酶化学2013-11-3T21

1、第二章 酶Chapter 2 Enzyme第一节 酶的分子结构与功能Section 1 Structure and Function of Enzyme 酶作为生物催化剂的特性：酶作为生物催化剂的特性： 酶催化作用的特点（复习）酶催化作用的特点（复习）1. 酶的催化反应条件温和酶的催化反应条件温和 酶能在常温常压和酶能在常温常压和pH近中性的条件下起催化作近中性的条件下起催化作用，这是酶作为生物催化剂所必备的条件。用，这是酶作为生物催化剂所必备的条件。2. 酶具有很高的催化效率酶具有很高的催化效率 酶的催化活性比一般催化剂高酶的催化活性比一般催化剂高10620倍。倍。 酶作为生物催化剂的特性：

2、酶作为生物催化剂的特性： 3. 酶具有高度专一性酶具有高度专一性&酶只能作用于酶只能作用于某种物质某种物质或某或某一类结构相似的物质，催化一类结构相似的物质，催化它们进行某种它们进行某种类型类型的反应。的反应。&即酶对其所催化的反应和反即酶对其所催化的反应和反应物具有严格的选择性。应物具有严格的选择性。这这种现象称为种现象称为酶作用的特异性酶作用的特异性(specificity)。 酶作为生物催化剂的特性：酶作为生物催化剂的特性： 3. 酶具有高度专一性（特异性）酶具有高度专一性（特异性）（1）绝对特异性）绝对特异性(absolute specificity)（2）相对特异性）相对特异性(re

3、lative specificity)（3）立体异构特异性）立体异构特异性(stereospecificity) 酶作为生物催化剂的特性：酶作为生物催化剂的特性： 4. 酶的催化活性在体内受到多种因素调节控制酶的催化活性在体内受到多种因素调节控制 酶的调节方式包括抑制剂调节、共价修饰调节、酶的调节方式包括抑制剂调节、共价修饰调节、 反馈调节、酶原激活及激素控制等，这些方式的存在反馈调节、酶原激活及激素控制等，这些方式的存在使得生物体的代谢过程有条不紊地进行。使得生物体的代谢过程有条不紊地进行。5. 酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关酶的化学本质及其组成

4、酶的化学本质及其组成（一）酶的化学本质（一）酶的化学本质 绝大部分酶是由生物细胞产生的，具有绝大部分酶是由生物细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质。因此，催化活性和高度专一性的特殊蛋白质。因此，酶的化学本质是蛋白质酶的化学本质是蛋白质。|具有催化功能的核酸是特例。具有催化功能的核酸是特例。 这种具有催化活性的这种具有催化活性的RNA命名为命名为Ribozyme，译为核酶、核糖酶或酶性译为核酶、核糖酶或酶性RNA等等&酶可根据其化学组成的不同，分为两类：酶可根据其化学组成的不同，分为两类： 酶酶单纯酶单纯酶(simple enzyme)结合酶（全酶）结合酶（全酶）(conjugate

5、d enzyme) 辅基辅基辅酶辅酶金属离子金属离子 辅助因子辅助因子酶蛋白酶蛋白酶的化学本质及其组成酶的化学本质及其组成（二）酶的组成和辅助因子（二）酶的组成和辅助因子（二）酶的组成和辅助因子（二）酶的组成和辅助因子& 全酶全酶 = 酶蛋白酶蛋白 + 辅助因子辅助因子 酶蛋白酶蛋白-不能单独表现催化活性的蛋白质部分不能单独表现催化活性的蛋白质部分。 辅助因子辅助因子-结合酶中的非蛋白质部分（包括辅酶、辅结合酶中的非蛋白质部分（包括辅酶、辅 基和金属离子）基和金属离子）。 酶蛋白酶蛋白-与底物结合，决定与底物结合，决定反应的专一性和高效率反应的专一性和高效率。 辅助因子辅助因子-直接对电子、原

6、子或某些化学基团起传递直接对电子、原子或某些化学基团起传递 作用，作用，决定反应的类型决定反应的类型。 （二）酶的组成和辅助因子（二）酶的组成和辅助因子 金属离子金属离子u为催化活性中心的组成部分；为催化活性中心的组成部分；u搭桥作用搭桥作用：在酶与底物分子间起桥梁作用；：在酶与底物分子间起桥梁作用；u稳定构象：稳定构象：帮助酶分子形成酶活性所必需的构象；帮助酶分子形成酶活性所必需的构象； 金属酶金属酶(metalloenzyme) 金属激活酶金属激活酶(metal-activated enzyme) 辅酶辅酶-与酶蛋白与酶蛋白疏松疏松结合并与催化活性有关的结合并与催化活性有关的 耐热耐热 低

7、分子有机化合物称为低分子有机化合物称为辅酶辅酶(coenzyme)。用。用 透析方法可除去。透析方法可除去。 辅基辅基-与酶蛋白与酶蛋白牢固牢固结合并与催化活性有关的耐热结合并与催化活性有关的耐热 低分子有机化合物称为低分子有机化合物称为辅基辅基(prosthetic group)。用透析的方法不易除去。用透析的方法不易除去。| 酶蛋白与辅酶（基）的结合有一定专一性酶蛋白与辅酶（基）的结合有一定专一性。（三）酶的分类（按结构）（三）酶的分类（按结构）单体酶单体酶(monomeric enzyme)寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzyme)多酶体系多酶体系多酶复合体多酶复合体(multi

