第十章高效液相色谱法

1、1第十章第十章 高效液相色谱法高效液相色谱法2高效液相色谱法：高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。一、一、HPLC与经典与经典LC区别区别二、二、HPLC与与GC差别差别三、特点三、特点3主要区别：主要区别：固定相、输液设备和检测手段固定相、输液设备和检测手段1经典经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 柱效低（H，n） 常压输送流动相 分析周期长 无法在线检测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱） 柱效高（H，n） 高压输送流动相 分析时间大大缩短 可以在线检测 色谱泵进

2、样器 检测器废液数据处理系统4相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：主要差别：分析对象、流动相、操作条件分析对象、流动相、操作条件的差别的差别1分析对象分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测高聚物的样品不可检测 占有机物的占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品，溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及

3、高分子分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测和离子型样品均可检测 用途广泛，用途广泛，占有机物的占有机物的80%52流动相差别流动相差别GC：流动相为惰性气体，流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 输送流动相压力为220MPaHPLC：流动相为液体，流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 输送流动相压力为0.10.5MPa3操作条件差别操作条件差别 GC：加温操作加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）6三、三、HPLC的特点和应用的特点和应用“

4、三高三高” “一快一快” “一广一广”高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物，广泛用于中药成分分离）7第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪国产P600高效液相色谱仪安捷伦1260高效液相色谱仪8高效液相色谱仪组成高效液相色谱仪组成高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据记录处理系统 9液相色谱流程图液相色谱流程图 色谱泵进样器 检测器废液数据处理系统10一、高压输液系统一、高压输液系统1、 贮液器贮液器（1）作用：）作用：提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析工作。（2）要求：）要求：必须有足够的容积，以备重复分析

5、时保证供液；脱气方便；能耐一定压力；所用的材质对所使用的溶剂都是惰性的。配有溶剂过滤器 2、 脱气装置脱气装置（1）作用：）作用：防止流动相从高压柱流出时，释放气泡进入检测器而使噪音剧增。（2）方法：）方法：吹氦脱气 超声波脱气 真空脱气123、 高压输液泵高压输液泵 关键部件之一。（1）作用：）作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离系统。（2）要求：）要求： 泵体材料能耐化学腐蚀；能在高压（3060MPa）下连续工作；输出流量稳定（ 1%），无脉冲，重复性高（ 0.5%） ，而且输出流量范围宽；适用于梯度洗脱。（3）类型：）类型：恒压泵、恒流泵。输液泵操作注意事项：输液泵操作注意事项

6、：防止固体微粒进入泵体防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气流动相一般应该先脱气154、梯度洗脱装置、梯度洗脱装置（1）作用：）作用：缩短时间，使各组分完全分离。（2）类型：）类型：高压梯度：高压梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。低压梯度：低压梯度：一台高压泵, 通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。16（二）（二） 进样系统进样系统流路中为高压力工作状态，通常使

7、用耐高压的六通阀进样装置。 准备状态准备状态 进样状态进样状态17进样方法进样方法1.1.手动进样手动进样 准备状态准备状态 进样状态进样状态18进样方法进样方法1.1.自动进样（自动进样器）自动进样（自动进样器）19 （三）分离系统（三）分离系统主要部件为色谱柱，一般柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径减小填料粒度和柱径以提高柱效。色谱柱及柱温箱20（四）检测系统（四）检测系统1、紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化应用最广，对大部分有机化合物有响应。合物有响应。可变波长紫外检测器（可变波长紫外检测器（UVD）适于：适于：吸收紫外光的物

8、质。特点：特点：灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm10mm，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。氘灯氘灯190-600nm光栅光栅流通池流通池测量测量光电二极管光电二极管参比参比光电二极管光电二极管分束器分束器21光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器(DAD) 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。222、蒸发光检测器蒸发光检测器(ELSD)蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。233、示差折光检测器示差折光检测器(RID) 除紫外检测器之外应用最多的检测器。除紫外检测器之外应用最多的检测器。原理：原理：每种物质具有不同的折光指数。可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数折光指数差值，差值与浓度呈正比。特点：特点：灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种。244、荧光检测器荧光检测器(FLD)适于