基因工程（课堂PPT）

1、11 基因工程载体第二章基因工程的载体和酶 用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。 在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆克隆载体； 在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达转化载体或表达载体。常用基因工程载体有： 细菌质粒(克隆)； 噬菌体(克隆)； 柯斯质粒(克隆)； 穿梭质粒(克隆/表达)； 细菌人工染色体(克隆/表达)； 酵母人工染色体(克隆/表达)； Ti质粒及其衍生载体(转化)。2载体的要求: 作为载体，应该具有以下一些性能：A、复制：具有能在受体细胞中复制的复制起点，基因工程的目的是要得到基因的无性繁殖系，并且要求得到

2、最大量的某一基因或基因产物，因此一般要求用属于松弛型的质粒作为载体。细菌质粒ColE1是一种常用的载体；B、选择性标记：一般情况下，所要扩增的基因不便于选择，所以作为载体要求具有选择标记。ColE1对于大肠肝菌素E1的免疫性却不是一个理想的标记。R质粒具有最适宜于作为选择性标记的多种抗性基因，但不很安全；3C、限制性酶切位点：对于某一种限制性酶，它的切点数要求是单一的。现在已发展了许多具有多种单一的限制性酶识别位点的载体；D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；E、外源基因的性状表达：结构基因的表达需要启动子；F、载体的安全性：要求质粒不能随便转移。4 A circular piece of

3、autonomously replicating DNA1.1.11.1.1 What is a plasmid?n Originally evolved by bacterian May express antibiotic resistance gene or be modified to express proteins of interestoribla1.11.1质粒载体质粒载体5The many faces of plasmidsGraphicTransmission electron micrographAgarose GelpGLOoriblaGFParaC6pGLOoribl

4、aGFParaCpGLO PlasmidBeta Lactamase Ampicillin resistance Green Fluorescent Protein Aequorea victoria jellyfish genearaC regulator protein Regulates GFP transcription7野生的质粒往往不符合作为载体的要求，因此必须对它们进行改造： A、删除不必要的DNA区域。尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。 B、减少限制性酶切点。缺失突变，限制性酶、核酸外切酶核连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。1.1.21.1.2

5、质粒的质粒的改造8 C、加入易于识别的选择性标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。 D、关于质粒安全性能的改造。灭活质粒在细菌之间转移的mob基因。两个例子pBR322和pUC18/199EcoRI松弛型AprpMB18.4kbpRIdrd100kbpRIdrd100kbColE16.5kbEcoRI松弛型转Apr 至pMB1EcoRIApr松弛型pMB313.3kbEcoRI缩小长度EcoRIpMB826.kbEcoRIHindIIIBamHISalITcrEcoRIPstIHincIIBamHIAprpSF212411.33kbpSC10

6、18.8kbEcoRIEcoRIEcoRIHindIIIBamHISalITcrpMB95.4kb转Apr至pMB9EcoRIHindIIIBamHISalITcrHincIIPstIAprpBR31210kbEcoRI缩小长度EcoRIHindIIIBamHISalITcrHpaISmaIpBR3138.2kbHincIIPstIAprEcoRIH Hi in nd dI II II IB Ba am mH HI IS Sa al lI IT Tc cr rA Av va al lB Ba al lI IP Pv vu uI II IA Ap pr rP Ps st tI IH Hi in

7、nc cI II I10Hindlll 29Clal 24EcoRl 4362 / 0EcoRV 189nHEL 230BamHI 375Banl 474Banl 488Sphl 565Sall,Accl,Hincll 650Xmalll 938Nrul 975BspMI 1063Bsml 1353Styl 1369Aval 1424Ball 1445BspMII 1664Xmnl 2034Pvull 20674285 Aatll4171 Sspl3966 Xmnl3908Hincll3845 Scal3737 Pvul3612 Pstl3435 Ppal30002475 Af/lll2296

8、 Ndel2245 Accl,Snal2217Tth111lamproritetrpBR3224.36kb11EcoO 109 26742622 Aatll2501 Sspl2299 Xmnl2180 Scal2070 Pvul2060 Avall20001922 Mstl1838 Avall1820 Bg/lHgiEll1000Af/lll 806Pvull 631Pvull 309Pvul 280Mstl 259Bg/l 252Narl 237Ndel,HgiEll 185pUC18/pUC19pUC18/pUC192.69kb2.69kblaczlaczlacllaclorioriamp