8、enzyme complex)？多功能酶？多功能酶(multifunctional enzyme)酶的分类（按结构）酶的分类（按结构）: :单体酶单体酶 由一条肽链构成的酶由一条肽链构成的酶寡聚酶寡聚酶 由几个至几十个亚基构成的酶，分子量由几个至几十个亚基构成的酶，分子量3.5万万几百万几百万多酶体系多酶体系 由几种酶彼此嵌合形成复合体由几种酶彼此嵌合形成复合体,有利于一系列反有利于一系列反应的进行应的进行.如脂肪酸合成酶系如脂肪酸合成酶系.由由7种酶围饶着小分子种酶围饶着小分子物质物质-酰基载体蛋白酰基载体蛋白(ACP)形成球状形成球状,其中若其中若1种酶失活种酶失活或解体或解体,则丧失整个

9、活性则丧失整个活性.多功能酶多功能酶多酶复合体多酶复合体HS-ACPw多功能酶多功能酶(multifunctional enzyme)或串联酶或串联酶(tandem enzyme)：一些多酶体系在进化过程中一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。条多肽链中，这类酶称为多功能酶。 松散排列松散排列v酶在细胞中各自以酶在细胞中各自以可溶的单体可溶的单体形式存在，彼此形式存在，彼此没有结构上的联系。没有结构上的联系。v反应时酶是反应时酶是随机扩散，催化效率不高。随机扩散，催化效率不高。（如糖（如糖酵解历程

10、）酵解历程）酶的聚集方式酶的聚集方式酶1酶2酶3酶4酶5簇式排列簇式排列v几种酶有机地聚集在一起，精巧的镶嵌成一定的几种酶有机地聚集在一起，精巧的镶嵌成一定的结构，定向转移，结构，定向转移，形成多酶复合体。催化效率高。形成多酶复合体。催化效率高。【举例】丙酮酸脱氢酶复合体 脂肪酸合成酶复合体酶2酶3酶1酶4酶6酶5与生物膜结合与生物膜结合v 一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的排列在生物膜上。排列在生物膜上。催化效率最高。催化效率最高。（如呼（如呼吸链）吸链）酶1酶2酶4酶5酶3酶的分类与命名酶的分类与命名大肠杆菌细胞中，大肠杆菌细胞中，30003000种酶种酶

11、高等真核生物细胞中，高等真核生物细胞中，50005000种酶种酶已经确认的酶很少已经确认的酶很少国际酶学委员会已知的酶增长统计：国际酶学委员会已知的酶增长统计：1. 习惯命名法习惯命名法推荐名称推荐名称2. 系统命名法系统命名法系统名称系统名称3. 编号命名法编号命名法分类名称分类名称酶的分类酶的分类根据根据1961年国际酶学委员会（年国际酶学委员会（IEC）的分类）的分类法，通常将酶分为六大类：法，通常将酶分为六大类：1.氧化还原酶类氧化还原酶类(oxidoreductases)2.转移酶类转移酶类 (transferases )3.水解酶类水解酶类 (hydrolases)4.裂解酶类裂解

12、酶类 (lyases)5.异构酶类异构酶类( isomerases)6.合成酶类合成酶类 (ligases, synthetases)（三）国际系统分类法及编号（三）国际系统分类法及编号1.1.分类分类根据酶催化反应类型和机制把酶分六大类：根据酶催化反应类型和机制把酶分六大类：(1) (1) 氧化还原酶类氧化还原酶类：催化氧化还原反应催化氧化还原反应。 AH2+BA+BH2Oxidation = loss of electronsReduction = gain of electronsMust be balancedVery common in biology(2) 转移酶类：转移酶类：催化

13、分子基团从一个分子转移到另一个催化分子基团从一个分子转移到另一个 分子的反应。分子的反应。 A-R+BA+B-R(3)水解酶类水解酶类：催化加水分解：催化加水分解 A-B+HOHAOH+BH(4)裂合酶类裂合酶类：裂合酶催化一个化合物裂解成为两个较小化裂合酶催化一个化合物裂解成为两个较小化合物及其逆反应合物及其逆反应，其催化反应的通式为，其催化反应的通式为 ABA+B 这类酶的系统命名为这类酶的系统命名为“底物底物-裂解的基团裂解的基团-裂合酶裂合酶”，如，如柠檬酸裂合酶（柠檬酸合成酶）柠檬酸裂合酶（柠檬酸合成酶） 裂合酶可脱去底物上某一基团而形成一个双键，或可相反裂合酶可脱去底物上某一基团而

14、形成一个双键，或可相反地在双键处加入某一基团，重要的有醛缩酶、水化酶、脱地在双键处加入某一基团，重要的有醛缩酶、水化酶、脱氨酶等。氨酶等。(5)(5)异构酶类异构酶类：催化分子间重排的有关反应。催化分子间重排的有关反应。 反应通式为：反应通式为：AB(6)(6)连接酶或合成酶类连接酶或合成酶类：催化把两个分子连接在一起，催化把两个分子连接在一起，并由并由ATPATP提供能量的反应提供能量的反应。 A+B+ATPAB+ADP+磷酸，或磷酸，或AMP+焦磷酸焦磷酸2.系统编号系统编号-EC1111&EC-表示国际酶学委员会表示国际酶学委员会 第一个数字表示酶所属的大类（第一个数字表示酶所属的大类（

