食品生物技术导论第2章基因工程

1、1第二章 基因工程与食品产业1 基因工程概述1.1基因工程的概念及主要内容1.1.1基因工程的概念 基因工程是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中得到高效表达，最终共获得人们所需要的基因产物。23l 食品基因工程是指利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和形状，提高食品的营养价值，贮藏加工性状以及感官性状的技术。如转基因食品等41.1.2基因工程的主要内容基因工程应包括以下几个主要的内容和步骤：l （1）从复杂的生物体中，分离出带有目的基因的DNA片段。l （2）在体外

2、将外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。l （3）将重组DNA分子转移到适当的寄主细胞中，并与之一起增殖。5l （4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的寄主细胞克隆即转化子。l （5）从这些筛选出来的转化子克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用。l （6）将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 6基因工程的发展概况l 从上述基因工程的定义，我们可以把基因工程看成由三大“主件”组成的。这三大“主件”包括：带有目的基因的DNA片段、载体DNA分子和受体细胞。l 在基

3、因工程发展的这短短的二十多年中，科学家们对这三大“主件”进行了大量的研究，积累了无数的成果。 7l 分子生物学特别是重组DNA技术的发展与应用使有关基因的结构与功能的研究获得了迅速的发展人们不仅相继发现了断裂基因、重叠基因和假基因等多种新的基因类型同时还相当详尽地弄清了原核和真核基因的结构特征。l 关于基因组核苷酸全序列的测定与分析、是重组DNA技术促进基础生物学研究的又一出色的范例。8l 由于基因克隆技术的发展。已使生物技术在工业生产及医药行业中发挥了重要的作用。重组DNA技术的一个显著特点是它往往可以使一个生物获得与之固有性状完全无关的新功能使人们可以在大量扩增的细胞中生产特殊的蛋白质其意

4、义是相当重大的。9l 农业生产中的一个关键问题是如何培育出高产、优质、抗逆的禾谷类农作物。l 当前基因工程技术已经广泛地应用于这个研究领域尤其是最近10余年以来随着外源基因在转基因植株中首次获得成功的表达。应用重组DNA技术培育具有改良性状的粮食作物的工作巳初见成效、转基因植物的种植面积逐年上升(表1-1)。1011l 转基因植物的工作技其发展水平可以分为三个阶段：第一阶段主要是对有重要农业经济意义的目的基因进行分离与改造；第二阶段的主要目标是培育出具有改良的重要经济性状的工程植株；第三阶段的发展方向是培育出具有生物反应器功能的工程植株。l 现在已经培育成功了一批分别具有抗病、抗虫和抗除草剂性

5、状的转基因农作物。12l 基因工程在转基因动物的利用方面主要是将转基因动物作为专门生产一些特殊药物的“生物工厂”(bio-factories)。l 基因工程仍在深入发展之中。132工具酶和基因载体l 基因工程的操作依赖于许多重要的酶（限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶等）作为工具来对基因进行切割和拼接操作，这些酶被称为工具酶（enzyme of tools）。l 目的基因要进入宿主细胞，有两种方式：1.直接导入2.通过载体的运载 这种在细胞内具有自我复制功能的运载目的基因进入宿主细胞的运载体，叫做基因工程载体（Vector or Carrier）。142.1基因工程的工具酶2.1.1基因克隆

6、所需的核酸酶l 通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸发生水解断裂的酶叫做核酸酶。l 其中专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase）；而特异水解断裂DNA分子的叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）。15l 核酸酶按其水解断裂核酸酶分子的方式不同，可以分两种类型：一类是从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸的消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶（exonuclease）一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片段，叫做核酸内切酶(endonuclease)16l 2.1.1限制性内切酶限制酶能够识别DNA大分子链上特定的核苷酸顺序，并能在某一特定部位

7、将DNA断裂。l 在限制性核酸内切酶的作用下，侵入细菌的外源DNA会被切割成各种片段，而其自身的DNA由于修饰酶（通常是一种甲基化酶）的保护作用而免受限制酶的降解。172.1.1.1限制性内切酶的分类l 限制性核酸内切酶和修饰甲基化酶共同参与了寄主细胞的限制和修饰系统，由此系统的类型可将限制酶分为、型， 型和型酶在同一蛋白中带有修饰（甲基化）和限制活性， 型限制修饰系统则由分别的限制酶和修饰酶组成。18l 型限制酶的典型例子来自大肠杆菌K菌株和B菌株，这些酶是由三个不同的亚基组成的高分子复合物，相对分子量约310000。l 该酶作用除了镁离子外，还需要ATP、S腺苷蛋氨酸（SAM）作为辅助因子