9、ampr rP Pl la ac c1387多克隆位点121.1.31.1.3质粒的分类及用途人工构建的载体质粒根据其功能和用途可分为下列6类： A、克隆质粒。用于克隆和扩增外源基因，它们或者含有能为氯霉素扩增的松弛型复制子结构，如pBR系列；或者复制子经过人工诱变，解除对质粒拷贝数的负调控作用，使质粒在每个细胞中可达数千个复制拷贝。13PstIPstITetrA Am mp pr rT Te et tr rp pB BR R3 32 22 2P Ps st tI IP Ps st tI IP Ps st tI IDNA 连接酶转换细菌TetrTetrAmps质粒pBR322为载体的克隆过程1

10、4 B、测序质粒。这类质粒通常高拷贝复制，并含有Polylinker,便于各种DNA片段的克隆与扩增。在Polylinker的两端含有两个不同的引物序列（T3/T5），使得重组质粒经碱变性后即可进行DNA测序反应，如pUC18/pUC19系列。另一种测序质粒是M13噬菌体DNA与质粒DNA的杂合分子，如M13mp系列，它们在受体细胞中复制后，可以特定的单链DNA形式分泌到细胞外，克隆在这种质粒上的外源基因无需变性即可直接用于测序反应。15 C、穿梭质粒。这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞种复制并检测，如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒

11、、大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。16 D、探针质粒。这类载体被用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子等。它通常装有一个可以定量检测其表达程度的报告基因（如抗生素的抗性基因），但缺少相应的启动子或终止子，因此载体分子本身不能表达报告基因，只有当含有启动子或终止子的外源DNA片段插入到载体合适的位点上，报告基因才能表达，而且其表达量的大小直接反映了被克隆的基因表达调控元件的强弱。17 E、表达质粒。这类载体在Polylinker的上游和下游分别装有转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点（SD-序列）以及强有力的终止子结构，使得克隆的外源基因均能在受体细胞中高效表达，如pSPORT系列和

12、pSP系列。181.1.41.1.4质粒的制备 目前一般使用碱变性法制备质粒，苯酚/氯仿纯化。分离得到的质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现多条带。这是由于不同的DNA构型所引起的。从大到小分别为Oc-DNA, L-DNA, CCC-DNA.19细菌培养过夜离心收集菌体加SolutionI加SolutionII加SolutionIII抽提纯化沉淀干燥溶解在TE中SDS和NaOH,PH12.6NaAc,PH4.8葡萄糖和EDTA20图2-2质粒的电泳图(A-E为不同质粒电泳图，Marker为DNA的HindIII酶切图) 211.21.2噬菌体载体1.2.11.2.1噬菌体载体类型什么是噬菌体?-噬

13、菌体是一类细菌病毒的总称,Bacteriophage.见图.22 噬菌体是目前研究最清楚的大肠杆菌的一种双链DNA温和噬菌体, 也是最早使用的克隆载体之一. 其DNA大小约为50kb, 其线性双链DNA分子的两端,各有一个长为12bp的互补单链,称为粘性末端.当噬菌体进入寄主细胞内后, 其粘性末端能通过碱基互补作用, 形成环状DNA分子. 粘性末端形成的双链区域称为cos位点, 它是包装蛋白的识别位点, 噬菌体的包装与DNA特性和其它序列无关, 同时对包装的DNA23大小有要求, 包装范围大约在35kb-51kb. 通过改造噬菌体, 人们发展了许多不同用途的噬菌体载体. 以噬菌体为基础而构建的

14、常用载体可分两类 A、取代型, 用来克隆大片段DNA。如Charon系列、-DASH（含有Polylinker，T7和T3启动子）。B、插入型表达载体。如gt系列。24EcoRIEcoRIEcoRIlacEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI左臂右臂加外源片段左臂右臂纯化左右臂非必需片段连接EcoRIEcoRIEcoRIEcoRI重组DNA重组DNA 包装蛋白噬菌体颗粒感染细菌噬菌斑在Charon 载体中克隆外源DNA 25-DASHII载体的物理图261.2.2 1.2.2 M13噬菌体载体 M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，其基因组DNA长约6.4kb,成熟的噬

