此外羰基的吸收增强；此外羰基的轨道与杂原子的轨道与杂原子的P轨道能够轨道能够有效交盖时也会出现跨环效应。有效交盖时也会出现跨环效应。OH2CSCO. max=238nm； max=2535 214nm处显示中等强度的吸收带，同时在284nm处出现R带 对物质的紫外可见光谱的测定，大多是在溶液中进对物质的紫外可见光谱的测定，大多是在溶液中进行的，由于使用的溶剂不同，同一种物质得到的紫行的，由于使用的溶剂不同，同一种物质得到的紫外可见吸收光谱可能不一样。外可见吸收光谱可能不一样。4溶剂效应溶剂效应 max(正己烷正己烷) max(氯仿氯仿) max(甲

11、醇甲醇) max(水水)pppp*230238237243npp*329315309305溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响结论：结论：当溶剂极性增大时当溶剂极性增大时n*跃迁紫移，跃迁紫移， *跃迁红移，跃迁红移， 当溶剂极性增大时当溶剂极性增大时n*跃迁紫移，跃迁紫移， *跃迁红移，跃迁红移， 非极性 极性n p*跃迁：紫移；移； ； p p*跃迁：红移； ；极性溶剂使精细结构消失1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮 测定有机分子的紫外可见吸收光谱时，对溶剂要求：测定有机分子的紫外可见吸收光谱时，对溶剂要求：极性较小、能很好地溶解被测物；

12、极性较小、能很好地溶解被测物；形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；在样品的吸收光谱区无明显吸收；在样品的吸收光谱区无明显吸收；如果要与标准品的吸收光谱相比较，须用相同的溶剂。如果要与标准品的吸收光谱相比较，须用相同的溶剂。很多化合物都具有酸性或碱性可解离基团，在不同很多化合物都具有酸性或碱性可解离基团，在不同pH的溶液中，分子的解离形式可能发生改变，其的溶液中，分子的解离形式可能发生改变，其吸收光谱的形状、吸收光谱的形状、max和吸收强度可能不一样。和吸收强度可能不一样。OHO-OH-H+5pH值的影响值的影响max 210.5nm ,270nm m

13、ax 235nm,287nm利用标准试样对未知物进行鉴定时，对两者吸收光利用标准试样对未知物进行鉴定时，对两者吸收光谱中峰的位置、数目和吸收强度进行比较，如果两谱中峰的位置、数目和吸收强度进行比较，如果两者完全一致，就可初步判断者完全一致，就可初步判断可能可能为同一种物质；如为同一种物质；如果有明显差别，果有明显差别，肯定肯定不是同一种物质不是同一种物质 。五、紫外五、紫外-可见吸收光谱的应用可见吸收光谱的应用1.对比吸收光谱的特征数据：对比吸收光谱的特征数据： max、E 11cm、(一一)、定性分析、定性分析l不只一个吸收峰的化合物，可用不同吸收峰处测得吸光度的比值作为鉴别的依据。1112

14、22AE lEAElEV-B12的鉴别的鉴别规定在规定在361nm与与278nm吸光度的比值应为吸光度的比值应为1.701.88；361nm与与550nm吸光度的比值吸光度的比值应为应为3.153.45（1）与标准品对照（2）与文献标准图谱对照（标准谱图库：46000种化合物紫外光谱的标准谱图） The sadtler standard spectra ,Ultraviolet (二二)、纯度鉴定、纯度鉴定1.1.杂质检查：杂质检查：当甲醇中含有少量苯时，被污染甲醇的紫外吸当甲醇中含有少量苯时，被污染甲醇的紫外吸收光谱在收光谱在256nm处就会出现苯的特征吸收。处就会出现苯的特征吸收。2.杂质

15、的限量检测：杂质的限量检测：肾上腺素中的杂质肾上腺酮不得超过肾上腺素中的杂质肾上腺酮不得超过0.6%。其具。其具体方法是：用体方法是：用0.05mol/L的的HCl溶解肾上腺素制成溶解肾上腺素制成2mg/ml的溶液，在的溶液，在1cm吸收池中，于吸收池中，于310nm处测处测定吸光度定吸光度A。规定。规定A0.05。可以推定分子骨架，判断发色团之间的共轭关系可以推定分子骨架，判断发色团之间的共轭关系和估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目和估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目 。(三三)、结构分析、结构分析有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱1.饱和碳氢化合物饱和碳氢化合物只产生

