生物、化学-常用试剂配制

1、常规试剂配制和测定方法一、溶液的配制1. Mandels 营养盐溶液（1000 mL）名 称重 量（g）硫酸俊（NH4）2SO4）14磷酸二氢钾（KH2PO4）20尿素（H2NCONH2）3硫酸镁（MgSO4 7H2O）3氯化钙（CaCl2 2H2O）4注：用煮沸10 min后的蒸储水配制。2. Mandels微量元素溶液（1000 mL）名 称重 量（g）氯化钻（C0CI2 6H2。）3.7硫酸锌（ZnSO4 7H2O）1.4硫酸锐（MnSO4 H2O）1.6硫酸亚铁（FeSQ 7H2O）5.0注：用煮沸10 min后的蒸储水配制。3. DNS试剂的配制（1000 mL）（1） 取：3,5-

2、二硝基水杨酸 （C7H4N2O7）7.5 g氢氧化钠 （NaOH ）14.0 g充分溶解于1000 mL水中（水预先煮沸10 min）（2） 加入：洒石酸钾钠 （C4H4O6KNaZH2O）216.0 g苯酚（在50 c水浴中融化）5.5 mL偏重亚硫酸钠（Na2s2。5）6.0 g（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置 5天后便可使用，平时盛一小瓶（250 mL）使 用，要放在冰箱中冷藏。此溶液每月配制一次。注意：倒入瓶中时要尽量装满！ ！4 .考马斯亮蓝G-250的配制（1000 mL）称考马斯亮蓝 G-250 100 mg即0.1g溶于50 mL 95%乙醇中，力口入100 mL 85 %

3、磷酸，用蒸储水稀释至1000 mL ,滤纸过滤。最终试剂中含0.01 % （w/v）考马斯 亮蓝 G-250, 4.7 % （w/v）乙醇，8.5 % （w/v）磷酸。5 . 1.0 M柠檬酸缓冲溶液的配制 （1000 mL）名称分子量Mn重量（g）柠檬酸（C6H8。7 H2。）210210NaOH4074.5准确称取柠檬酸210 g,溶于约750 mL煮沸（10 min）蒸储水中，待柠檬酸充 分溶解后加入氢氧化钠74.5 g,完全溶解后将上述溶液转移到 1000 mL容量瓶中， 冷却后将容量瓶定容到1000 mL （原始pH4.45）。（检验方法：取1.0 M柠檬酸缓冲 溶液稀释20倍，测定

4、稀释液的pH值，pH值应为4.8）6 .标准糖溶液的配制和标准方程的测定（1）标准糖溶液的配制准确称取2.000 g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105 c烘干3 h）,蒸储水溶解， 全部转移至1 L容量瓶内，摇匀，配制成2 g/L葡萄糖/木糖溶液。取9个100 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖/木糖溶 液 10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL 依次加 入容量瓶，蒸储水定容，摇匀。即为 0.2 g量、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、 1.2 g/L、1.4 g/L、1

5、.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L 葡萄糖/木糖标准溶液。取6个30 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖溶液10 mL、 12 mL、14mL、16mL、18mL、20 mL依次加入容量瓶,每瓶再加入1.5 mL柠檬酸缓冲液，蒸储水定容，摇匀。即为 1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解 葡萄糖。（2）标准方程的测定：葡萄糖/木糖标准方程的测定取10支25mL刻度管，10支1mL刻度吸管，分别加入0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、 0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L

6、、1.8 g/L、2.0 g/L 葡萄糖/木糖标准溶液 1 mL, DNS溶液3 mL。100 C煮沸5 min,水浴冷却后定容至25 mL,摇匀。以蒸 储水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标 准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N , 723型分光光度计输出方 程为：C = KA + B） 酶解木糖标准方程测定（测定木聚糖酶活力）取6支25 mL刻度管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解木糖标准溶液1.5 mL, DNS溶液3 mL, 100 c煮沸5 min,

7、水 浴冷却后定容至25 mL,摇匀。以蒸储水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以 A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N, 723型分光光度计输出方程为： C = KA + B） 酶解葡萄糖标准方程测定 （测定滤纸酶活力、CMC酶活力）取6支小试管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g 1.2 g、1.4 g、1.6 g 1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖标准溶液1.5 mL, DNS溶液3 mL, 100 C煮沸5 min,水浴冷 却后，量筒定容至50 mL （定容至25 mL,测定CMC酶活力），摇匀。以蒸储水作 为空白对照，5

8、50 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N , 723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）7. 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制PH0.1 mol/L柠檬酸/mL0.2 mol/L磷酸氢二钠/mLPH0.1 mol/L柠檬酸/mL0.2 mol/L磷酸氢二钠/mL2.219.600.405.29.2810.722.418.761.245.48.8511.152.617.822.185.68.4011.602.816.833.175.87.9112.093.015.894.116.07.3712.633.215.