15、菌体为闭合环状单链正链DNA. M13单链DNA的复制型是呈双链环形，此时的DNA可同质粒DNA一样进行提取和体外操作。不论是双链的或是单链的M13DNA，均能感染寄主细胞，产生噬菌斑或形成侵染的菌落. 27 作为克隆载体的优越性在于能象质粒那样转化进入受体细胞，也可以使用类似于质粒分离纯化方法制备M13 DNA分子，同时又可以采用类似于噬菌体分离纯化方法制备单链M13 DNA，单链DNA在序列测定及定位诱变等中极为有用。281.1.31.1.3噬菌体DNA的分离纯化培养细菌 加噬菌体侵染细菌培养细菌注意裂解加氯仿继续培养直到细菌全部裂解PEG沉淀噬菌体颗粒分离DNA291.31.3质粒-噬菌

16、体杂合载体1.3.11.3.1柯斯质粒（Cosmids) 包装蛋白识别信号cos位点，与待包装DNA性质无关，因此用一个质粒DNA 取代DNA，就可大幅度地提高外源DNA片段的装载量。 DNAcos位点及其附近的DNA片段为1.7kb，质粒DNA为3.0kb,由此构建的Cosmid约为5.0kb, 其最大装载量可达45.9kb。质粒复制子。优点：A、高效感染进入受体细胞；B、排斥非重组子；C、也能转化进入受体细胞；D、象一般质粒一样分离301.3.21.3.2噬菌粒载体(phagemids) 由丝状噬菌体DNA复制起点序列和质粒组成的杂合分子。优点：A、具有质粒性质，便于外源DNA的克隆及重组

17、子的筛选；B、提高装载量；C、较稳定。 Bluescript(见图示）311.41.4其他载体（1）YAC（Yeast artificial chromosome) 包含一个染色体在酵母中繁殖所需的三个序列成分：A、复制起点；B、一个着丝粒，保证染色体分离进入后代细胞中；C、端粒，染色体末端封合。还有一个克隆位点和选择性标记以区分载体和重组分子。32复制起点着丝粒克隆位点端粒端粒SmaIURA3BamH1BamH1TRP1pYAC2左臂右臂TRP1 EndEndEndEndEndEndEndEndURA3端粒端粒用BamHI和SmaI酶切和外源DAN连接复制起点着丝粒33（3）PAC（P1-d

18、erived artificial chromosome)(2) BAC（Bacterial artificial chromosome) 以F1质粒衍生而来，能克隆约100kb-350kb的外源DNA片段，可以通过转化进入受体细胞，象一般质粒制备原理分离。它在大基因组尤其是植物基因组的研究中发挥重要作用。如构建contig，物理作图等。342基因工程工具酶2 . 1 限 制 性 核 酸 内 切 酶（Restriction Endonuclease,RE) 在研究寄主细胞对噬菌体的限制-修饰系统中发现，它能在DNA特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。35表2-1 核酸限制

19、性内切酶类型及主要特性特性型型型（1）限制和修饰活性 （2）酶蛋白分子组成 （3）限制作用所需的辅助因子 （4）特异性识别位点 （5）切割位点 （6）序列特异的切割 （7）在基因工程中的应用 双功能的酶 3种不同的亚基 ATP、Mg2+ 非对称序列 在距识别位点至少1000 bp的地方随机的切割 不是 无用 核酸内切酶和甲基化酶分开单一亚基 Mg2+ 迴文对称结构 位于识别位点上 是 广泛使用双功能的酶 2种不同的亚基 ATP、Mg2 非对称序列 距识别位点下游24-26bp处 是 用处不大36 限制性核酸内切酶的命名和特征 eg. EcoRIEscherichia coli R质粒第一次发现