16、只产生*跃迁，所需能量很大，跃迁，所需能量很大，200400nm没有吸收，常作为溶剂。没有吸收，常作为溶剂。 发生n* 跃迁，所需能量小于*跃跃迁所需能量，故吸收峰长移。迁所需能量，故吸收峰长移。 杂原子的电负性越小和离子半径越大，杂原子的电负性越小和离子半径越大，n电子能级电子能级越高，越高，n *跃迁所需能量小，吸收峰波长越长。跃迁所需能量小，吸收峰波长越长。（1）孤立助色团）孤立助色团发生n* 、 n* 、*跃迁，孤立*跃跃迁吸收峰在迁吸收峰在150180nm间。间。（2）孤立生色团化合物）孤立生色团化合物醛和酮有三个吸收峰醛和酮有三个吸收峰n* 190nmn* 275295nm* 15

17、0180nm 共轭体系使得*跃迁所需能量变小，吸收峰长移，吸光系数增大，化合物由无色变为有色。*跃迁略在200nm处，有两个强吸收峰，同时在280nm处有n*吸收峰。吸收峰。（1）. *长移长移到到200260nm，吸光系数略为，吸光系数略为10000； n*跃迁跃迁长移到长移到310350nm，吸光系数小于，吸光系数小于100。当溶剂极性增大时当溶剂极性增大时n*跃迁紫移，跃迁紫移， *跃迁红移，跃迁红移， 电子共轭，使得电子共轭，使得成键的成键的轨道和反键的轨道和反键的*轨道的能级提高，而成轨道的能级提高，而成键的键的轨道能量提高得更大，这样使得轨道能量提高得更大，这样使得*跃迁跃迁所需能

18、量降低，吸收峰长移。所需能量降低，吸收峰长移。n电子能量不变，电子能量不变， *轨道的能级提高，使得轨道的能级提高，使得n*跃迁所需能量增大，吸收峰短移跃迁所需能量增大，吸收峰短移苯苯：最简单的芳香族化合物，具有环状共轭体系，*跃迁可产生E1、E2和B。B带的精细结构在极性溶剂中消失。苯环上有取代基使得苯的三个带都长移，吸光系数增大，B带的精细结构也因取代基的变化而变得简单（1）苯和取代苯吸电子取代基：-NH3+ -SO2NH2 -COO- -CN- -COOH CHO -NO2 取代基不同，长移效应也不同供电子取代基：-CH3 -Cl -Br -OH -OCH3 -NH2 -O -NHCOC

19、H3 10 104 4，B B带长移带长移. .生色团取代基生色团取代基 饱和五元环和六元环的吸收峰都小于200nm；五元不饱和杂环化合物，如呋喃、噻吩、吡咯相当于环戊二烯的CH2被杂原子取代，但杂原子上的n电子参与共轭，因此，他们的紫外光谱与环戊二烯相似。（2）芳杂环化合物六元氮芳杂环与相应的芳烃相似，但B带强度增大，精细结构简化甚至消失。如苯与吡啶，萘与喹啉。有机化合物的结构研究有机化合物的结构研究(1)200-400nm 无吸收峰。饱和化合物，单烯。(2) 270-295 nm有吸收峰（=10-100）醛酮 n* 跃迁产生的R 带。(3) 250-300 nm 有中等强度的吸收峰(=20

20、0-2000)，芳环的特征 吸收(具有精细解构的B带)。(4) 200-250 nm有强吸收峰(104)，表明含有一个共轭体系(K)带。共轭二烯：K带(230 nm)； 不饱和醛酮：K带230 nm ，R带310-330 nm。260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰，35个双键的共轭体系。1.从吸收光谱中初步推断官能团从吸收光谱中初步推断官能团 松香酸 左旋松香酸max 238nm 273nm 15100 7100COOHH3C2.异构体的推定异构体的推定COOHH3C（1）光学异构体（2）顺反异构体顺式：max=280nm； max=10500反式：max=295.5 nm；max

21、=29000共平面产生最大共轭效应， max大CCHHCCHH（3）互变异构体 酮式：max=204 nm；无共轭 烯醇式：max=243 nm H3CCH2CCOEtOOH3CCHCCOEtOHO 未知化合物与已知化合物的紫外吸收光谱一致时，可以认为两者具有同样的发色团，据此可以推断未知化合物的骨架。如维生素K1(A)有吸收带： max=249 nm (lg4.28)，260nm (lg4.26) ，325nm (lg3.28) 。这与已知的1,4-蒽醌的光谱比较，发现维生素K1(A)与2,3-二烷基-1,4蒽醌(B)的吸收带很相近。OOCH3CH2CH CCH2(CH2CH2CHCH2)2

