高分辨率溶解曲线PPT课件

1、第1页/共46页内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting） 高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器第2页/共46页第3页/共46页High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的是基于有序列变化的Am

2、plicon之间微弱的之间微弱的Tm值差异，通过值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：第4页/共46页PCRTube 1Tube 2Tube 3Wild typeHomozygoteHeterozygoteLightScanner突变检测原理突变检测原理第5页/共46页Lightscanner高分辨溶解曲线结果高分辨溶解曲线结果第6页/共46页Saturating dyeSaturating dyeLC Green plus LC Green plus 高分辨溶解曲线专用荧光染料高分辨溶解曲线专用荧光染料第7页/共46页内容提示内容提示

3、高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器第8页/共46页未知未知SNPSNP扫描扫描第9页/共46页等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。第10页/共46页Bernhard J

4、. HoWnger Hai-Chun Jing Kim E. Hammond-Kosack Kostya Kanyuka(Barley Application) Theor Appl Genet (2009) 119:851865DOI 10.1007/s00122-009-1094-2 数据来自英国洛桑农业实验站Bernhard等对Barley的eukaryotic translationinitiation factor 4E (eIF4E) gene基因外显子进行突变扫描结果基因外显子进行突变扫描结果第11页/共46页第12页/共46页内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Reso

5、lution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器第13页/共46页Small Amplicon Genotyping扩增小片段直接进行基因型鉴定扩增小片段直接进行基因型鉴定第14页/共46页使用已知Tm值的双链DNA做温度内标，低温内标Tm(

6、61) ,高温内标Tm (92 )内标能够实现96/384孔板的温度均一矫正。PCR片段的Tm值范围： 70-88 优点：不需要探针，直接利用PCR产物针对已知突变位点进行基因分型第15页/共46页第16页/共46页第17页/共46页第18页/共46页为何要使用温度内标为何要使用温度内标第19页/共46页第20页/共46页第21页/共46页第22页/共46页等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯合型CC和TT。第23页/共46页内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melti

7、ng）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器第24页/共46页第25页/共46页第26页/共46页第27页/共46页Class 1 C:T, G:AClass 2 C:A, G:TClass 3 C:GClass 4 A:T第28页/共46页第29页/共46页第

8、30页/共46页第31页/共46页第32页/共46页David De ，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding (2010) 25:6790 rrRRRrMix Rr:rr by 1:1 RrrrMix RR:Rr by 1:1 RRRr第33页/共46页内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分

9、辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器第34页/共46页Rosario Muleo（2009）等用HRM方法对三个品种的SSR DCA4进行分析，DCA4的等位基因有131bp的重复序列，杂合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合

10、样品明显的区分，其中一个等位基因只相差2bp。 三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明3种不同的品种。 Rosario Muleo等得出结论：HRM是一种快速、重复性高、成本低，操作简单，且可以应用于其他物种的SNP检测及SSR基因分型的方法。Rosario Muleo,Marir Chiara Colao,Dario Miano at el. 2009 Genome52:252-260第35页/共46页内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因

11、分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化 HRM仪器第36页/共46页第37页/共46页第38页/共46页第39页/共46页内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small A

12、mplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化HRM仪器第40页/共46页2005LightScanner 96/38496/384 孔板孔板8 分钟分钟/板板2-6 秒秒/样品样品温度均一性：温度均一性： 0.15oC 数据采集速度：大于数据采集速度：大于100pts/秒秒 升温速度：升温速度： 0.1oC/秒秒2010LS32 32 样品转盘样品转盘, 玻璃毛细管玻璃毛细管HRM 检测检测 60 分钟内完成定量分钟内完成定量 PCR 和和 HRM 检测检测 HRM检测升

13、温速度可以在检测升温速度可以在 0.05 0.90oC/秒之间调秒之间调节节在升温速度小于在升温速度小于0.3/秒时，温度均一性：秒时，温度均一性：0.05oC 数据采集速度：数据采集速度：20pts/秒秒400pts/秒（与升温速度有秒（与升温速度有关）关） 0.3oC/秒秒 升温速度升温速度= 67 pts/ 0.05oC/秒秒 升温速度升温速度 = 400 pts/ 第41页/共46页LunaProbesLunaProbes非标记探针基因分型非标记探针基因分型未知未知SNPSNP扫描扫描Small AmpliconSmall Amplicon小片段小片段基因分型基因分型第42页/共46页HRM分析流程分析流程在PCR反应前加入 LCGreen 荧光染料时间大约时间大约2 2小时（包含试剂准备）小时（包含试剂准备）在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析大约需要大约需要5-10 5-10 分钟分钟数据分析和处理大约需要大约需要5-10 5-10 分钟分钟PCR产物可以直接进行下游的测序分析等（如需要）大约需要大约需要30-6030-60分钟分钟第43页/共46页LightScanner适于适于SNP分析分析1.速度、通量LightScanner 510分钟完成96/384孔板的PCR产物检测， 20000个SNP/天 2.可检测未知、已知突变，