15、1 16 6大类大类) ) 第二个数字表示酶在该大类中所属的亚类第二个数字表示酶在该大类中所属的亚类 第三个数字表示酶所属的次亚类第三个数字表示酶所属的次亚类 第四个数字表示酶在所属次亚类中的流水编号第四个数字表示酶在所属次亚类中的流水编号CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH酶的结构与催化功能的关系酶的结构与催化功能的关系& 酶的结构特点：酶的结构特点： 一、二、三、四级结构一、二、三、四级结构（一）酶的一级结构与催化功能的关系（一）酶的一级结构与催化功能的关系必需基团必需基团 2. 2. 肽键的改变肽键的改变 酶原激活酶原激活 3. 3. 二硫键二硫键（一）酶的一级结

16、构与催化功能的关系（一）酶的一级结构与催化功能的关系1. 1. 必需基团必需基团& 指酶蛋白分子中与酶的催化活性直接相关的指酶蛋白分子中与酶的催化活性直接相关的氨基酸残基侧链基团，若使其改变则催化活性氨基酸残基侧链基团，若使其改变则催化活性丧失。如丧失。如SerSer的羟基，的羟基，HisHis的咪唑基，的咪唑基，CysCys的巯的巯基，基，AspAsp、GluGlu的侧链羧基等。的侧链羧基等。|结合基团结合基团：能与底物结合的必需基团；：能与底物结合的必需基团；|催化基团催化基团：能促进底物发生化学变化的必需基团；：能促进底物发生化学变化的必需基团；酶的一级结构是酶的基本化学结构，是催化功酶

17、的一级结构是酶的基本化学结构，是催化功能的基础。能的基础。2 2、肽键的改变与催化功能的关系、肽键的改变与催化功能的关系&肽键的断裂使酶的生物活性丧失；肽键的断裂使酶的生物活性丧失；&酶原的激活酶原的激活酶原酶原：有些酶，特别是一些与消化作用有关的酶，在最：有些酶，特别是一些与消化作用有关的酶，在最初合成和分泌时，没有催化活性，这种没有催化活性初合成和分泌时，没有催化活性，这种没有催化活性的酶的前体称为酶原；的酶的前体称为酶原；酶原激活酶原激活：酶原在一定的条件下经过适当的物质作用而：酶原在一定的条件下经过适当的物质作用而转变为有活性的酶的过程，称为酶原的激活，实质上转变为有活性的酶的过程，称

18、为酶原的激活，实质上是酶活性部位形成或暴露的过程。是酶活性部位形成或暴露的过程。胰蛋白酶原的激活过程胰蛋白酶原的激活过程甘甘异异赖赖缬缬天天天天天天天天缬缬组组丝丝甘甘异异缬缬组组丝丝肠激酶肠激酶/胰蛋白酶胰蛋白酶n活性中心活性中心(active center)n酶的二、三级结构与催化活性的关系酶的二、三级结构与催化活性的关系n酶的四级结构与催化活性的关系酶的四级结构与催化活性的关系（二）酶的高级结构与其催化活性的关系（二）酶的高级结构与其催化活性的关系1. 1. 活性中心活性中心(active center)是指酶分子中直接与底物结合并完成酶催化反应是指酶分子中直接与底物结合并完成酶催化反应

19、的结构区域，的结构区域，该部位化学基团集中，该部位化学基团集中，并构成一并构成一定空间构象。定空间构象。单纯酶单纯酶： 在一级结构上相距甚远甚至不在同一条肽链上的基团在一级结构上相距甚远甚至不在同一条肽链上的基团通过肽链的盘绕折叠而在三维空间结构上相互靠近，通过肽链的盘绕折叠而在三维空间结构上相互靠近，形成具有一定空间结构的区域形成具有一定空间结构的区域-活性中心活性中心。结合酶结合酶： 活性中心即活性中心即辅酶分子辅酶分子，辅酶上的某一部分结构辅酶上的某一部分结构，以及，以及与辅酶分子在结构上与辅酶分子在结构上紧密偶联的蛋白的结构区域紧密偶联的蛋白的结构区域。1. 1. 活性中心活性中心(a

20、ctive center)结合中心：结合中心： 与底物结合的部位，决定与底物结合的部位，决定酶的专一性酶的专一性；催化中心：催化中心： 促进底物发生化学反应的部分，决定促进底物发生化学反应的部分，决定酶酶所催化反应的性质所催化反应的性质；|活性部位的基团都是必需基团，但必需基团活性部位的基团都是必需基团，但必需基团还包括在活性部位以外的，对维持酶空间构还包括在活性部位以外的，对维持酶空间构象必需的基团。象必需的基团。活性中心活性中心由两部分构成：由两部分构成：Asp102His57Ser195HHChymotrypsin 顺序式催化反应顺序式催化反应 A1NCCNHOOCHOCCNCCNH2O

21、Check substrate specificity丝氨酸蛋白酶的专一性不同丝氨酸蛋白酶的专一性不同COO-CAsp酶活性区酶活性区TrypsinChymotrypsinElastase切切 Lys, Arg切切 Trp, Phe, Tyr切切 Ala, GlyNon-polarpocketDeep and negativelycharged pocketShallow andnon-polarpocket O OCNCCN C C C C NH3+ O OCNCCN C O OCNCCN CH3Juang RH (2004) BCbasics靠近羧肽酶A定向极性专一性契合区H2+ +NC精