20、HindIIIHaemophilus influenzae d株中发现的第三个酶37 基本特征 识别序列为4、5或6个碱基对且具有180旋转对称的回文结构 一般来说，识别序列的碱基对越多，则这种酶在DNA上出现的频率越低；不同生物碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同。 同位酶：识别相同的序列但切点不同。如 XmaI/SmaI38 同尾酶：识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。如 MboI/BglII/BclI/BamHI 同裂酶：识别位点和切割位点均相同的酶。如 HpaI/HincII 切开的DNA末端有平头末端和粘性末端（双链DNA的一条链突出，如5或 3突出末端，在适当的

21、温度下，两个互补粘性末端能退火形成双链分子。392.2 DNA 连接酶 DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将DNA双链上相邻的3羟基和5磷酸基团共价结合形成3-5磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来，因此它在DNA复制，修复以及体内体外重组过程中起着重要作用。 大肠杆菌连接酶是利用NAD+作为能源的，而T4噬菌体DNA连接酶则是以ATP作为辅助因子。 402.3 DNA聚合酶和Klenow大片段酶 DNA聚合酶以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3-OH端而合成新的DNA。大肠杆菌DNAPolymeraseI研究得较清楚，单体，具有5

22、- 3的DNA聚合活性， 5- 3的DNA外切活性和3- 5的DNA外切活性。 用蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶产生两个片段，一个小片段，带有的5 - 3DNA外切酶活性，而另一个较大的片段失去了412.4 碱性磷酸酶 细菌的碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠的碱性磷酸酶（CIP）均能催化DNA，RNA，核苷酸的5端除磷反应，因此在DNA重组实验中，该酶用于载体DNA的5末端除磷操作以防止载体自身连接，提高重组效率。5 - 3DNA外切酶活性但保留了另两种活性5 - 3聚合酶活性3 - 5外切酶活性，这个大片段被称为Klenow大片段酶。 422.5 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT） 该酶来源于小牛胸

23、腺，它是一种不需要模板的DNA聚合酶，其合适的底物形式为带有3游离羟基的双链DNA分子,当底物为3端突出的双链DNA时，TdT在Mg2+的存在下，即可将脱氧核苷酸随机聚合在两条链的3端，对于平头或3凹端DNA底物，则需要Co激活，但聚合反应仍不按模板要求进行.TdT在人工粘性末端的构建中极为有用。432.6 S1核酸酶(S1,Nuclease) 该酶来源于米曲霉茵，催化反应通常由Zn 2+激活，并在酸性pH（4.0-4.5）条件下进行，其特征是：（1）降解单链DNA或RNA，包括不能形成双链的区域（如发夹结构中的环状部分），但隆解DNA的速度大于降解RNA的速度；（2）降解反应的方式为内切和外

24、切；(3)酶量过大时会伴有双链核酸的降解。因为该酶的双链降解活性比单链低7.5万倍，因此在DNA重组及分子生物学研究中，S1核酸酶常用来切平突出的单链末端以及制作S1图谱。442.7 影响限制性核酸内切酶活性的 因素（1）DNA的纯度 一个限制性核酸内切酶单位u：在最佳缓冲系统中，在37下反应1小时完全降解1gDNA所需的酶量。DNA样品中所含蛋白质，有机溶剂以及RNA等杂质均会影响酶切反应的速度和酶切的完全程度，酶切的底物一般是双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应。45(3)盐离子浓度 不同的核酸限制性内切酶对盐离 子强度（Na+）有不同的要求，一般按离子强度不同分为低(0mM) 、

25、中(50mM)、高盐(100mM)三类。Mg2+也是限制性内切酶酶切反应所需。（2）温度 大部分限制性核酸内切酶最适反应温度为37，但也有例外，如Sma的反应温度为25。降低最适反应温度，会导致只产生切口，而不是切断双链DNA。46(4)缓冲体系 核酸限制性内切酶要求有稳定的pH值环境，这通常由Tris-HCl缓冲体系来完成。另外保持限制性内切酶稳定和活性一般使用-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）和牛血清白蛋白（BSA）.47(5)反应体积和甘油浓度 商品化的限制性内切酶均加50%甘油作为保护剂，一般在-20下贮藏。在进行酶且反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%，若加酶的体积太大，甘油浓度

