原核生物的基因表达与操作

1、目的基因目的基因 载体载体体外重组体外重组重组子（杂合重组子（杂合DNA）转化转化受体细胞受体细胞筛选阳性克隆筛选阳性克隆大量扩增，获得子代大量扩增，获得子代DNA基因克隆的技术路基因克隆的技术路线线重组基因表达的目的重组基因表达的目的 1. 1. 蛋白质功能研究蛋白质功能研究 2. 2. 生物制药和疫苗生产生物制药和疫苗生产 3. 3. 疾病的基因治疗疾病的基因治疗 4. 4. 食品、化工用酶制剂食品、化工用酶制剂 5. 5. 抗虫、抗逆植物改良抗虫、抗逆植物改良 6. 6. 细胞代谢产物的富集细胞代谢产物的富集1. 原核体系2. 真核体系 大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系优越性优越性： 1

2、. 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控 的分子机理有深刻的了解；的分子机理有深刻的了解； 2. 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适 用的寄主菌株和不同类型的载体；用的寄主菌株和不同类型的载体； 3. 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中 实现有效、高水平的表达；实现有效、高水平的表达； 4. 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易 用于批量生产。用于批量生产。大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系大肠

3、杆菌中表达体系的大肠杆菌中表达体系的不足不足： 1. 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。大的差别。 2. 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNARNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。酸序列。 3. 3. 真核基因真核基因mRNAmRNA的分子结构同细菌的有所差异，的分子结构同细菌的有所差异， 影响真核基因影响真核基因mRNAmRNA稳定性。稳定性。

4、4. 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装），转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在；并不存在； 5. 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。1.1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。宿主菌的酶系统合成外源蛋白。 2.2.外源基因不能带有间隔顺序外源基因不能带有

5、间隔顺序( (内含子内含子) )，因而必，因而必须用须用cDNAcDNA或全化学合成基因，而不能用基因组或全化学合成基因，而不能用基因组DNADNA。 3.3.必须利用原核细胞的强启动子和必须利用原核细胞的强启动子和SDSD序列等调控序列等调控元件控制外源基因的表达。元件控制外源基因的表达。 4.4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架开放阅读框架(ORF)(ORF)。 5.5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。

6、启动子启动子 核糖体结合位点核糖体结合位点(SD序列序列) 终止子终止子 选择标记基因选择标记基因 复制子复制子 启动子启动子核糖体结合位点核糖体结合位点转录终止子转录终止子大肠杆菌表达载体 报告基因报告基因（reporter genereporter gene）：特指那些编）：特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。酰转移酶基因等）。 追踪某种特定的追踪某种特定的DNADNA结构

7、（重组质粒）是否结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。表达活性可作为检测启动子功能的依据。大肠杆菌的大肠杆菌的LacLac启动子启动子大肠杆菌的大肠杆菌的trptrp启动子启动子TacTac启动子启动子1. 非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体载体1）强启动子）强启动子: tac（trp-lac） 2）操纵基因：乳糖操纵子系统）操纵基因：乳糖操纵子系统 trp的的-35区区 lacUV5的的-10区区 la

8、clac操纵基因操纵基因 常用大肠杆菌表达载体常用大肠杆菌表达载体 3）表达诱导物：）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）（乳糖的类似物，不会被降解） 条件：条件： 必须选择一个有必须选择一个有lacI的宿主菌。的宿主菌。2. 分泌型表达载体分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, 1）强启动子：）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和（脂蛋白基因启动子）和lac

9、UV5启动子。启动子。 2）调节基因：）调节基因：lac I 。3）S-D序列和起始密码序列和起始密码ATG。 4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位点区（多克隆位点）。）插入位点区（多克隆位点）。 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。白连接在一起的。 如：如：pGEX、pET系列系列 优点：便于融合蛋白的分离和纯化。优点：便于融合蛋白的分离和纯化。 组成结构：组成结构： 1）启动子：）启动子：tac 2）操纵基因：）操纵基

10、因：lacP 3）调节基因：）调节基因：lacI 4）S-D序列序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶） 融合蛋白表达系统的构建的三个原则：融合蛋白表达系统的构建的三个原则： 首先，受体细菌结构基因应能高效表达，且其首先，受体细菌结构基因应能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。 其次，外源基因应插在受体菌结构基因的下游其次，外源基因应插在受体菌结构基因的下游区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个结构基因拼接位点

11、处的序列设计十分重要，它直接结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定了融合蛋白的裂解方法。决定了融合蛋白的裂解方法。 最后，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外最后，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外生命科学学院生命科学学院 用融合载体组合表达融合蛋白质：用融合载体组合表达融合蛋白质： 以以Ecoli. lacZ为靶基因的组合最典型，含三个不同为靶基因的组合最典型，含三个不同载体，每个载体都有一个载体，每个载体都有一个lacZ启动子和启动子和SD序列，且在序列，且在lacZ基因下游部位具有一基因下游部位具有一EcoR识别序列识别序列 (GAATTC) 5上游存在着不同数量的上游存在着不同