22、CHCH3CH3CH3CH33.化合物的骨架推定化合物的骨架推定OORRABI0入射光强度入射光强度 Ia吸收光强度吸收光强度It透射光强度透射光强度 Ir反射光强度反射光强度第二节、朗伯第二节、朗伯-比尔比尔(Lambert-Beer)定律定律1.透光率和吸光度透光率和吸光度I0IaItIr在吸光度分析中，通常将被测溶液和参比溶液分别在吸光度分析中，通常将被测溶液和参比溶液分别置于置于同样材料和厚度的吸收池同样材料和厚度的吸收池中，让强度为中，让强度为I0的单的单色光分别通过两个吸收池，再测量透射光的强度。色光分别通过两个吸收池，再测量透射光的强度。因为，反射光强度基本相同，其影响可相互抵消

23、，因为，反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，I0IaItI0IaItIr溶液的透光度越大，表示它对光的吸收越小；溶液的透光度越大，表示它对光的吸收越小；反之，透光度越小，表示它对光的吸收越大。反之，透光度越小，表示它对光的吸收越大。 透光率透光率TIt /I0A值越大，表明物质对光的吸收越大。透光度和值越大，表明物质对光的吸收越大。透光度和吸光度都是表示物质对光的吸收程度的一种量度，吸光度都是表示物质对光的吸收程度的一种量度，透光度以百分数表示，吸光度为一无因次的量。透光度以百分数表示，吸光度为一无因次的量。吸光度吸光度(absorbance)物质对光的吸收程度物质对光的吸收程度A-lgTE

24、cl 或或 T10-A10-ECL2.朗伯朗伯-比尔定律比尔定律朗伯定律朗伯定律(1760年年)当用一种适当波长的当用一种适当波长的单色光单色光照射一固定浓度的照射一固定浓度的溶液时，其溶液时，其吸光度与光透过的液层厚度成正比吸光度与光透过的液层厚度成正比Akll液层厚度液层厚度k比例系数比例系数朗伯定律对所有的均匀吸收介质都适用。朗伯定律对所有的均匀吸收介质都适用。比尔定律比尔定律(1852年年)当用一适当波长的当用一适当波长的单色光单色光照射一溶液时，若照射一溶液时，若液层厚度一定液层厚度一定 ，则，则吸光度与溶液浓度成正比吸光度与溶液浓度成正比Akcc溶液浓度溶液浓度k比例系数比例系数比

25、尔定律不是对所有的吸光溶液均适用比尔定律不是对所有的吸光溶液均适用k比例常数，与吸光物质的本性、入射比例常数，与吸光物质的本性、入射 光波长、溶剂及温度等因素有关。光波长、溶剂及温度等因素有关。 如果溶液的浓度如果溶液的浓度(c)和透光液层厚度和透光液层厚度(l)是不固是不固定的，就必须同时考虑定的，就必须同时考虑c和和l对吸光度的影响对吸光度的影响Akcl朗伯朗伯-比尔定律比尔定律当用适当波长的当用适当波长的单色光单色光照射一溶液时，吸光度与溶照射一溶液时，吸光度与溶液浓度及液层厚度的乘积成正比。液浓度及液层厚度的乘积成正比。朗伯朗伯比尔定律比尔定律适用于均匀、非散射介质，但不适用于非单色光

26、和适用于均匀、非散射介质，但不适用于非单色光和浓度大的溶液浓度大的溶液。 不同的物质对同一波长的单色光，可有不同的吸光不同的物质对同一波长的单色光，可有不同的吸光系数，吸光系数越大，表明该物质的吸光能力越强，系数，吸光系数越大，表明该物质的吸光能力越强， 灵敏度越高，所以吸光系数是定量和定性的依据。灵敏度越高，所以吸光系数是定量和定性的依据。3、吸光系数、吸光系数 （1）物理意义）物理意义吸光物质在单位浓度及单位厚度的吸光度。吸光物质在单位浓度及单位厚度的吸光度。在给定单色光、溶剂和温度等条件下，吸光系数是物在给定单色光、溶剂和温度等条件下，吸光系数是物质的特性常数，表明物质对某一特定波长的吸

