课题3土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、专题专题3 3 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离分离与与计数计数尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2 重要的农业氮肥。重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为只能被土壤中细菌分解为NHNH3 3才能被植物吸才能被植物吸收利用收利用 CO(NH CO(NH2 2) )2 2 + H + H2 2O COO CO2 2 +2NH+2NH3 3细菌脲酶细菌脲酶一、课题背景一、课题背景二、课题目标二、课题目标l1、从土壤中分离产生脲酶的细菌l2、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌三、研究思路三、研究思路 （一）筛选菌株（一）筛选菌株 提出的问题提出的问题 如何寻找如何寻找

2、耐高温耐高温的酶？的酶？ 解决问题的思路解决问题的思路 寻找寻找耐高温耐高温环境；环境； 原理原理 高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌， 耐高温菌种提取耐高温酶。耐高温菌种提取耐高温酶。（一）筛选菌株（一）筛选菌株KHKH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 4 H H2 2O 0.2gO 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 琼脂琼脂 15.0g15.0g 将上述物质溶解后，将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到1000mL1000mL。 该培养

3、基的配方中，为该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选出产生此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮细菌能利用尿素作为氮源而生存。源而生存。选择培养基实例选择培养基实例 (1)加入加入青霉素青霉素可以分离出混杂在细菌中的酵母菌和霉菌；可以分离出混杂在细菌中的酵母菌和霉菌； (2)加入加入高浓度的食盐高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌；可得到金黄色葡萄球菌；(3)培养基中培养基中缺乏氮

4、源缺乏氮源时，可以分离固氮微生物；时，可以分离固氮微生物； (4)培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物；培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物； (5)培养基中的氮源只有尿素时，理论上只有能合成脲酶的培养基中的氮源只有尿素时，理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。微生物才能在上面生长。 Dc 1显微镜直接计数法显微镜直接计数法 (1)原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜微镜 下计算一定容积的样品中微生物数量。下计算一定容积的样品中微生物数量。 (2)方法：用计数板计数。方法：用计数板计数。 (3)缺点：不能区分死菌

5、与活菌。缺点：不能区分死菌与活菌。 不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察； （二）统计菌落数目：（二）统计菌落数目：2 2、活菌计数法、活菌计数法 (1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 (2)计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数， V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) ,M 代表稀释倍数。 【例】若某一稀释度下

6、，平板上生长的平均菌落数为80，涂布平板时所用的稀释液体积为0.1ml,稀释液的稀释倍数为106，则每克样品中的活菌数约为 。8108 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为菌落数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，三个平板，统计的菌落数分别为统

7、计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三，该同学以这三个平板上菌落数的平均值个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？错在哪？ 甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值三个或三个以上50个左右30300低 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为过程中，从对应稀释倍数为10106 6的培养

8、基中，的培养基中，A A、B B两同学分别得到以下两种统计结果。两同学分别得到以下两种统计结果。 1 1、A A同学筛选出同学筛选出150150个菌落。个菌落。 2 2、B B同学筛选出同学筛选出5050个菌落。个菌落。 B B认为认为A A的培养基被杂菌污染了，或培养基的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。素的细菌也能在该培养基中生长。A A确认自己确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助请你帮助A A同学改进实验，提供具有说明同学改进实验，提供具有说明了的证据。了的证据。DA 土壤土壤取样取样样品样品稀释和涂布稀释和涂布微生物的微生物的培养培养观察并记录观察并记录结果结果细菌细菌计数计数 三、实验设计三、实验设计( (以活菌计数法为例以活菌计数法为例) )制备培养基制备培养基 从从肥沃、湿润肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要前都要灭菌灭菌。制备以制备以 为唯一氮源的为唯一氮源的 培养基。培养基。（以