26、过高，则会影响酶切反应。(6)限制性内切酶反应的时间 通常为1小时，但大多数酶活性可维持很长的时间，进行大量DNA酶解反应时，一般让酶解过夜。48(七)限制性内切酶星号活性 限制性核酸内切酶有特异性识别序列和切割位点，但当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种识别位点，这种现象称为星号活性。如EcoRI，正常条件下识别GAATTC，但在低盐，高pH和高甘油存在的情况下，能识别并切割AAATTC, GAGTTC, GAATTC 等。49第三章基因工程的常规技术DNA片段同载体连接导入受体细胞筛选凝胶电泳、核酸分子杂交、细胞转化、文库构建、PCR扩增技术、DNA序列结构

27、分析 5031凝胶电泳技术 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyzcrylamide gel electrophoresis,PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸，而琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但在核酸研究中应用广泛，是一个主要的技术。513.1.1琼脂糖凝胶电泳的原理 分离原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。前者由分子所带电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小

28、时，应尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高了分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相对增强而提高分辨率。 52 检测原理：溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光结合物，使发射荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。 533.1.2琼脂糖凝胶电泳的条件影响 琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的能力片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp)0.3%

29、琼脂糖0.7%琼脂糖1.0%琼脂糖1.2%琼脂糖1.5%琼脂糖2.0%琼脂糖50000-100020000-1000 8000-500 6000-400 4000-200 3000-10054DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比 关系。随着电场的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范 围缩小，即分辨率降低。DNA分子在TAE和TBE等缓冲液中带负电荷，在 电场中向正极移动。琼脂糖浓度。采用不同的凝胶能分辨不同分 子量的DNA分子。55电场方向。电场方向改变，DNA分子被迫改 变路径，DNA分子越大，为适应新的电场方 向而重新排列所需的时间就越长。因此可以 通过脉冲电场凝胶电泳来分辨极大的DNA分

30、子。5632 核酸的分子杂交技术3.2.1 探针标记 带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。切口平移标记 控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH末端（这条链即成为引物）。DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation)5758随机引物标记 能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。DNA聚合酶klenow

31、大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。593.2.2 核酸的分子杂交 Southern blot Southern杂交技术由E. Southern 于1975年发明，它现在是基因分离和鉴定中不可缺少的一个重要手段。待分析的基因组DNA或其它DNA首先用一种或几种限制性核酸内切酶消化，消化后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳按照分子量的大小进行分离，凝胶经碱变性处理，将DNA分子变性成单链，经毛细管作用或物理方法将凝胶中的单链DNA分子从胶上转移到固相支持物上（一般使用的是尼龙膜和纤维素膜）。然后用标记的DNA或RNA探针对附着于膜上的DNA进行杂交来

32、检测这些被转移的DNA片段，与探针有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通过特定的检测方法如放射自显影或显色而显示。60 Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多原因,其中包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA之间的配对情况等。61Fine Physical mapping of group 1 in wheatDABDABN1AT1BN1BT1DN1DT1ACS1AS-31AS-41AS-11AS-21AS-51BS-41BS-181BS-191BS-221BS-21BS-61BS-131BS-81BS-161BS-71BS-

33、31BS-101BS-151BS-211BS-11DS-51DS-41DS-11DS-21DS-31AL-31AL-41AL-51AL-21AL-11BL-101BL-131BL-31BL-51BL-121BL-151BL-81BL-91BL-21BL141BL-11BL-71BL-161BL-61BL-111DL-21DL-31DL-11DL-4DT-1ASDT-1ALDT-1BSDT-1BLDT-1DSDT-1DLProbe used: BCD921FL0.42FL0.17FL0.47FL0.32FL0.41一个Southernblot杂交X光片例子：62Northern blot 和 W

34、estern blot 转移RNA，然后进行杂交- Northern blot 转移蛋白质，然后进行杂交-Western blot菌落（或噬菌斑）原位杂交 把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，然后溶菌 变性并固定DNA，最后用标记的DNA或RNA探针进行杂交 来检测这些被转移的菌落或噬菌斑。633.3文库构建 基因文库（gene library)或DNA文库：在细菌中增殖来自某一生物的染色体基因组DNA（或来自所有不同的mRNA种的每一种cDNA分子）所形成的的全部DNA片段之集合体。有基因组DNA文库(克隆)和cDNA文库(克隆)。643.3.1基因组文库3.3.1.1 DNA克隆片段的产生

