实验四肌糖原的酵解作用

1、 山东大学实验报告 2011年3月30日姓名 张行润 系年级 2009级生科4班 学号 200900140177 同组者 于潜科目 生物化学实验 题目 肌糖原的酵解作用 仪器编号 105一、 实验目的 1.  学习检定糖酵解作用的原理和方法2.  了解糖酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义二、 实验原理在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行，本实验以动物肌肉组织中肌糖元的酵解过程为例。肌糖元的酵解作用，即肌糖元在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应最后转变成乳酸的过程。肌肉组织中的肌糖元首先与磷酸化合而分解，经过己糖磷酸脂、丙糖磷酸脂、

2、丙酮酸等一系列中间产物，最后生成乳酸。该过程可综合在下列反应式：1/n（C6H5O5）nH2O2CH3CHOHCOOH 糖原 乳酸 肌糖元的酵解作用是糖类供给组织能量的一种方式。当机体突然需要大量的能量，而又供氧不足（如剧烈运动时），则糖元的酵解作用暂时满足能量消耗的需要。在有氧条件下，组织内糖元的酵解作用受到抑制，而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。糖元酵解作用的实验，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜时，必须在无氧的条件下进行；而肌肉提取液，则可在有氧条件下进行。因为，催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三羧酸循环）的酶系统，则集中在线粒体中，糖元可用淀粉代替。淀

3、粉存在于绿色植物的多种组织中（种子、块茎、干果）。糖元是动物和细菌细胞内糖及其所反应的能源的一种储存形式，其作用与淀粉在植物中的作用一样，故有“动物淀粉”之称。糖元或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观察，在除去蛋白质与糖以后，乳酸可以与硫酸共热变成乙醛，后者再与对羟基联苯反应产生紫红色物质，根据颜色的显现而加以鉴定。该法比较灵敏，每毫升溶液含1-5µg乳酸即产生明显的颜色反应，若有大量糖类和蛋白质等杂质存在，则严重干扰测定结果，因此，实验中应尽量除净这些物质。另外，测定时所用的仪器应严格地洗涤干净。实验中所用到的化学反应方程式如下：1. 糖原 ( 糖原磷酸化酶 ) 1- 磷酸 - 葡

4、萄糖 6- 磷酸葡萄糖，进入糖酵解。 1/n(C6H10O5)n+H2O 2CH3CHOHCOOH2. 乳酸的鉴定（灵敏度15微克/毫升）紫红色三、 实验器材 兔肌肉糜、试管及试管架、移液管（5 ml、2 ml、1 ml、0.5 ml）、滴管、量筒（10 ml）、玻璃棒、恒温水浴、小台秤、剪刀及镊子、冰浴。四、 实验试剂0.5%糖元溶液（或0.5%淀粉溶液）、20%三氯乙酸溶液、液体石蜡、氢氧化钙（粉末）、浓硫酸、饱和硫酸铜溶液、1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH7.4）、对羟基联苯试剂；五、 实验步骤1. 制备肌肉糜：将鸡杀死后，立即剥皮，割取背部和腿部肌肉，在低温条件下用剪刀尽量把肌

5、肉剪碎即成肌肉糜，低温保存备用（临用前制备）。2. 肌肉的糖酵解:1) 取4支试管，编号后各加入新鲜肌肉糜0.5g。1、2号管为样品管；3、4号管为空白管。向空白管内加入20%三氯乙酸3ml，用玻璃棒将肌肉糜打散，搅匀，以沉淀蛋白质和终止酶的反应。然后，在每支试管中加入新鲜肌肉糜3ml磷酸缓冲液和1ml0.5%糖原溶液。用玻璃棒充分搅匀，再分别加入少许液体石蜡（试管的3-5mm高度），使它在液面形成一薄层以隔绝空气，并将4支试管同时放入37恒温水浴中保温。2) 1h后，取出试管，立即向样品管内加入20%三氯乙酸3ml，混匀。将各试管内容物分别过滤，弃去沉淀。量取每个样品的滤液5ml，分别加入已

6、编号的试管中，然后向每管内加入饱和硫酸铜溶液1ml，混匀，再加0.4g氢氧化钙粉末，用玻璃棒充分搅匀后，放置10min，并不时振荡，使糖沉淀完全。将每个样品分别过滤，弃去沉淀。3. 乳酸的测定:1) 取4支洁净、干燥的试管，编号，各加入浓硫酸2ml，将试管置于冰浴中冷却。2) 将每个样品的滤液一滴或两滴逐滴加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中，边加边摇动冰浴中的试管，避免局部过热，应注意冷却。3) 将试管内液体混合均匀，放入沸腾的水浴锅中煮沸5min，冷却后，再加入对羟基联苯试剂2滴，勿将对羟基联苯试剂滴到试管壁上，混匀，比较和记录各管溶液的颜色深浅，并加以解释。简约步骤：表1 肌糖原酵解反应实验步

7、骤简表 编号试剂样品空白1234肌肉靡（g）0.520%三氯乙酸（ml）33磷酸缓冲液（ml）30.5%淀粉溶液（ml）1液体石蜡（ml）充分搅拌，加液体石蜡封口，37水浴1h，后吸出石蜡。20%三氯乙酸（ml）33饱和硫酸铜溶液（ml）1氢氧化钙粉末（g）分别加0.4g，充分搅拌，分别过滤。六、 注意事项1. 加液体石蜡隔绝空气，以试管高度的3-5mm为宜；2. 37保温 1小时；3.在乳酸测定中，试管必须洁净、干燥，防止污染；4支试管洗净放入烘箱烘干4.所用滴管大小尽可能一致，减少误差。0.1毫升管；若显色较慢，则可将试管放入37恒温水浴中保温10min，再比较各管颜色。5.影响显色的因素

8、：1) 糖的影响：加Ca(OH)2 和CuSO4去除。2) 蛋白质：加三氯乙酸(TCA)沉淀。3) 无机离子：a) Mg2+是许多酶的辅助因子, 必定影响酶促反应速度。b) Cu2+可增强乳酸的颜色反应。七、 实验结果最终实验结果：样品组两个试管呈紫罗兰色，而空白组两个试管基本呈无色透明状，如下图所示： 图1：肌糖原酵解作用实验结果展示图（空白组（基本透明无色）两个试管在左样品组（紫罗兰色）两个试管在右）由图1可以看出，1、2号样品管中溶液呈紫罗兰色，3、4号空白管中溶液无色，通过样品管与空白管的颜色对照，可判断1、2号样品管中发生了淀粉的酵解，而3、4号空白管未发生反应，所以从实验结果来看本次实验比较成功。八、实验分析实验中用淀粉代替了肌糖元，因为淀粉与肌糖元结构类似，均为葡萄糖分子的高聚糖，糖原比淀粉具有更多的分支，所以在酶分解糖原时具有更多的作用位点，分解更快。因此在可适当延长37中的水浴时间，以使反应更彻底，结果更准确。3、4号管在加入了0.5g肉糜后立刻加入了三氯乙酸，三氯乙酸是蛋白质变性剂，可使肉糜中的蛋白质失活，所以3、4号管加入底物淀粉后