12、数量的G-C碱基对。三种情况必有一碱基对。三种情况必有一个保持着正确的读码结构，产生出真实的融合蛋白质。个保持着正确的读码结构，产生出真实的融合蛋白质。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从因子可以把外源蛋白从GST上切下来上切下来pGEX-2XpGEX-2X的插入区的插入区pGEX-1XpGEX-1X的插入区的插入区pGEX-3XpGEX-3X的插入区的插入区4.其他融合蛋白系统其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）（组氨酸标签） 在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨酸（个组氨酸（His）。）

13、。 His-tag能与能与Ni2+柱结合，但很容易被柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。这样的蛋白质有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达位于位于细胞质细胞质细胞周质细胞周质细胞外细胞外表达产物表达产物形式形式包涵体蛋白包涵体蛋白融合蛋白融合蛋白整合型外源蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白 目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是

14、：目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单；表达质粒的构建比较简单； 能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细 胞总蛋白的胞总蛋白的20%20%40%40%。 目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种：目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借 助于身的功

15、能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最助于身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最 终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。包涵体蛋白包涵体蛋白 本质：本质：细胞内蛋白质的不断聚集细胞内蛋白质的不断聚集 包括：包括：1. 1.折叠状态的蛋白质的聚集作用；折叠状态的蛋白质的聚集作用； 2.2.非折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用； 3.3.蛋白质的中间体结构。蛋白质的中间体结构。 优点：优点：易于分离纯化易于分离纯化 在一定程度上保持表达产物的结构稳定在一定程度上保持表达产物的结构稳定 能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的

16、富集能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分， 菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来细菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白包涵体表达形式的优点包涵体表达形式的优点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过以包涵体形式表达的重组

17、蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过 有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生 物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收 率至关重要。率至关重要。 经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性， 有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys 残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过残基

18、数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30% 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。包涵体表达形式的缺点包涵体表达形式的缺点 分离纯化细菌包涵体蛋白质的分离纯化细菌包涵体蛋白质的： 破碎细胞破碎细胞 ( (Disruption of cell) ) 分离包涵体分离包涵体 (Seperation of inclusion body) 溶解包涵体溶解包涵体 (Dissolve inclusion body) 蛋白质产物的构象复原等。蛋白质产物的构象复原等。 (Recovery of target protein conformation)包

19、涵体的复性前准备洗涤：洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。包涵体的溶解 1.采用高浓度的变性剂变性剂，使其形成伸展的肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GuaHCl 6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GuaSCN）最强。 变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中

20、不稳定。有些蛋白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。2.去垢剂去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于（研究）。 3.极端极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如在pH9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。 4.还原剂：还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM DTT，也有使用5mM浓度。实际，还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有

21、二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合剂合剂EDTA去除金属离子。去除金属离子。(伸展态)U(中间态)I(自然态)N A（包涵体） 从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。 蛋白质折叠的三态模型复性目的 复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新

22、聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。 蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。任何一环境不同，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有选个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，

23、才能使进一步的层析分离得以顺利完折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。成。 包含体蛋白复性方法包含体蛋白复性方法几个要求：几个要求： 活性蛋白的回收率高活性蛋白的回收率高 正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离。质分离。 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品 复性过程耗时少复性过程耗时少复性常用方法性常用方法 1.1.稀释复性：稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺直接加入水或复性缓冲液，缺点是体积增加较大，后续处理困难。点是体积增加较大，后续处理困难。 稀释蛋白浓度：稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体浓度高则容易

24、形成聚集体（较低的复性收率）。有时需低于（较低的复性收率）。有时需低于0.01mg/mL0.01mg/mL。 脉冲流加复性：脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中，使折分批次加入到缓冲液中，使折叠中间体保持在较低的水平。例：在叠中间体保持在较低的水平。例：在5-10mg/mL5-10mg/mL终终浓度下，溶菌酶复性收率浓度下，溶菌酶复性收率可达可达80%80%以上以上。 2.2.透析复性：透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操作，无法应用到生产规模。不适合大规模操作，无法应

25、用到生产规模。 3. 3. 超滤复性：超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多许变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的的使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白聚集于膜上）。性（蛋白聚集于膜上）。4.4.色谱复性：色谱复性：辅助手段，兼具分离。辅助手段，兼具分离。 4.1 4.1 凝胶过滤复性：凝胶过滤复性：除了蛋白质在胶粒除了蛋白质在胶粒中传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发中传质和扩散外，蛋

26、白质与介质之间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对用，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白质的复性有利。较慢，对有些蛋白质的复性有利。 4.2 4.2 吸附型层析复性：吸附型层析复性：离子交换、疏水层离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样基本复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未并吸附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白，最