35、与分离基因组DNA的片段化 限制性核酸内切酶和机械切割法 DNA片段大小分离和富集 琼脂糖凝胶电泳和蔗糖梯度离心技术653.3.1.2重组DNA导入受体细胞-转化和转染 转化（transformation): 感受态的大肠杆菌捕获和表达外源质粒DNA分子的过程；转染（transfection):感受态的大肠杆菌捕获和表达外源噬菌体DNA分子的过程。 感受态：细菌吸收转化因子的生理状态。66（1）受体细胞的选择 A、限制缺陷型；B、重组缺陷型；C、遗传互补型； D、感染寄主缺陷型（2）转化过程 感受态细胞的制备 受体细胞和DNA混合 热激 表达 转化子（3）转化影响因素 A、DNA；B、受体细胞

36、；C、操作673.3.1.3基因克隆的实验方案N=ln(1-P)/ln(1-f) N为一个完整基因文库所应包含的重组DNA的转化子克隆数；P为在重组体群体中出现目的基因序列的几率（一般期望值为99）；f为限制片段的平均大小与基因组DNA大小之比。 比如人单倍体基因组大小为3X109 bp，若载体装载量为20kb,那么为了保证目的基因序列以99的几率在重组体群体中出现则需要重组子克隆数为69万。 683.3.2 cDNA文库(1)cDNA文库的构建A、分离总RNA，然后从中纯化mRNA。B、合成第一cDNA链。C、将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子。D、将合成的双链cDNA重组到载

37、体上，导入大肠肝菌 细胞增殖。69（2）cDNA 克隆的优越性A、一些RNA病毒基因克隆的唯一手段。B、文库筛选较简单。C、假阳性几率低。D、生产表达产物蛋白质。E、功能研究。70 3.4 PCR扩增（Polymerase Chain Reaction)71What is PCR? 又称为聚合酶链反应, 由Mullis于1983年发明，能在体外特异快速扩增DNA片段。组成：DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液）72What is needed for PCR?73A、Taq DNA聚合酶 热稳定的聚合酶，1988年分离到。催化一典型的PCR反应所需酶量约为2单位，加酶量过多则有可能导

38、致非靶序列的扩增。B、引物 引物是保证PCR特异性的关键因素，一般使用两个引物来扩增专性序列。设计原则：长度15-30个核苷酸； G+C含量应在45%-55%； 碱基分布的随机性；引物不能含有自身互补序列；两个引物之间不应有多于4个互补碱基。 引物贮备液浓度一般为20M（或10-50M），使用浓度一般为1mol/L(1M),这一浓度足以完成30个循环的扩增反应。过高，74不经济且会出现非特异序列扩增及增加引物二聚体的产生；过低，则PCR的效率低。C、反应缓冲液Mg2+: 可显著影响PCR的产量及产物特异性，一般用量为1.5mM。 过高则出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。明胶，BSA，Twe

39、en20及DTT: 对酶有一定的保护作用。Tris-Cl: PH8.3, 提供缓冲环境。D、dNTP dATP, dGTP, dCTP 和 dTTP贮备液浓度均为5mM，保存于-20，使用浓度为200M。过高则反应速度下降，过高则特异性下降。75E、反应条件变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩 增成功的关键。复性温度和时间：PCR反应的特异性取决于复性过程中引物 与模板的结合，一般为40-60.越高, 产物 的特异性也越高。时间一般为30-60s。延伸温度和时间：一般位于Taq酶最适作用温度70-75之间。 小于1kb的片段一般1-2min就足够了, 而更大 片段需延长时间。循环数：在25-30个循环内, 扩增DNA增加明显, 以指数方式 增加，后进入相对稳定状态, 此时, 引物和 dNTP 76下降；Taq酶活性下降；扩增产物（焦磷酸盐和DNA）的阻碍作用；高浓度的产物可能降低Taq酶的延伸和加工能力。所以一味增加循环次数只会增加非特异扩增。77How