8、，DNA降解的同时ATP水解。l 该酶对双链DNA具有专一性，它与DNA分子上的特定识别序列（非对称序列）相作用，然后酶沿DNA分子移动，移动方向可能在两个方向上均可，并在某一其它部位切断DNA，切裂部位似乎并不确定，但又不是完全随机的。19l 型限制酶除了具有内切酶活力外，还有甲基化酶、ATP酶、DNA解旋酶活力。l 型限制酶相对分子量大，结构复杂，辅助因子多，作用机制复杂的缺点，切识别位点与切割位点不一致，切除片段重复性不高，所以这种酶的使用受到很大限制20l 型限制性内切酶首先来自流感嗜热杆菌。此酶是一类分子量较小的单体蛋白，仅需要镁离子作为辅助因子，该酶没有甲基化修饰功能，这类酶在基因

9、工程实验中相当常用。l 型限制性内切酶有特定的识别位点和切割位点，识别序列约为4-12bp，约有一半的型限制性内切酶的切割位点是6个核苷酸21l 型限制酶的识别位点和切割位点比较接近，大约在25-27bp，切割产物的5端突出2-3个核苷酸，它的作用辅助因子与型酶相同，有甲基化修饰功能，无ATP酶和DNA解旋酶活力。l 型限制酶在重组DNA分子建造中有特殊的价值，在DNA分子进入载体后，可作为试剂识别特殊的DNA序列。222.1.1.2 限制性内切酶的命名l 其命名原则是，用具有某种限制性内切酶的有机体学名缩写来命名：1. 有机体属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的前两个字母（小写，斜体）构成

10、基本名称；2. 株系数字通常省略，如果酶来自于特殊菌株中，应加上菌株名称符号；3. 罗马数字用来表示从同一个细菌中分离出来的不同的限制性内切酶。23表1限制性内切酶命名名称EcoRHindHindHpa 属名（大写、斜体）EHHH种名（小写、斜体）coininpa株名Rdd-序数来源菌株Escherichia coli R株Haemophilus influenzae d株Haemophilus influenzae d株Haemophilus parainfluenzae24l EcoR是最早发现的型限制性内切酶，它可以特异地结合在一段6个核苷酸的DNA区域里，在每条链的鸟嘌呤和腺嘌呤之间切

11、断DNA链,产生两个单链末端，每个末端会有4个核苷酸延伸出来，这种双链DNA中没有配对的碱基末端被称为黏性末端（cohesive ends）。2526型限制性内切酶的作用特点l 型限制性内切酶的识别特点：大多数酶识别顺序很严格，有少数有变动的余地；识别序列的碱基数一般为4-6个碱基对，一般都富含GC；大多数识别位点具有180o旋转对称性（或称为回文结构，核酸的这种结构与在生物体内和蛋白作用有关），少数酶切割位点在识别位点外，也具有旋转对称性；型酶的识别顺序中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的外切割作用。27一些限制性内切酶的识别位点28l 型限制性内切酶的切割方式：型限制性内切酶的切割位点绝大

12、多数在识别顺序中，或在识别顺序的两个组成部分之间（如Bgl）。只有极少数例外，它们的识别顺序是不对称的，切割发生在识别顺序之外。l 切割方式有三种，就切割位点相对于二重对称轴的位置而言，在对称轴5侧切割产生5粘性末端，在对称轴的3 侧切割产生3粘性末端，在对称轴切割产生平端。29l 型限制性内切酶的识别位点与切割方式之间的关系，可以分为以下四种：1.识别顺序不同，切割方式也不同。2.识别顺序不同，切割产生的粘性末端相同，这类酶称为同尾酶，此时两种酶产生相同的粘端，可用连接酶将其连接起来。3.识别顺序相同，切割方式不同。4.相同的识别顺序，切割方式亦相同，如Hpa 与Msp，但Msp能切割甲基化