22、氨酸C端确认区注意2.酶的二、三级结构与催化活性的关系：酶的二、三级结构与催化活性的关系：酶的二、三级结构是所有的酶必须具备的空间结酶的二、三级结构是所有的酶必须具备的空间结构，是维持酶活性部位所必须的构象。构，是维持酶活性部位所必须的构象。u可使酶遭受破坏而丧失其催化功能可使酶遭受破坏而丧失其催化功能-蛋白质蛋白质变性理论变性理论u也可以使酶形成正确的催化部位而发挥其催也可以使酶形成正确的催化部位而发挥其催化功能化功能-酶的诱导契合学说酶的诱导契合学说3.酶的四级结构与催化活性的关系：酶的四级结构与催化活性的关系：（1）酶的四级结构及亚基与催化活性的关系）酶的四级结构及亚基与催化活性的关系（

23、2）酶的四级结构与代谢调节的关系）酶的四级结构与代谢调节的关系聚合与解聚聚合与解聚别构酶别构酶2ATP2ADP磷酸化酶b 激酶2Pi2H2O磷蛋白磷酸酶PPPPPP磷酸化酶b（二聚体） 无活性磷酸化酶b（二聚体） 有活性磷酸化酶b（四聚体） 低活性4.同工酶同工酶高级结构与酶活性关系的典型：高级结构与酶活性关系的典型：&同工酶的概念同工酶的概念 指能催化相同的化学反应，但酶蛋白本身的分子结指能催化相同的化学反应，但酶蛋白本身的分子结构组成及理化性质不同的一组酶构组成及理化性质不同的一组酶。&同工酶的结构与功能同工酶的结构与功能 同工酶的结构主要表现为非活性中心部分的不同，同工酶的结构主要表现为

24、非活性中心部分的不同，或所含亚基组合情况不同，对整个分子而言，各同工或所含亚基组合情况不同，对整个分子而言，各同工酶酶与酶活性有关的部分结构相同与酶活性有关的部分结构相同。4.同工酶同工酶高级结构与酶活性关系的典型：高级结构与酶活性关系的典型：例如：乳酸脱氢酶例如：乳酸脱氢酶LDH可装配成可装配成H4、H3M、H2M2、HM3、M4五种四聚体。五种四聚体。CH3CHOHCOO- + NAD+ CH3COCOO- + NADHMHMM MMM4HMMMM3HMMHHM2H2MHHHMH3HHHHH4心肌心肌肝、骨骼肌肝、骨骼肌临床意义临床意义心肌梗死和肝病病人血清心肌梗死和肝病病人血清LDHLD

25、H同工酶谱的变化同工酶谱的变化1 1酶酶活活性性心肌梗死酶谱心肌梗死酶谱正常酶谱正常酶谱肝病酶谱肝病酶谱2 23 34 45 5第二节 酶促反应的机制Section 2 Mechanisms of Enzyme-Catalyzed Reaction一一. .酶促反应的本质酶促反应的本质加速反应的本质加速反应的本质-降低活化能降低活化能活化能活化能： 活泼态与常态之间的能量差，即使反应物由活泼态与常态之间的能量差，即使反应物由常态变成活化态所需要的能量。常态变成活化态所需要的能量。使反应达到其能阈的两个途径使反应达到其能阈的两个途径：为反应物分子提供所需的活化能（外加能量）为反应物分子提供所需的

26、活化能（外加能量）降低反应的能阈，使反应沿着一个活化能阈较降低反应的能阈，使反应沿着一个活化能阈较低的途径进行。低的途径进行。酶促反应的活化能酶促反应的活化能催化反应历程：催化反应历程：一般化学反应历程：一般化学反应历程： S P酶促反应历程：酶促反应历程： S + E ES E + P 二二. .酶的催化机制酶的催化机制在酶促反应中，首先酶与底物结合成一个不稳定在酶促反应中，首先酶与底物结合成一个不稳定的中间产物（的中间产物（ES），然后再分解成产物和原），然后再分解成产物和原来的酶来的酶。 S + E ES E + P（一）中间复合物学说：（一）中间复合物学说：二二. .酶的催化机制酶的催

27、化机制若由若由 S1 + S2 P1 + P2 ，则表示为：，则表示为： S2 E + S1 ES1 P1 + P2 + E（二）酶与底物形成中间络合物的方式（理论）（二）酶与底物形成中间络合物的方式（理论）二二. .酶的催化机制酶的催化机制(1) 锁钥假说锁钥假说(lock and key hypothesis)整个酶分子的天然构象是具有刚性整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。一把钥匙对一把锁一样。(2) 诱导契合假说诱导契合假说（inducedfit hypothesis): 酶

28、表面并没有一种与底物互补的固酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状诱导才形成了互补形状. .y当底物与酶接近时，底物分子可以诱导酶活性中心构象当底物与酶接近时，底物分子可以诱导酶活性中心构象发生改变，使之成为能与底物分子密切结合的构象。发生改变，使之成为能与底物分子密切结合的构象。诱导契合学说诱导契合学说1. 酶的活性中心结构具有一定柔性；酶的活性中心结构具有一定柔性；2. 底物可诱导酶的构象发生一定的改变；底物可诱导酶的构象发生一定的改变；3. 活性中心各个基团转入有效作用位置；活性中心各个基团转入有效作用位置；4. 酶与底物结合形