27、收能力。质的特性常数，表明物质对某一特定波长的吸收能力。.AkC l（2）吸光系数的两种表示方法吸光系数的两种表示方法 Akcl摩尔吸光系数摩尔吸光系数：l 以以 cm，c 以以 molL 为单位时，称为为单位时，称为摩尔吸光系数，用摩尔吸光系数，用表示，表示， 的单位为的单位为L(mol.cm)。表示物质的浓度为表示物质的浓度为1molL，液层厚度为液层厚度为lcm时溶液的吸光度时溶液的吸光度此时：此时：Ac l 百分吸光系数或比吸光系数：百分吸光系数或比吸光系数：c 为为 1g100ml，l 为为 1cm 时的吸光度值，用时的吸光度值，用E11cm 表示。表示。E11cm与与间的关系为间的

28、关系为Akcl(/ ).AC mol L l(%)/100 .1000AClM.(%)10AMCl1%1.10cmME（3）吸光系数的大小，取决于物质）吸光系数的大小，取决于物质(溶质、溶剂溶质、溶剂)的本性、温度和光的波长。的本性、温度和光的波长。1）物质不同，则吸光系数不同，吸光系数为物）物质不同，则吸光系数不同，吸光系数为物 质的特征常数。质的特征常数。2）溶剂不同，同一物质吸光系数亦不同。所以）溶剂不同，同一物质吸光系数亦不同。所以 在说在说 明吸光系数时，应注明溶剂。明吸光系数时，应注明溶剂。3）一般情况下，）一般情况下， 1054)光的波长不同，其吸光系数亦不同。光的波长不同，其吸

29、光系数亦不同。如将不同波长的单色光依次通过被分析物如将不同波长的单色光依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度- -波波长曲线，称为吸收曲线，又称吸收光谱长曲线，称为吸收曲线，又称吸收光谱 .AC l（4）吸光系数的测定）吸光系数的测定1%1.cmAC lE例1：某物质的摩尔质量为236，将其配成浓度为0.4962mg/100ml的溶液，盛于1cm吸收池中，在max355nm处测得处测得A0.557,求求E 11cm与与。解：解：c= 0.4962mg/100ml=0.0004962g /100mlE 11cmA/(c.l)=0.577/(0.000

30、4962 . 1)=1122.5 =(M/10). E 11cm=26492用准确浓度的稀溶液测定吸光度来换算可得吸光系数用准确浓度的稀溶液测定吸光度来换算可得吸光系数例2.称取V-C 0.05g溶于100ml的0.005mol/L硫酸溶液中，再准确取液2.00ml稀释到100ml，取此液于1cm吸收池中在max245nm处测得处测得A0.551,求其百分含求其百分含量。已知量。已知E 11cm（245nm）= 560。解：解： cA /(E 11cm.l ) =0.551/(560 . 1) = 9.839 10-4g/100ml = 9.839 10-6g/ml 试样中V-C的质量为m=

31、9.839 10-6g/ml 50 100ml=0.049195g试样中V-C的百分含量为p%=0.049195/0.05=98.39% 例3.称取样品 0.0500g溶于250ml容量瓶中，加入0.02mol/LHCl溶液，准确取液2.00ml稀释到100ml， 以0.02mol/LHCl溶液为空白溶液，取此液于1cm吸收池中在263nm处测得处测得T41.7%,求试样的求试样的E 11cm （263nm）和百分含量。已知）和百分含量。已知= 12000，M=100.0。c-1gT /(.l ) =-lg0.417/(12000 . 1) =3.16610-5mol/l样品中试样的质量为m=

32、3.16610-5mol/l 50 0.25 l 100g/mol =0.03958g样品中试样的百分含量为p%=0.03958/0.05=79.169% 解：解： E 11cm =(10/M) =12004.吸光度的加和性吸光度的加和性测定混合物组分含量的依据测定混合物组分含量的依据A11c1 lA22c2 lA33c3 lA=A1A2+A3+5、偏离比尔定律的因素、偏离比尔定律的因素遵守比尔定律遵守比尔定律负偏离负偏离正偏离正偏离(1) 吸光物质的浓度吸光物质的浓度 比尔定律通常只用于稀溶液比尔定律通常只用于稀溶液(2)光的散射光的散射 当试样有胶体、乳浊液或悬浮物质存当试样有胶体、乳浊液