13、的胞嘧啶通常我们将来源不同，但能切割同一靶序列的酶称为同裂酶或异源同功酶30l 限制性内切酶产生的末端的连接1.匹配末端的连接：用同一种酶酶切产生的带相同突出端的两个片段；或用不同的酶酶切但带有相同突出端的两个片段，可在连接酶作用下连接。2.平端连接：可以直接连接，连接效率较低。3.不匹配粘端连接：一种是采用Klenow酶将粘端补平，或用S1酶切除突出的核苷酸后再用连接酶连接；二是用Klenow酶将粘端部分补平。31限制酶反应的影响因素1.温度：一般最适反应温度为37左右2.缓冲液：不同的酶对离子强度、pH值有不同的要求，一般分为低盐、中盐和高盐3.时间：主要取决于加入的酶量与DNA的量之间的

14、关系，通常作用时间为1-1.5小时4.反应体积和甘油浓度：商品化的限制酶均加甘油作为保护剂，所以在酶反应时，加酶量不宜太多，否则甘油浓度偏高，影响反应5.DNA纯度和结构：DNA样品中的蛋白质、有机溶剂及RNA等杂质均会影响酶切反应的速度和酶切的完全程度32星号活性l 在商品目录或某些论著中，一些酶被打上星号（*），如EcoR*意思是说在反应体系变化时，酶的性能甚至酶切位点可能会改变关于星号活性的机制还不清楚，维持反应体系适当的离子强度、低温或低酶浓度，缩短反应时间可以克服星号活性l 限制酶识别位点的两头必须有一定长度的旁侧序列才能被相应的酶作用332.1.1.3限制性内切酶的主要用途1. 在

15、特异位点上切割DNA，产生特异的限制性内切酶切割的DNA片段；2. 建立分子的限制性内切酶物理图谱；3. 构建基因文库；4. 用限制性内切酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA。342.1.2DNA连接酶l 能将两段DNA拼接起来的酶叫做DNA连接酶（ligase）。该酶催化DNA相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，将DNA单链缺口封合起来。l DNA连接酶的作用需要ATP或NAD+作为辅助因子l DNA连接酶的来源有两种：一种来自大肠杆菌，以NAD+作为能源；一种来源于T4噬菌体，以ATP为能源，两种酶作用机理相同35T4 DNA连接酶的作用36l T4DNA连接酶为相对分子量680

16、00的多肽，是T4噬菌体感染大肠杆菌而产生的。它的用途有：1. 链接带匹配黏端的DNA分子2. 使平端的双链DNA分子互相连接或使合成的接头相连接37382.1.3DNA聚合酶l DNA聚合酶（ DNA polymerase）在细胞内的DNA复制过程中起着重要的作用。通常分为DNA聚合酶、型三类。l 其中pol和pol主要参与DNA修复过程， pol则同DNA复制有关，基因工程中主要应用的是DNA聚合酶。39l 基因工程中很多都需要DNA聚合酶催化DNA体外合成反应，这些酶作用均需要模板，合成产物的序列与模板互补，基因工程中常用的DNA聚合酶有：1. 大肠杆菌聚合酶(全酶)2.大肠杆菌聚合酶大

17、片段（Klenow片段）3.T4噬菌体DNA聚合酶404. T7噬菌体聚合酶及经修饰的T7噬菌体聚合酶（测序酶）5. 耐热DNA聚合酶（Taq DNA 聚合酶）6. 末端转移酶7. 逆转录酶（依赖于RNA 的DNA 聚合酶）41422.1.3.1大肠杆菌DNA聚合酶l 该酶相对分子量为109000，是一条约1000个氨基酸残基的多肽酶。它有三种活性：1. 53 DNA 聚合酶活性：催化结合在DNA模板链上的引物核酸3-OH与底物dNTP的5磷酸基团之间形成磷酸二酯键，释放出焦磷酸并使链延长，延长方向532. 3 5外切核酸酶活性：即从游离的3-OH末端降解单链或双链DNA称为单核苷酸，其意义在

18、于识别和消除不配对的核苷酸43443. 53外切核酸酶活性：从5末端降解双链DNA成单核苷酸或寡核苷酸，液降解DNARNA杂交体的RNA成分45l 该酶的主要用途1. 用切口平移方法标记DNA：用于制备核酸分子杂交用探针 。在条件严格控制下，可以使单链缺口只发生聚合作用，无3 5核酸外切酶活性，生长链取代亲本链，DNA探针形成。2. 3粘端的末端标记：3. 使用其53外切核酸酶活性降解寡聚核苷酸作为合成cDNA第二条链的引物462.1.3.2大肠杆菌聚合酶Klenow片段l 相对分子量76000，为一条单多肽链，与大肠杆菌聚合酶全酶相比，少了53外切核酸酶活性。其主要用途为：1. 随机引物标记