29、成中间产物并催化；酶与底物结合形成中间产物并催化；5. 酶与产物分离，恢复原来构象。酶与产物分离，恢复原来构象。6. 酶的作用专一性不仅取决于酶和底物的酶的作用专一性不仅取决于酶和底物的结合，也取决于酶的催化基团有正确结合，也取决于酶的催化基团有正确的取位。的取位。|诱导契合学说比较好地解释了诱导契合学说比较好地解释了酶的高度专一性和高效率。酶的高度专一性和高效率。Binding of glucose induces a large conformational changeThe two lobes swing together by 12 AGlucose is completely en

30、gulfed by the proteinactiveExperimental evidence: 酶与底物结合后，底物由基态变为激发态，酶与底物结合后，底物由基态变为激发态，降低了活化能，使酶促反应加速。降低了活化能，使酶促反应加速。 1.邻近效应邻近效应(proximity effect)与与定向作用定向作用(orientation arrange ) ：（三）与酶的高效率催化有关的因素：（三）与酶的高效率催化有关的因素：二二. .酶的催化机制酶的催化机制仅仅是靠近还不够，还需要酶和底物的反应基团在反应中彼仅仅是靠近还不够，还需要酶和底物的反应基团在反应中彼此相互严格地定向，即酶活性中心的

31、催化基团此相互严格地定向，即酶活性中心的催化基团( (氨基酸残基上氨基酸残基上的基团的基团) )定向于底物的反应基团。只有既靠近又定向，底物分定向于底物的反应基团。只有既靠近又定向，底物分子才能迅速的形成过渡态，加速反应的进行。子才能迅速的形成过渡态，加速反应的进行。邻近效应与定向作用示意图邻近效应与定向作用示意图2底物变形底物变形(distortion)与电子张力（与电子张力（electronic tension）：）： 应变效应，底物分子的敏感键产生张力或变形应变效应，底物分子的敏感键产生张力或变形（三）与酶的高效率催化有关的因素：（三）与酶的高效率催化有关的因素： 酶与底物结合后，底物发

32、生变形，底物由基态变为激发态，降低了活化能，使酶促反应加速。 酶与底物结合后，酶与底物结合后，底物发生形变。底物发生形变。 酶与底物结合后，酶分子中的某些基团或离子可酶与底物结合后，酶分子中的某些基团或离子可以使底物敏感键中的某些基团的电子云密度增加或降以使底物敏感键中的某些基团的电子云密度增加或降低，从而产生电子张力，使敏感键的一端更加敏感，低，从而产生电子张力，使敏感键的一端更加敏感，更易于发生反应。更易于发生反应。溶菌酶利用这种方式进行催化：与溶菌酶活性中心结合溶菌酶利用这种方式进行催化：与溶菌酶活性中心结合的的6 6碳糖在溶菌酶的诱导下，从椅式构象变成半椅式构象碳糖在溶菌酶的诱导下，从

33、椅式构象变成半椅式构象而发生形变，周围的糖苷键更容易发生断裂。而发生形变，周围的糖苷键更容易发生断裂。NHHHO CCHOOHCCH3COO-OHHNHHHCCOOHOCCH3COO-OHOCCH3COO-OHHNHHHCC+H多元催化作用多元催化作用(multielement catalysis)（三）与酶的高效率催化有关的因素：（三）与酶的高效率催化有关的因素：&酸碱催化酸碱催化指通过向反应物（作为碱）提供质子或从反应物（作为酸）指通过向反应物（作为碱）提供质子或从反应物（作为酸）夺取质子而稳定过渡态、加速反应的一类催化机制。夺取质子而稳定过渡态、加速反应的一类催化机制。组氨酸的咪唑基组氨

34、酸的咪唑基,组氨酸是许多酶的活性中心的构成成分。组氨酸是许多酶的活性中心的构成成分。&共价催化共价催化某些酶分子能作为亲核催化剂或亲电催化剂分别放出或汲某些酶分子能作为亲核催化剂或亲电催化剂分别放出或汲取电子而与底物分子形成不稳定的共价中间络合物，反应取电子而与底物分子形成不稳定的共价中间络合物，反应活化能降低而加速反应，称为共价催化。活化能降低而加速反应，称为共价催化。亲核催化，亲电子催化。亲核催化，亲电子催化。多元催化作用多元催化作用(multielement catalysis)：包括酸包括酸碱催化与共价催化等。碱催化与共价催化等。（三）与酶的高效率催化有关的因素：（三）与酶的高效率催化

35、有关的因素： 酶分子上的亲核基团酶分子上的亲核基团有有Ser-OH、Cys-SH、His- -咪唑基等，这些富咪唑基等，这些富含电子的基团含电子的基团( (有孤对有孤对电子电子) )，攻击底物分子，攻击底物分子中电子云密度较小的亲中电子云密度较小的亲电子基团，并供出电子，电子基团，并供出电子，二者形成共价键，酶和二者形成共价键，酶和底物形成一个不稳定的底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产中间物，进而转变为产物。物。Residue Catalytic PropensitiesAcid-base catalysis 酶的活性中心周围的环境是一个非极性环境，即低介电酶的活性中心周围的环境是一个非

36、极性环境，即低介电环境，在低的介电环境中排斥水分子，酶的催化基团和底物环境，在低的介电环境中排斥水分子，酶的催化基团和底物分子的敏感键之间有很大的反应力，有助于加速酶促反应。分子的敏感键之间有很大的反应力，有助于加速酶促反应。举举 例例 亚历山大亚历山大弗莱明弗莱明( (Alexander FlemingAlexander Fleming) )，18811881年年8 8月月6 6日出生于苏日出生于苏格兰艾尔郡洛奇菲尔德。格兰艾尔郡洛奇菲尔德。他是苏格兰低地农民的他是苏格兰低地农民的后裔，家境贫寒。后裔，家境贫寒。 因发现了青霉素以及因发现了青霉素以及它对多种传染性疾病的它对多种传染性疾病的治