27、后用复性缓冲液将吸吸附的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。附的蛋白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。IB in E. coliIB(solidIB(solid) )Solubilized IBSolubilized IB(unfolded)(unfolded)AggregateAggregateRefolded Refolded Bioactive Bioactive monomer monomerRefoldingRefoldingSolution-stateSolution-stateSolid-state Solid-state refolding

28、refolding 5. 5.分子伴侣：分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。复性。 体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是入分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮将基因工程菌中包涵体溶解，再加

29、入分子伴侣帮助折叠。助折叠。复性过程中的添加剂复性过程中的添加剂 低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。 盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是有效的促进剂。在非变性浓度下是有效的促进剂。S SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS

30、SS SS SS SS S IBDissolved Refolding包涵体分离纯化过程61细细胞培胞培养养收收获细获细胞胞细细胞破碎胞破碎离心离心5 - 10 000g沉淀物沉淀物冲洗和离心冲洗和离心分离包涵体分离包涵体亲亲和和纯纯化和化和复复性性溶解溶解包涵体 - 细胞破碎, 冲洗和分离 每每 100 ml 培养液重新悬浮细胞沉培养液重新悬浮细胞沉淀物於淀物於 4 ml 20 mM Tris -HCl pH 8.0 在冰浴情况下，用超声震荡破碎细在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在胞，并在+4C下高速离心下高速离心 10 分钟分钟 重新悬浮细胞沉淀物於重新悬浮细胞沉淀物於 2 ml 含含

31、 e.g. urea 的冲洗缓冲液和再度超声震荡的冲洗缓冲液和再度超声震荡 并在并在+4C下高速离心下高速离心 10 分钟分钟 用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物622 M UREA20 mM Tris HCl2% Triton X1000.5 M NaCl溶解和准备样品 重新悬浮细胞沉淀物於重新悬浮细胞沉淀物於 5 ml 溶溶解缓冲液解缓冲液 (e.g.):20 mM Tris -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇巯基乙醇pH 863在室在室温温等等 30-60 分分钟钟在在+4C 离心离心 15 分分钟钟用用 0.22

32、 m 或或 0.45 m 濾膜濾膜过过滤滤载体和标记纯化pGEX谷胱甘肽 S-转移酶 GST MicroSpin Purification Module,GSTrap, Glutathione Sepharose Fast FlowPQE6 x 组氨酸His MicroSpin Purification ModulepETHisTrap, HiTrap Chelating, 6 x组氨酸Chelating Sepharose Fast FlowpEZZ 18 (非诱导性表达) 蛋白 A 的 IgG 结合区 IgG Sepharose 6 Fast FlowpRIT2T (利用温度改变诱导)蛋白

33、 A 的 IgG 结合区 IgG Sepharose 6 Fast Flow亲和层析纯化亲和层析纯化65GST 融合蛋白的纯化GST重组蛋白重组蛋白 酶切位点酶切位点Factor Xa:Mr 17-20 000 / 28-30 000Thrombin: Mr 37 000PreScission Protease:Mr 46 000Glutathione Sepharose Mr 26 00010C66SDS PAGE analysis020406080100% Elution buffer00.51.01.52.02.53.03.55.010.015.020.0ml minWashElutio

34、nbuffer2.7 mg pure GST fusion protein5.010.015.020.0A280kD9414.420.13043671 2 3柱柱:GSTrap 1 ml样品样品:8 ml 大肠杆菌表达含 GST 融合蛋白胞浆萃取液结合缓冲液结合缓冲液:PBS, pH 7.3洗脱缓冲液洗脱缓冲液50 mM Tris-HCl, pH 8.0 10 mM 还原谷胱甘肽流速流速:1 ml/min层析层析 步骤步骤:4 CV结合缓冲液, 8 ml 样品, 10 CV结合缓冲液, 5 CV洗脱缓冲液, 5 CV结合缓冲液(CV = 柱体积) 系统系统:KTAexplorer 101:低分

35、子量标记 (LMW) Calibration kit, 还原, Amersham Pharmacia Biotech2:胞浆萃取液, 1 g /10 ml3:洗脱GST 融合蛋白67(His)6 融合蛋白的纯化和检测重组蛋白重组蛋白HisHisHisNi2+HisHisHisHisNi2+Ni2+Ni2+69SDS PAGEFlow through加样结合液洗脱液结合液AA280280AA4054051.00.50.00.700.600.500.400.300.200.100.05.010.015.020.0Volume (ml)ElutedpoolWashkDa94.067.043.020.114,41 2 3 4 5 6 7 8样品样品:5 ml大肠杆菌表达含(His)-标记谷胱甘肽转移酶，GST-(His)6柱柱:HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+结合缓冲液结合缓