19、核酸探针2. 补平DNA5粘端或进行3端标记3. cDNA克隆中，用于合成第二条cDNA链4. 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA5. 应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序472.1.3.3 T4噬菌体DNA聚合酶l 相对分子量114000，功能与Klenow片段相似。但其的3 5外切核酸酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA的作用更强，而且外切酶活性比Klenow片段强200倍。48l 其主要用途：1.补平或标记限制性内切酶切割DNA产生的3凹端2.对带有3突出端的DNA分子进行末端标记3.标记作探针用的DNA片段4. 将双链DNA的末端转化为平端5. 使结合于单链DNA模板上的诱变

20、寡聚核苷酸引物得到延伸492.1.3.4T7噬菌体聚合酶及经修饰的T7噬菌体聚合酶（测序酶）l 该酶的持续合成能力是DNA聚合酶中最强的，所催化合成的DNA平均长度比用其它聚合酶所合成的DNA长度长得多。 3 5外切核酸酶活性很强，比Klenow片段强1000倍，无53外切核酸酶活性。其主要用途为：1. 用于拷贝片段模板的引物延伸反应2. 通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记3. Sanger双脱氧测序法对长片段DNA进行测序用502.1.3.5耐热DNA聚合酶（Taq DNA 聚合酶）l 相对分子量65000，是一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶。l Taq DNA聚合酶分离自水栖高温

21、菌，其最适反应温度为75-80摄氏度，且经90摄氏度以上的加温后仍可在温度恢复后复性。所以这种酶特别适合于在不同温度点进行循环加温与降温而不丧失酶的活性。因此被广泛应用于各种PCR。 51表2 DNA聚合酶特性聚合酶名称35 核酸外切酶活性53核酸外切酶活性聚合酶反应速度持续合成能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中速低Klenow大片段酶低无中速低逆转录酶无无低速中T4DNA聚合酶高无中速低T7DNA聚合酶高无快速高TaqDNA聚合酶无有快速高522.1.3.6末端转移酶l 末端转移酶发现于哺乳动物胸腺，它能催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3羟基末端上，催化作用不要求有模版，但需要有Co2+的存在。

22、末端转移酶可给一些DNA的3羟基末端接上寡dA或dG，另一些DNA的3羟基末端接上寡dT或dC，混合这些分子，即可使同聚物尾部退火形成环状分子nppin)PdN(DNAndNTPDNA22CoMgOH或53l 末端转移酶的主要作用：1. 给载体或cDNA加上互补的同聚尾2. DNA片段3末端的放射性同位素标记54552.1.3.7逆转录酶l 来源于禽类成髓细胞白血病病毒，又称为依赖RNA的DNA聚合酶。该酶催化以单链RNA为模版生成双链DNA的反应。由于该反应中遗传信息流动方向与绝大多数生物转录生成方向相反，故此反应称为逆转录作用。l 逆转录酶具有三种活性：1. RNA 指导的DNA合成反应2

23、. DNA指导的DNA合成反应3. RNA的水解反应56Reverse transcription 逆转录逆转录RNA 3 35 (reverse primer 反向引物反向引物)5 3 3Reverse transcription （逆转录）（逆转录）Transcription（转录）（转录）Section 2 Enzymes and vectorsDNADNA57l 基因工程中有两种商品化的逆转录酶：一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（avian myoblastosis virus，AMV）提取的；另一种是Moloney鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus

24、，Mo-MLV）克隆的逆转录酶编码基因在大肠杆菌的表达产物。58l 禽源逆转录酶和鼠源逆转录酶均属多功能酶，它们的共同性质是：具有RNA指导的DNA聚合酶活性，可以RNA为模板，以寡聚脱氧核糖核苷酸为引物，合成互补的DNA（cDNA）；具有DNA指导的DNA聚合酶活性，但不具DNA聚合酶那样的35外切酶活性；具有RNaseH活性，即从5或3端连续地降解RNA DNA杂种双链中的RNA部分。 59l 在基因工程中，逆转录酶的主要用途是：将真核基因的mRNA转录成双链cDNA，构建cDNA文库，进行克隆实验；对具有5突出端的DNA片段的3端进行填补（补平反应）和标记，制备探针；代替Klenow大片