37、疗作用，荣获治疗作用，荣获19451945年年诺贝尔生理学或医学奖。诺贝尔生理学或医学奖。19221922年的一天，正在感冒的英国细菌学家年的一天，正在感冒的英国细菌学家Alexander Alexander FlemingFleming发现，把一些鼻粘液发现，把一些鼻粘液加入加入细菌的培养基后会引起细细菌的培养基后会引起细胞的溶解。而这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要物质胞的溶解。而这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要物质被认为是一种酶，被认为是一种酶， FlemingFleming命名其为溶菌酶（命名其为溶菌酶（LysozymeLysozyme）。）。 在在19651965年年,Davi

38、d Phillips,David Phillips和他在牛津的同事以和他在牛津的同事以0.2nm0.2nm分辨率的分辨率的X X射线晶体（射线晶体（X-ray X-ray crystallographycrystallography）结构分析法阐明了溶菌酶的）结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构三维结构(tertiary structure)(tertiary structure)。 溶菌酶是从鸡蛋清中提炼的，蛋清里的溶菌酶可以溶菌酶是从鸡蛋清中提炼的，蛋清里的溶菌酶可以保护胚胎在发育过程中免受细菌的感染。溶菌酶溶保护胚胎在发育过程中免受细菌的感染。溶菌酶溶解细菌是通过水解细菌细胞壁多糖解细菌是通

39、过水解细菌细胞壁多糖(the (the polysaccharide of the bacterial cell wall)polysaccharide of the bacterial cell wall)的的糖苷键糖苷键(glycosidic bonds)(glycosidic bonds)。 而敏感细菌而敏感细菌 革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌(gram-positive (gram-positive bacteria)bacteria)的细胞壁多糖是的细胞壁多糖是N-N-乙酰氨基葡糖（乙酰氨基葡糖（N-N-acetylglucosamine, NAGacetylglucosamine,

40、NAG）-N-N-乙酰氨基葡糖乳酸乙酰氨基葡糖乳酸（N-acetylmuramic acid, NAMN-acetylmuramic acid, NAM）的共聚物，其中的）的共聚物，其中的NAGNAG及及NAMNAM通过通过-1-1，4 4糖苷键而交替排列。糖苷键而交替排列。溶菌酶的底物溶菌酶的底物 溶菌酶通过水解某些细菌细胞壁的多糖组份来溶溶菌酶通过水解某些细菌细胞壁的多糖组份来溶解细胞壁，细胞壁的多糖由两种糖组成解细胞壁，细胞壁的多糖由两种糖组成: : N-N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖 ( (NAG) ) N- N-乙酰氨基葡萄糖乳酸乙酰氨基葡萄糖乳酸( (NAM) ) 溶菌酶的内部几

41、乎全部是非极性的溶菌酶的内部几乎全部是非极性的(nonpolar)(nonpolar)。疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起重要作用。疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起重要作用。在溶菌酶分子的表面，有一个比较深的裂缝，其大在溶菌酶分子的表面，有一个比较深的裂缝，其大小恰好能容纳多糖底物的小恰好能容纳多糖底物的6 6个单糖，这是溶菌酶的个单糖，这是溶菌酶的活性部位。活性部位。 用大小不同的用大小不同的NAGNAG寡聚体作底物测定被溶菌酶水解的相对寡聚体作底物测定被溶菌酶水解的相对速率，结果发现，少于速率，结果发现，少于4 4个糖的寡聚体水解速率甚小，当个糖的寡聚体水解速率甚小，当由四聚体增加到

42、五聚体时，水解速率猛增由四聚体增加到五聚体时，水解速率猛增500500倍，五聚体倍，五聚体增加到六聚体，速率增加近增加到六聚体，速率增加近8 8倍，六聚体增加到八聚体，倍，六聚体增加到八聚体，速率不再变化。这种情况与速率不再变化。这种情况与X X射线晶体结构分析结果一致，射线晶体结构分析结果一致，活性部位所在的裂缝活性部位所在的裂缝(cleft)(cleft)正好被正好被6 6个糖残基所装满。个糖残基所装满。R GroupsThe active sites of enzymes contain amino acid R groups.Active site is lined with hydr

43、ophobic residuesPolar amino acid residues in active site are ionizable and participate in the reaction. Anion/cation of some amino acids are involved in catalysis Lysozyme: Cleaves glycosidic bonds in carbohydrates 从表面构象看，酶的结构不很紧密，大多数极性氨基酸残从表面构象看，酶的结构不很紧密，大多数极性氨基酸残基分布在分子的表面，非极性氨基酸残基分布在分子的内部。基分布在分子的表

44、面，非极性氨基酸残基分布在分子的内部。整个酶分子中有一狭长的凹穴。最适底物正好与酶分子的凹整个酶分子中有一狭长的凹穴。最适底物正好与酶分子的凹穴相结合，凹穴中的穴相结合，凹穴中的GluGlu3535和和AspAsp52 52 是活性中心的氨基酸残基。是活性中心的氨基酸残基。1.3.1.3.催化机理催化机理 溶菌酶底物与酶活性中心的关系溶菌酶底物与酶活性中心的关系 溶菌酶活性中心上的溶菌酶活性中心上的AspAsp5252氧原子距离底物敏感氧原子距离底物敏感键键(C-O(C-O键键) )中碳原子（中碳原子（D D糖环氧原子）只有糖环氧原子）只有0.3nm0.3nm，活，活性中心上另一个氨基酸性中心