33、或悬浮物质存在时，入射光通过溶液后，有在时，入射光通过溶液后，有 部分光会因散射而部分光会因散射而损失，使吸光度增大，导致对光吸收定律的偏离。损失，使吸光度增大，导致对光吸收定律的偏离。 (4) 仪器因素仪器因素 仪器光源不稳定、实验条件的偶然变仪器光源不稳定、实验条件的偶然变动、吸收池厚度不一致等仪器的问题，都会给测定动、吸收池厚度不一致等仪器的问题，都会给测定带来一定的误差，导致对光吸收定律的偏离。带来一定的误差，导致对光吸收定律的偏离。(3) 化学因素化学因素 如果被测组分在试液中发生离解、缔如果被测组分在试液中发生离解、缔合、光化或互变异构等作用，可能使被测组分的浓合、光化或互变异构等

34、作用，可能使被测组分的浓度发生变化，度发生变化， 导致对光吸收定律的偏离。导致对光吸收定律的偏离。经过分光后用于测量的是一小段波长范围的复合光，经过分光后用于测量的是一小段波长范围的复合光， 由于吸光物质对不同波长光的吸收能力不同，导致对由于吸光物质对不同波长光的吸收能力不同，导致对朗伯朗伯- -比尔定律的偏离。在所使用的波长范围内，吸比尔定律的偏离。在所使用的波长范围内，吸光物质的吸收能力变化越大，这种偏离就越显著。光物质的吸收能力变化越大，这种偏离就越显著。 (5)非单色光非单色光 朗伯比尔定律是以单色入射光为前提。朗伯比尔定律是以单色入射光为前提。谱带谱带A A的吸光系数变化不大，的吸光

35、系数变化不大，谱带谱带B B的吸光系数变化较大的吸光系数变化较大max 一、主要部件一、主要部件第三节第三节 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计组成示意图紫外可见分光光度计组成示意图(一一)光源光源热辐射光源热辐射光源气体放电光源气体放电光源钨灯和卤钨灯钨灯和卤钨灯可见光可见光区区 玻璃比色皿玻璃比色皿氢灯和氘灯氢灯和氘灯紫外光区紫外光区 石英比色皿石英比色皿一种把来自光源的复合光分解为单色光，一种把来自光源的复合光分解为单色光，并分离出所需波段光束的装置，是分光光度并分离出所需波段光束的装置，是分光光度计的关键部件。其主要组成为入射狭缝，出计的关键部件。其主要组成为入射狭

36、缝，出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。射狭缝、色散元件和准直镜等部分。(二二)单色器单色器(monochromator)把来自入射狭缝的光束转化为平行光，然后投向色把来自入射狭缝的光束转化为平行光，然后投向色散元件，并把色散后的平行光束聚焦于出射狭缝上散元件，并把色散后的平行光束聚焦于出射狭缝上1.入射狭缝入射狭缝限制杂散光进入限制杂散光进入2. 准直镜准直镜3.出射狭缝出射狭缝将额定波长的光波射出单色器将额定波长的光波射出单色器4色散元件色散元件(1)棱镜棱镜玻璃玻璃 棱镜棱镜可见光区可见光区石英棱镜石英棱镜紫外光区紫外光区多数用平面反射光栅，用于紫外、可见及红外光谱区域多数用平面反射光栅，

37、用于紫外、可见及红外光谱区域(2)光栅光栅 2.空白溶液的空白溶液的吸收池与盛试样溶液的吸收池相匹配吸收池与盛试样溶液的吸收池相匹配3.3.测定吸光系数或用吸光系数进行定量时要用同一测定吸光系数或用吸光系数进行定量时要用同一 吸收池吸收池4.4.吸收池有毛玻璃面和光面，要注意保护光面吸收池有毛玻璃面和光面，要注意保护光面5.5.光径吸收池最为常用。光径吸收池最为常用。(三三)吸收池吸收池又称比色皿或比色杯，分光光度分析中盛放样品液的容器又称比色皿或比色杯，分光光度分析中盛放样品液的容器1.吸收池的选择吸收池的选择 玻璃吸收池玻璃吸收池可见光区可见光区 石英吸收池石英吸收池紫外光区和可见光区紫外

38、光区和可见光区检测光信号，即将光信号转变为电信号。现在使用的分检测光信号，即将光信号转变为电信号。现在使用的分光光度计大多采用光电管和光电倍增信号管以及光电二光光度计大多采用光电管和光电倍增信号管以及光电二 极极 管阵列作为检测器管阵列作为检测器(四四)检测器检测器(五五)信号显示系统信号显示系统常用的信号显示装置有直读检流计、电位调节常用的信号显示装置有直读检流计、电位调节指零装置、以及自动记录和数字显示装置等。指零装置、以及自动记录和数字显示装置等。 二、紫外可见分光光度计的类型和光学性能二、紫外可见分光光度计的类型和光学性能单波长分光光度计单波长分光光度计双波长分光光度计双波长分光光度计