25、段，用于DNA序列测定。602.1.4碱性磷酸酯酶l 在基因工程中得到广泛使用的碱性磷酸酶主要有两种：1.从大肠杆菌提取的BAP;2.从牛小肠提取的CIP； 这两种酶均能去除DNA、RNA、rNTP、dNTP的5磷酸基，产生5羟基末端。61l 基因工程中碱性磷酸酶主要用于：1. 用32P标记5末端前，先去除其DNA和RNA的5磷酸基2. 去除DNA线性分子末端的5磷酸基，防止片段间彼此相连。克隆载体经限制性内切酶酶切后为了防止自身连接，需用此酶处理除去5磷酸基62632.1.5 Sl核酸酶l Sl核酸酶来自米曲霉，分子量为32000，它是单链特异性核酸酶，以核酸内切的方法降解单链DNA或RNA

26、，也能作用于双链核酸分子的单链区，对双链DNA或RNADNA杂合双链无作用。该酶在基因工程中主要用于：1. 给RNA分子定位2. 检测核酸杂交程度、双链DNA二级结构差异3. 去除DNA粘性末端而产生平端4. 打开cDNA中的发夹结构，使其成平端64表3基因工程常用的核酸酶核酸酶名称主要功能型限制性内切酶在特异的碱基序列部位切割DNA分子DNA连接酶将两条DNA分子或片段连接成一个整体大肠杆菌DNA聚合酶通过向3端逐一增加核苷酸的方式填补双链DNA分子上的单链缺口逆转录酶以RNA为模板合成互补的cDNA链多核苷酸激酶把一个磷酸分子加到多核苷酸的5-OH末端末端转移酶将同聚物尾部加至线性双链DN

27、A分子或单链DNA分子的3 -OH末端核酸外切酶从一条DNA链的3端移去核苷酸残基65表3基因工程常用的核酸酶（续）核酸外切酶催化自双链DNA分子的5端移走单核苷酸，因此暴露出延伸的单链3端碱性磷酸酶催化从cDNA分子的5端或3端或同时从5端和3端移去末端磷酸S1核酸酶催化RNA和单链DNA分子降解为5单核苷酸，同时也可以切割双链核酸分子的单链区Bal核酸酶具有单链特异的核酸内切酶酶活性，也具有双链特异的核酸外切酶活性TaqDNA聚合酶能在高温（75）下以单链DNA为模板按35方向合成新生互补链662.2基因工程的载体l 理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： 能在宿主细胞中复制繁殖，而且

28、最好要有较高的自主复制能力。容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。67容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。l 目前常用的基因载体有：细菌质粒载体、农杆菌质粒载体、噬菌体载体、柯氏质粒载体和病毒载体等682.2.1质粒载体l 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。69l 其特点如下：是染色质外的双链共价闭合环形D

29、NA（covalently closed circuar DNA，cccDNA）；能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。70l 按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：1. 严紧控制（stringent control）型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝；2. 另一类是松弛控制（relaxed control）型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。l 有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中，随宿主DNA复制，称为附加体。71质粒对宿主生存并不是必需

30、的。这点不同于线粒体，线粒体DNA也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存。例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒。7273l 根据质粒是否带有促进细菌间接合转移的基因。可将其分为“接合型”(conjugative)与“非接合型”(non -conjugative)。接合型是指细胞质粒通过纤毛从一个细胞转移到另一个细胞的过程。l 按照质粒的“不相容性”(incompatibility)又可以将质粒分为若干个不相容群。

31、所谓质粒的不亲和性，有时又称不相容性，是指在没有选择压力的情况下。两种不同质粒不能共存于同一宿主细胞内的现象。74l 构建一种质粒载体，通常有以下几方面的要求：质粒载体的相对分子量应尽可能的小；应该有用来克隆外源DNA的限制性内切酶的识别位点；应该有一个或多个选择性标记。75l 现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体，近年来发展很快，新的有特定用途的质粒不断被创建。下面给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pBR322的图谱 76772.2.1.3酵母质粒载体l 除常用的大肠杆菌质粒载体外