9、064.946.26.7813.223.414.305.706.46.1513.853.613.566.446.65.4514.553.812.907.106.84.5515.454.012.297.717.03.5316.474.211.728.287.22.6117.394.411.188.827.41.8318.174.610.659.357.61.2718.734.810.149.867.80.8519.155.09.7010.308.00.5519.45注：Na2HPO4, Mr =141.98; 0.2 mol/L 溶液为 28.40 g/LNa2HP04 2H2O, Mr =17

10、8.05; 0.2 mol/L 溶液为 35.61 g/LC6H807 H2O, Mr =210.14; 0.1 mol/L 溶液为 21.01 g/L二、酶活力的测定1 .滤纸酶活力的测定一纤维素酶的总体酶活力采用国际理论和应用化学协会（IUPAC）推荐的标准方法测定Ghose,T.K., et al,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268, 一个滤纸酶活力的国际单位（FPIU）等于 在标准反应条件下每分钟生成1仙mo葡萄糖量的酶量。测定方法如下：取7支试管在其中1#-5#支小试管中加入50 mg卷成筒状的滤纸条（1 X6cm）, 适当稀释酶液，取7支试管按下表操

11、作。（5#有底物无酶，6#为有酶无底物空白对照）项 目1#2#3#4#5#6#7#稀释酶液（mL）0.20.30.40.500.5酶解葡锢糖0.05 M柠檬酸缓冲液（mL）1.31.21.11.01.51标样1.5mL将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 C下保温60 min后立即取出加入3 mL DNS试剂，在沸水中反应5 min, 冷却后加水至50 mL并充分摇匀，待滤纸完全沉淀后，取上层精液于 550 nm波长 下测定吸光度A值。反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。以0.2、0.3、0.4、0.5mL酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标，酶量

12、的对数为 纵坐标作图，从图中找出生成 2 mg葡萄糖的酶量，按下式计算样品的滤纸酶活力2 mg葡萄糖(FPA):滤纸酶活力60minx 0.18（mg/仙mO）成2mg葡萄糖的酶量（mL）一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成 1 n mol葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。备注：当加入0.5 mL酶液（指酶液没有被稀释的时候！）仍无法生成2 mg葡萄糖时，按下式计算:滤纸酶活=0.185 M葡萄糖mg数）2 .伊葡萄糖甘酶活力的测定方法一：葡萄糖氧化酶测定法按国际标准方法测定Ghose,T.K.,etal,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268 一个 伊葡萄糖甘酶活

13、力国际单位(IU/mL)等于标准条件下每分钟转化1 n mo底物即生成 2卜mo葡萄糖的酶量来表示。预先用0.05 M的柠檬酸缓冲液配制15 mmol/L的纤维二糖溶液(0.513 g纤维 二糖/100 mL0.05 M的柠檬酸缓冲液，现配现用)(1)每个样品应做三个不同酶量估计任葡萄糖甘酶活力0.9式中：C 木聚糖浓度，g/Lc 水解液中木糖浓度0.9 木聚糖和木糖的转化系数6、每个样品做2 个平行样。注意：木聚糖的聚合度是用cM0除以木聚糖不水解直接测糖的还原物浓度。四、可溶性蛋白质的测定采用Bradford测定方法。测定试剂采用Bradford试剂（Sigma公司）。 常量分析法。取5 个蛋白质标准样品（分别含牛血清蛋白0.2、 0.4、 0.6、 0.8和1.0 mg/mL）, 1个空白对照（蒸储水）和所有待测试样各0.1 mL于10 mL具塞试管中， 顺试管壁分别加入3.0 mL Bradford式剂，将试管小心上下翻转几次使液体混合均匀（注 意尽量不产生泡沫），在加入染色剂后的5-60 min内，于595 nm波长下测定各样品的 吸光度A值。以同样处理的空白作为对照