39、双光束分光光度计双光束分光光度计单光束分光光度计单光束分光光度计类类 型型(一一)单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计光源：钨灯或氢灯光源：钨灯或氢灯型号：国产型号：国产721型、型、751型、型、XG-125型型 英国英国SP500型、伯克曼型、伯克曼DU-8型等型等721型分光光度计采用自准式棱镜色散系统，型分光光度计采用自准式棱镜色散系统，波长范围为波长范围为360-800nm，用钨灯作光用钨灯作光 源，光电管作检测器源，光电管作检测器 1. .光源：光源：2. .聚光透镜；聚光透镜；3. .色散棱镜；色散棱镜；4. .准直镜；准直镜；5. 保护保护玻璃；玻璃； 6. .狭缝；狭

40、缝；7. .反射镜；反射镜；8. .光栏；光栏；9. .聚光透镜；聚光透镜；10. .吸吸收池；收池；11. .光门；光门；12. .保护玻璃；保护玻璃；13. .光电管光电管 从同一光源发出的光分为两束，分别经过两个单色从同一光源发出的光分为两束，分别经过两个单色器后，得到两束不同波长器后，得到两束不同波长(1和和2)的光，利用切光的光，利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，最器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，最后由检测器显示出两个波长下的吸光度差值后由检测器显示出两个波长下的吸光度差值(A) （二）双波长分光光度计（二）双波长分光光度计1.波长范围：195820nm2.

41、波长准确度：仪器显示的波长数值与实际 波长值 间的误差，0.5nm3.波长重复性：重复使用同一波长，单色光实 际波长的变动值，0.5nm4.透光率测量范围：0150（T）5.吸光度测量范围：-0.1730+2.00(A)6.光度准确度：以透光率测量值的误差 表示， 0.57.光度重复性：同样情况下重复测量透光 率的变动性： 0.58.分辨率：单色器分辨两条靠近的谱线的 能力。260nm处0.3nm9.杂散光：通常以测光讯号较弱的波长处 所含杂散光的强度百分比为指标根据被测组分的吸收光谱，选择根据被测组分的吸收光谱，选择最强吸收带的最大吸收波长最强吸收带的最大吸收波长(max)为入射光波长，这样

42、可以得到最大为入射光波长，这样可以得到最大的测量灵敏度，称为的测量灵敏度，称为最大吸收原则最大吸收原则。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低、峰形稍平坦的往往选用吸收稍低、峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。次强峰或肩峰进行测定。 第四节第四节 分析条件的选择分析条件的选择(一一)、仪器条件的选择、仪器条件的选择1入射光波长的选择入射光波长的选择一、条件的选择一、条件的选择maxlg0.4343dTdTl dcT 0.4343TlcT 0.4343lgcTcTT2吸光度范围的选择吸光度范围的选择A-lgTlc微分微分cc浓度的相对误差浓度的相对误差T透光度

43、的读数误差透光度的读数误差 设设T=0.01，根据上式可计算出不同吸光度值时的浓，根据上式可计算出不同吸光度值时的浓度相对误差，以度相对误差，以T为横坐标，为横坐标， 为纵坐标作图为纵坐标作图cc透光度太大或太小，浓透光度太大或太小，浓度的相对误差均较大；当度的相对误差均较大；当透光度在透光度在20至至65，即，即吸光度在吸光度在0.2-0.7时，浓度时，浓度的相对误差较小；的相对误差较小；误差最误差最小 的 一 点 其 透 光 度 为小 的 一 点 其 透 光 度 为0.368，吸光度为，吸光度为0.4343，当当T=0.01时，时，c/c = 2.7。 通常将吸光度控制通常将吸光度控制0.