32、，近年来发展了许多人工构建的其它能用于微生物、酵母、植物等的质粒载体。l 选择酵母载体的必须慎重考虑以下几个标准：大肠杆菌和酵母均有适当的遗传标志；结合实际需要，考虑在酵母中的复制方式；在酵母和大肠杆菌中的拷贝数；要有简单易行的筛选插入物的方式。78l 根据转化细胞中的复制机制，可将酵母质粒载体分为整合型载体（YIP）、自我复制载体（YRP）和附加型载体（YEP）。以上三种类载体的共同特点是：1.能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数，这样可以使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增2.含有在酵母中便于选择的遗传标记，这些标记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补3.含有合适的酶切位点，以便

33、外源基因插入79整合型载体 （YIP）l 整合型酵母载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的，YIP载体不能在酵母细胞中自我复制，但可以转化后导入受体细胞并通过与受体DNA的同源重组，整合到染色体上，并随染色体一起复制，这样的质粒DNA以单拷贝基因形式稳定的遗传。l YIP载体转化效率低（1-10转化子gDNA），但转化子稳定，多用于遗传分析工作。80自我复制载体 （YRP）l 自我复制型酵母载体因在酵母中有自我复制的能力而得名。l YRP载体是酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。l 由于它同时含有酵母和大肠杆菌的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制，这种载体又称为穿梭载体（

34、shuttle vector），即可在两种不同的生物细胞中复制的载体81l YRP载体对酵母的转化率极高（102-103转化子/ gDNA ）,拷贝数也较高。YRP质粒以cccDNA（共价闭合环状DNA）分子形式存在，容易提取，但在供体细胞中不稳定，易丢失。82附加型载体l 附加型载体（YEP）一般由大肠杆菌质粒、酵母天然质粒（2m质粒）以及酵母染色体的选择标记构成。YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般103-105转化子/ gDNA ，比YRP更稳定，拷贝数也更高。l 在使用酵母中的克隆载体时，稳定性和拷贝数是一对矛盾，稳定遗传的YIP是低拷贝的，而高拷贝数的YRP、YEP又不稳定，因

35、此在使用这类载体时，可根据不同的目的进行选择和改造。832.2.2噬菌体载体 2.2.2.1噬菌体和噬菌体载体的特点 l 噬菌体是寄生在细菌中的病毒，故又称细菌病毒。不同种类的噬菌体颗粒在结构上差别很大，可分为3种类型：大多数噬菌体是具有尾部结构的二十面体，看起来像一种小型皮下注射器，如T4噬菌体另两种是无尾部结构的二十面体型和线状体型（如M13噬菌体）84 T4噬菌体结构8586l 噬菌体作为载体，可插入长10kb20kb甚至更大的一些外源DNA片段。又由于噬菌体有较高的增殖能力，有利于目的基因的扩增，从而成为当前基因工程研究的重要载体之一。野生型的噬菌体必须经过改造，才能成为比较理想的基因

36、工程载体。 872.2.2.2噬菌体的生命周期和特点l 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶原周期两种不同的类型8889l 温和噬菌体是既能进入溶菌生命周期，又能进入溶源生命周期的噬菌体。l 溶源性细菌是具有一套完整的噬菌体基因组的细菌l 用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程，叫做溶源化。在溶源性细菌中存在的整合或非整合的噬菌体DNA叫原噬菌体l 整合是指噬菌体DNA易插入到寄主细菌染色体之中，以游离DNA分子形式存在的噬菌体DNA叫非整合噬菌体DNA90l 被感染形成的溶源性细菌，由于细胞内具有原噬菌体，故不能被第一次感染的同种噬菌体再感染，也就是说溶源性细菌具有了抵御同种噬菌体再

37、感染的能力，这一现象叫做超感染免疫性。l 经过许多世代之后，溶源性细菌也能够开始溶源周期，这时噬菌体的基因组以单一DNA片段的形式从寄主染色体DNA上删除下来，这一过程叫做溶原性细菌的诱发。912.2.2.2噬菌体 l 噬菌体是一种温和噬菌体。噬菌体由头部和尾部两个部分组成，头部为正二十面体结构，内装噬菌体核酸。9293l 在寄主范围方面，噬菌体比质粒载体要狭窄得多，因此作为基因克隆载体自然也就更加安全。l 在噬菌体的两端，各有十二个碱基的单链互补粘性末端，当噬菌体DNA进入宿主菌体后，会迅速通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。l 这种由粘性末端结合形成的双链区段，称为cos位点（coh