45、上另一个氨基酸 GluGlu3535的羧基距离底物敏感键的羧基距离底物敏感键(C-O(C-O键键) )中氧原子也只有中氧原子也只有0.3nm0.3nm，溶菌酶的活性中心的，溶菌酶的活性中心的氨基酸残基与底物敏感键既靠近又定向。氨基酸残基与底物敏感键既靠近又定向。 底物底物D D糖环构象发生变化糖环构象发生变化 C3C4C5C2C1OC3C4C5C2C1O 溶菌酶底物溶菌酶底物D糖糖环变形模型图环变形模型图 椅式：椅式：C5、C1、C2 和和 O不在同一平面不在同一平面 C3C4C5C2C1OC5向前移动，向前移动， O原子向后移动原子向后移动半椅式：半椅式：C5、C1、C2 和和 O在同一平面

46、上在同一平面上 酶与底物结合后，酶与底物结合后，D 糖环构象发生变形，从正常的能量较糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象。低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象。GluGlu3535的羧基起的羧基起广义酸碱催化广义酸碱催化，向底物，向底物D D糖环和糖环和E E糖环之间的糖苷键上糖环之间的糖苷键上的氧原子提供的氧原子提供一个质子一个质子，氧原子与，氧原子与D D糖环糖环C C1 1的糖苷键断开，的糖苷键断开，D D糖环的糖环的C C1 1 带上正电荷成为正碳离子。带上正电荷成为正碳离子。AspAsp5252上的上的-COO-COO- -起着协调起着协调糖苷键断裂糖

47、苷键断裂和稳定和稳定正碳离子正碳离子的作用。的作用。 最后，来自环境中的水分子上的最后，来自环境中的水分子上的H H+ +与与GluGlu3535的的-COO-COO- -结合，水分子结合，水分子上的上的HOHO- -与正碳离子结合，至此，一次反应完成，细胞壁打开一个与正碳离子结合，至此，一次反应完成，细胞壁打开一个缺口。经多次重复作用，细菌的细胞壁溶解。缺口。经多次重复作用，细菌的细胞壁溶解。 最早把定点诱变使用到溶菌酶研究的在最早把定点诱变使用到溶菌酶研究的在19891989年被年被发表。在论文中，发表。在论文中，Asp52Asp52和和Glu35Glu35都被作为对象研都被作为对象研究，

48、研究是测试那些氨基酸残余被代替的突变蛋究，研究是测试那些氨基酸残余被代替的突变蛋白质的活性。像先前研究的预期结果一样，这些白质的活性。像先前研究的预期结果一样，这些突变蛋白质只有很少甚至没有催化活性。突变蛋白质只有很少甚至没有催化活性。点突变与催化机制研究点突变与催化机制研究点突变点突变Drawbacks:- both mutant and wild type versions of the gene are made following transformation-lots of screening required, or tricks required to prevent repli

49、cation of wild type strand- requires single-stranded, circular template DNASite-directed mutagenesis: primer extension methodAlternative primer extension mutagenesis techniquesQuikChange Site-Directed Mutagenesis, Stratagene“QuikChangeTM” protocolAdvantage: can use plasmid (double-stranded) DNA Dest

50、roys the template DNA (DNA has to come from dam+ host溶菌酶的最适溶菌酶的最适pH与与Glu35和和Asp52的解离状态有关的解离状态有关Active Site of Chymotrypsin2.1.胰凝乳蛋白酶的催化机理胰凝乳蛋白酶的催化机理在动物小肠中催化具有在动物小肠中催化具有疏水基团疏水基团的的羧基肽键羧基肽键水解。水解。底物的专一性：底物结合位点为疏水性口袋，与底物的疏底物的专一性：底物结合位点为疏水性口袋，与底物的疏水侧链有疏水性的相互作用。水侧链有疏水性的相互作用。胰凝乳蛋白酶活性中心由胰凝乳蛋白酶活性中心由 SerSer195

51、195、HisHis57 57 和和 AspAsp102 102 组成组成, , 构成一个构成一个电荷转接系统电荷转接系统。SerSer195 195 受受 HisHis57 57 和和 AspAsp102102的影响而成为很强的的影响而成为很强的亲核基团亲核基团, , 易于供出电易于供出电子。子。催化机理：催化机理：10219557疏水口袋疏水口袋氧阴离子洞氧阴离子洞活性位点活性位点SerSer195 195 氧原子对底物敏感肽键的羰基碳原子进行亲核攻击，氧原子对底物敏感肽键的羰基碳原子进行亲核攻击，形成一个形成一个不稳定的过渡态不稳定的过渡态，同时一个质子从，同时一个质子从 SerSer1

52、95 195 转移到转移到 HisHis5757。1021955710219557导致底物的导致底物的敏感键断裂敏感键断裂，胺成分通过氢键与酶的，胺成分通过氢键与酶的 HisHis57 57 咪唑咪唑基连接基连接, , 底物的羧基部分底物的羧基部分酯化酯化到到 SerSer195 195 的羟基上。的羟基上。上述过程为第一阶段：水解反应的酰化阶段上述过程为第一阶段：水解反应的酰化阶段酰基酰基 胺从中间产物胺从中间产物中释放出来中释放出来, , 电电荷转接系统荷转接系统从水从水中吸收一个质子中吸收一个质子, , 结果结果OHOH- - 立即攻立即攻击连在击连在 SerSer195 195 上上的