44、20.7范围内范围内浓浓度度相相对对误误差差Tcc例例4.含含Fe3+某样品溶解后，加入显色剂某样品溶解后，加入显色剂KSCN溶液，生溶液，生成红色配合物，用成红色配合物，用1cm吸收池在分光光度计吸收池在分光光度计420nm波长波长处测定，已知该配合物在上述条件下处测定，已知该配合物在上述条件下 =1.8104，如，如该药物含该药物含Fe3+约为约为0.5%，现于配制，现于配制50ml试液，为使测试液，为使测定相对误差最小应该称取该样品多少克？（定相对误差最小应该称取该样品多少克？（MFe=55.85）x=0.0135g 解：设称取应该该样品解：设称取应该该样品x克克cA /(.l ) =0

45、.434/(18000 . 1)=2.41110-5mol/Lc（x0.005/55.85）/0.053狭缝宽度的选择狭缝宽度的选择 一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的 l/10狭缝狭缝入射光单色性入射光单色性灵敏度降低灵敏度降低曲线偏离定律曲线偏离定律狭缝狭缝能量小，电子不能发生跃迁能量小，电子不能发生跃迁狭缝宽度影响测定的灵敏度和校正曲线的线性范围。狭缝宽度影响测定的灵敏度和校正曲线的线性范围。吸收池的厚度应一致，透光性能要好；对于吸吸收池的厚度应一致，透光性能要好；对于吸光度光度A0.7的溶液，应选用薄的吸收池，使吸光度的溶液，应选用薄的

46、吸收池，使吸光度A控制在控制在0.2-0.7范围内，从而减小吸光度误差范围内，从而减小吸光度误差 。4吸收池的选择吸收池的选择反应的生成物必须在紫外反应的生成物必须在紫外- -可见光区有较强的吸光可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；能力，即摩尔吸光系数较大；反应应有较高的选择性，被测组分经反应生成的反应应有较高的选择性，被测组分经反应生成的化合物的吸收曲线与其他共存组分的吸收曲线有明化合物的吸收曲线与其他共存组分的吸收曲线有明显的差别；显的差别；反应生成物有足够的稳定性，以保证测量过程中反应生成物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不改变；溶液的吸光度不改变；反应生成物的组成

47、恒定。反应生成物的组成恒定。(二二)、显色条件的选择、显色条件的选择常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应及增常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应及增加生色基团的衍生化反应。这些反应应满足：加生色基团的衍生化反应。这些反应应满足：1显色剂的用量（显色剂的用量（过量、适量、定量过量、适量、定量）Mo(SCN)32+Mo(SCN)5Mo(SCN)6- 浅红浅红 桔红桔红 浅红浅红 显色剂的量是通过实验确定，即保持被测组显色剂的量是通过实验确定，即保持被测组分浓度和其他条件不变，加入不同量的显色分浓度和其他条件不变，加入不同量的显色剂，测定其吸光度剂，测定其吸光度A并作图。并作图。 （a a）：开

48、始随着显色剂用量的增加，吸光度不断增）：开始随着显色剂用量的增加，吸光度不断增加，当增加到一定值时，吸光度不再增加，出现加，当增加到一定值时，吸光度不再增加，出现ab平平坦部分，这意味着显色剂用量已足够了，我们可以在坦部分，这意味着显色剂用量已足够了，我们可以在ab之间选择合适的显色剂用量。之间选择合适的显色剂用量。(a(a )(c(c )(b(b )（b b）：曲线平坦部分很窄，当显色剂用量继续增）：曲线平坦部分很窄，当显色剂用量继续增加时，吸光度将降低。因此必须控制好显色剂的加时，吸光度将降低。因此必须控制好显色剂的用量，才能进行被测组分的测定。用量，才能进行被测组分的测定。（c）：当显色

49、剂的用量不断增大时，吸光度不断）：当显色剂的用量不断增大时，吸光度不断增大，对于这种情况，只有严格控制显色剂的用增大，对于这种情况，只有严格控制显色剂的用量才能进行测定。这种情况一般只用于定性，而量才能进行测定。这种情况一般只用于定性，而不用于定量。不用于定量。显色反应最适宜的显色反应最适宜的pH范围范围可通过实验来确定：测定某可通过实验来确定：测定某一固定浓度的试液的吸光度一固定浓度的试液的吸光度随溶液随溶液pH的变化，以吸光度的变化，以吸光度为纵坐标，溶液为纵坐标，溶液pH为横坐标为横坐标作图，曲线的平直部分，即作图，曲线的平直部分，即吸光度恒定部分所对应的吸光度恒定部分所对应的pH范围就

50、是最适宜的范围就是最适宜的pH范围。范围。2溶液溶液pHpH通过试验测定溶液在某波长下的吸光度随时间通过试验测定溶液在某波长下的吸光度随时间 变化的曲线，以确定显色反应所需的最佳时间。变化的曲线，以确定显色反应所需的最佳时间。 3显色温度显色温度一般均在室温下进行。一般均在室温下进行。显色反应最适宜的温度也显色反应最适宜的温度也是通过实验测定吸光度与温度的变化曲线来选择。是通过实验测定吸光度与温度的变化曲线来选择。要求待测溶液与标准溶液要求待测溶液与标准溶液 在相同温度下进行测定在相同温度下进行测定4显色时间显色时间当试样基体有色当试样基体有色(如试样溶液中混有其它有色离如试样溶液中混有其它有