38、esiveend site）94952. 噬菌体载体的构建l 野生型的噬菌体本身不适宜于作为克隆载体来用，主要原因是 DNA对大多数常用的限制酶有较多的切割位点。l 噬菌体之所以能够改造成为克隆载体是因为 DNA中的J基因到N基因区段为非必要区。l 改建的基本步骤是先将所有的噬菌体存在过多的限制酶位点移去，然后应用遗传重组技术插入一个期望的DNA片段。96l 目前构建出了多种噬菌体载体，这些可归纳成两种不同的载体类型，即插入型载体(insertion vector)和置换型载体(replacement vector)。(1)插入型载体 只具有一个限制酶位点可便于外源DNA插入的噬菌体称为插入型

39、载体。外源DNA片段克隆到插入型载体上后会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插人失活效应，这也为克隆基因的选择提供了表型。常用的有免疫功能失活和大肠杆菌-半乳糖苷酶失活两种。97 (2)置换型载体 置换型载体的基因组中具有成对的限制酶位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被插入的外源DNA片段所取代。983 DNA的体外包装 正常的噬菌体能够在其本身所编码的基因中，利用寄主细胞内原材料表达成各种有活性的蛋白或酶，经一系列反应变化，最后组装成完整的噬茵体颗粒。基本过程如图632所示。99100l 所谓噬菌体DNA的体外包装，是指在试管中完成噬菌体在寄主细胞内的全部组装过程。l 其基本原理是

40、噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部的基因发生突变，噬菌体只能形成尾部；而尾部基因发生了突变的噬菌体只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体提取物混合起来，就能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颖粒。101102l 噬菌体DNA的包装有一定的限制，这是因为噬菌体头部外完蛋白对DNA的容纳量是有一定限度的。l 包装限制说明， 噬菌体作载体对外源DNA片段的大小有比较严格的要求，这是在应用载体时必须注意的。1032.2.2.3 M13载体l M13是一种丝状大肠杆菌噬菌体，经改造后作为单链的DNA载体，表现出许多其他载体所不具备的优越性。l M13感染细菌后呈双链复制型（RF）DNA。M13作

41、重组DNA的载体有两个特性，一是允许包装大于病毒单位长度的外源DNA，二是感染细菌后，复制环状DNA经包装形成噬菌体颗粒，分泌到细胞外而不产生溶菌。 104l 这一特性不仅便于分离单链的DNA，而且在产生大量的单链DNA中，含有外源DNA序列，因此应用价值极大：用于DNA序列分析；用于制备杂交探针；用于定点突变。 1052.2.3粘性质粒载体 l 粘性质粒载体（也称柯斯质粒载体或粘粒，cosmid vector）是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。l 柯斯质粒比噬菌体具有更大的克隆能力，在真核基因的克窿中起到巨大的作用。1061柯斯质粒载体的组成l 柯斯质

42、粒的大小为46kb，这类质粒的基因组都由三部分组成：一个抗药性标记和一个质粒的复制起始部位一个或多个限制酶酌单一切割位点一个带有噬菌体的粘性末端片段1071082柯斯质粒载体的特点l 柯斯质粒的特点大体上可以归纳为以下4个方面：1.具有噬菌体的特点2.具有质粒载体的特性3.具有高容量的克隆能力4.具有与同源序列的质粒进行重组的能力1093柯斯质粒载体的应用上述的噬菌体载体在噬菌体的正常生命周期中，会产生出数百个由cos位点连接的DNA组成的多连体。同时， 噬菌体还具有一种位点特异的切割体系，或叫做末端酶(terminase)或Ter体系，它能识别两个距离适宜的cos位点，把多连体分子切割成单位

43、长度的片段，并把它们包装到噬菌体头部中去。1101112.3基因工程的基本技术1.核酸分子的提取l 核酸分子是基因工程的主要研究对象，核酸样品的质量直接关系到实验的成败l 核酸包括DNA和RNA，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在l 真核生物染色体DNA为双链线性分子l 原核生物、质粒和真核细胞器的DNA为双链环状分子，RNA一般为单链线性分子112l 核酸的存在位置：原核细胞DNA均在核内真核生物95的DNA存在于细胞核内，5在细胞器内（线粒体、叶绿体等）RNA分子约有75存在于细胞质中，10在细胞核内，15在细胞器内113l 总DNA的提取一般的说，总DNA主要是指基因组DNA，即细