53、底物的羧基碳的底物的羧基碳原子。原子。反应进入第二阶段：水解反应的脱酰阶段反应进入第二阶段：水解反应的脱酰阶段10219557形成一个不稳定的四面体过渡态形成一个不稳定的四面体过渡态10219557胰凝乳蛋白酶催化的四胰凝乳蛋白酶催化的四面体中间物的形成面体中间物的形成胰凝乳蛋白酶催化形成的胰凝乳蛋白酶催化形成的四面体中间物的稳定四面体中间物的稳定HisHis57 57 供出一个质子到供出一个质子到 SerSer195 195 的氧原子上，底物从的氧原子上，底物从SerSer195 195 上释上释放出来，这时酶又恢复自由状态。放出来，这时酶又恢复自由状态。10219557 胰蛋白酶、胰凝乳蛋

54、白酶、弹性蛋白酶为消化酶，在胰腺胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶为消化酶，在胰腺中合成，以非活性的酶原形式分泌到消化道，在消化道中中合成，以非活性的酶原形式分泌到消化道，在消化道中转化成有活性的酶。转化成有活性的酶。 这三种酶在一级结构上有这三种酶在一级结构上有40%40%的氨基酸顺序是相同的，的氨基酸顺序是相同的，三维结构也很相似，都有三维结构也很相似，都有SerSer195195、HisHis5757、AspAsp102102三个氨基酸三个氨基酸残基构成的催化三联体，它们的催化作用机理也相似，但残基构成的催化三联体，它们的催化作用机理也相似，但它们的专一性是完全不同的。它们的专一性是完全

55、不同的。 这三种酶的活性部位位于分子表面的凹陷区域，这个凹陷这三种酶的活性部位位于分子表面的凹陷区域，这个凹陷结构区域称为口袋。由于三种蛋白酶的口袋的差异造成它结构区域称为口袋。由于三种蛋白酶的口袋的差异造成它们的专一性不同。们的专一性不同。三种酶的底物结合口袋三种酶的底物结合口袋非常非常保守保守Conformation of proteins and positions of side chains are important for enzyme-substrate interactions and catalysis.Forces involved in protein folding

56、and structure are also involved in catalysis- enzyme-substrate specificity Trypsin hydrolyses proteins by cleaving peptide bond adjacent to Lys/Arg.Aspartate residue in trypsin active site mediates ionic interaction with Lys /Arg and this arranges protein residue at which hydrolysis occurs.3.3.羧肽酶羧肽

57、酶A A催化机理催化机理羧肽酶 A水解有芳香族和中性脂肪族氨基酸形成的羧基末端水解有芳香族和中性脂肪族氨基酸形成的羧基末端 羧肽酶活性中心羧肽酶活性中心Zn2+的中心作用的中心作用羧肽酶催化中的电子云形变 C=O靠近电子云形变 定向极性专一性契合区H2+ +NC精氨酸C端确认区注意碱碱催化催化酸酸催化催化稳定活性中心吸附羧氧原子使肽键失稳使肽键失稳第三节 酶促反应动力学Section 3 Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction 内容：内容： 酶反应速度、反应过程的规酶反应速度、反应过程的规律及各种环境因素对酶促反应律及各种环境因素对酶促反应速度的影响速度的影

58、响。米氏方程式的推导：米氏方程式的推导： Michaelis & Menten 于于1913年推导出了上述矩年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式，即著名的形双曲线的数学表达式，即著名的米氏方程米氏方程。 Vmax S Km S K Kmm和和V Vmaxmax的测定：的测定： 1. Lineweaver-Burk双倒数作图法：双倒数作图法： 纵轴截距纵轴截距: 1/ Vmax斜率斜率: Km / Vmax横轴截距横轴截距:-1/ Km多底物的酶促反应动力学多底物的酶促反应动力学 分为单底物、双底物和三底物反应分为单底物、双底物和三底物反应1.酶促反应按底物分子数分类：酶促反应按底物分子数分类：

59、（二）双底物双产物反应（二）双底物双产物反应 A+BP+Q 双底物双产物的反应按动力学机制双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类可分为两大类 : 双底物双底物 双产物的反应双产物的反应 序列反应序列反应 （sequential reactions） 乒乓反应乒乓反应 （ping pong reactions） 有序反应有序反应 （orderd reactions） 随机反应随机反应 （random reactions） 有序反应（有序反应（ordered reactions）释放释放释放释放（1 1）序列反应或单置换反应）序列反应或单置换反应2.多底物反应按动力学机制分类：多底物反应按动力

60、学机制分类：领先底物领先底物A和和Q竞争地与自由酶结合竞争地与自由酶结合NAD 与与NADH相互竞争相互竞争E上的上的NAD结合部位结合部位 序列有序反应（序列有序反应（ordered reactions 写作写作 ordered Bi Bi） 只有只有Leading substrate (Leading substrate (领先底物领先底物A)A)首先与酶结合，然后首先与酶结合，然后B B才才能与酶结合，形成的三元复合物能与酶结合，形成的三元复合物EABEAB（ternary complex)ternary complex)转变为转变为EPQEPQ，B B 的产物的产物P P先释放，先释放