51、色离子子)，但显色剂无色，且不与试样中被测成分以外，但显色剂无色，且不与试样中被测成分以外的其它成分显色时，可用试样空白校正。所谓试样的其它成分显色时，可用试样空白校正。所谓试样空白，系不加显色剂但按显色反应相同条件进行操空白，系不加显色剂但按显色反应相同条件进行操作的试样溶液作的试样溶液。(三三)、参比溶液的选择、参比溶液的选择1溶剂参比溶溶剂参比溶液液当试样溶液的组成较为简单、共存的其他组分很少且对测定波长的光几乎无吸收时，可采用溶剂作为参比溶液，它可消除溶剂、吸收池等因素的影响。2试样参比溶液试样参比溶液 用不含被测组分的试样，在相同条件下与被测试样同时进行处理， 由此得到平行操作参比溶

52、液。如在进行某种药物浓度监测时，取正常人的血样与待测血药浓度的血样进行平行操作处理，前者得到的溶液即为平行操作参比溶液。3试剂参比溶液试剂参比溶液如果显色剂或其他试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。这种参比溶液可消除试剂产生吸收的影响4平行操作参比溶液平行操作参比溶液一、单组分的定量方法一、单组分的定量方法吸光系数法吸光系数法标准曲线法标准曲线法标准对比法标准对比法(一一)吸光系数法吸光系数法A=c l已知已知 l 和吸光系数和吸光系数或或E1cm1 ，由由A求出被测物的浓度求出被测物的浓度c1%1.cmAAclEl第五节第五节 测定方法测定

53、方法例例5 ：维生素：维生素B12的水溶液在的水溶液在361nm处的处的E1cm1值值是是207，盛于，盛于lcm吸收池中，测得溶液的吸光度吸收池中，测得溶液的吸光度为为0.414，求溶液的浓度。，求溶液的浓度。0.4140.002 /100207 1cgmlA= E1cm1 c l得：得：根据公式根据公式1%1.cmAcEl(二二)标准曲线法标准曲线法 绘制标准曲线应注意以下几点：绘制标准曲线应注意以下几点：(1)按选定浓度，配制一系列不同浓度的标准溶液，浓按选定浓度，配制一系列不同浓度的标准溶液，浓度范围应包括未知试样浓度的可能变化范围。一般至度范围应包括未知试样浓度的可能变化范围。一般至

54、少应作四个点。少应作四个点。(2)测定时每一浓度至少应同时作两管测定时每一浓度至少应同时作两管(平行管平行管)，同一浓，同一浓度平行管测定得到的吸光度值相差不大时，取其平均值度平行管测定得到的吸光度值相差不大时，取其平均值(3)用坐标纸绘制标准曲线。也可用最小二乘法处理，用坐标纸绘制标准曲线。也可用最小二乘法处理，由一系列的吸光度由一系列的吸光度浓度数据求出直线回归方程。浓度数据求出直线回归方程。(4)绘制完后应注明测试内容和条件，如测定波长、绘制完后应注明测试内容和条件，如测定波长、吸收池厚度、操作时间等。吸收池厚度、操作时间等。c1c2在相同条件下测定试样溶液吸光度在相同条件下测定试样溶液

55、吸光度(Ax)和某一和某一浓度的标准溶液的吸光度浓度的标准溶液的吸光度(As)，由标准溶液的，由标准溶液的浓度浓度(cs)可计算出试样中的被测物浓度可计算出试样中的被测物浓度(cx)ssxxAcAc(三三)标准对比法标准对比法As= csl Ax= cxl 同种物质、同台同种物质、同台仪器、同一波长仪器、同一波长、l相同相同.xxssAccA二、多组分的定量方法二、多组分的定量方法( (一一).).各组分的吸收峰所在波长处，其他组分没有吸收各组分的吸收峰所在波长处，其他组分没有吸收Aa=a aca lAb=b bcb laaaAclbbbAcl在在a组分的吸收峰组分的吸收峰1处处b组分无组分无吸收，而在吸收，而在b组分的吸收峰组分的吸收峰2处处a组分有