44、胞核内的染色体DNA分子。核DNA分子呈极不对称的线状结构。真核生物细胞的破碎方法有很多种，一些如超声波法、匀浆法等物理方法易导致DNA链的断裂，所以一般采用去污剂温和处理方法。对于细胞破碎较困难的细胞可以添加蛋白酶K，在酶的作用下共同破碎细胞。114l 植物总DNA的提取方法从提取原理上主要有以下两种：1.十六烷基三乙基溴化铵法（CTAB）：CTAB是一种去污剂，可以溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶解，当降低溶液盐浓度到一定程度时可沉淀。CTAB法的优点是能很好的去除糖类杂质，在提取前期能同时得到高质量的DNA和RNA1152.SDS（十二烷基硫酸钠）法：其原理是利用高浓度

45、的SDS在较高温度（55-65）下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度及降低温度使蛋白和多糖沉淀，离心除去沉淀后将上清液中的DNA进行反复抽提除去蛋白质，用乙醇沉淀水相中的DNA。该法操作简单、条件温和，也可提取到高分子量的DNA，但所得产物含糖类杂质较多116RNA的提取l RNA主要包括：rRNA（核糖体RNA，占总量的80-85）tRNA（转移RNA）和核内小分子RNA 占总量的10-15mRNA（信使RNA，占总量的1-5）117l RNA分离的关键因素在于尽量减少RNA酶的污染。造成RNA酶污染的主要来源有：所用的器皿所用的溶液实验人员的手l 常用的RNA提

46、取方法有：1.异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法：使用蛋白质强变形剂异硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，用CsCl介质进行密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA和蛋白质处于上清液1182.盐酸胍-有机溶剂法：本法适用于没有超速离心设施的情况下提取细胞RNA，它利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提除去蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子而除去DNA。提取的RNA质量较好，但操作费时繁琐3.氯化锂-尿素法：利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，氯化锂选择性沉淀RNA。缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会对是一些小分子量的RNA，优点是快速简便，适用于大量样品少量组织细胞的RN

47、A提取1194.一步热酚快速抽提法：基本1987年Shomczynki和Sacchi两人提出的RNA快速提取法，目前已有商品试剂盒，使操作更为简便，其优点在于：将已知最强的RNase抑制剂异硫氰酸胍、-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用RNA选择性的进入物DNA和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩，对大量或少量的组织细胞RNA提取均合适120可在3小时以内处理大批样品，省略了氯化铯密度梯度超速离心及其他方法使用的长时间选择性乙醇沉淀或氯化锂沉淀。121l 质粒DNA的提取应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子质粒的提取方法很多，有以下三个主要步

48、骤：细菌的培养、细菌的收集、质粒DNA的分离和纯化1.从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到含有抗生素的培养基中培养，然后通过离心回收菌体，即可从中纯化质粒。对于拷贝数较低的质粒，可使用氯霉素抑制宿主蛋白质的合成，使细菌胞内的质粒数大幅增加1222.细菌细胞裂解的方法很多，但共同的步骤如下：细胞溶菌酶和EDTASDS碱处理复性离心上清液有机溶剂沉淀1233.1.1.1结构基因组成l 作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转录启动子、基因编码区和转录终止子。l 启动子是DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列，转录mRNA的第一个碱基被定为转录起始位点，这个碱基多数情况下是A，以此作

49、为序列的+1，其上游的核苷酸为-，下游的核苷酸为+。124l 基因编码区包括起译码ATG、开读框和休止码TAA（或TAG、TGA）。l 终止子是一个提供转录停止信息的核苷酸序列，不同类型基因组的基因组成稍有不同。因此必须根据基因组类型和实验需要来分离含目的基因的DNA片段。1253.1.1.2原核生物结构基因的组成l 原核生物的基因多数以操纵子形式存在，完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同一个启动子的调控之下，下游同具一个终止子l 两个基因之间存在着长度不等的间隔序列，但有例外。126l 原核生物的启动子含-35序列保守区5TTGACA3，提供RNA聚合酶识别的信号；-10序列保守区5TA

50、TAAT3，DNA双链从此处解开转录。l 操纵子除启动子外，往往还有一些调控转录的其它因子，如乳糖操纵子除启动子（p）外，还有调节因子（i）和操纵因子（o）127l 原核基因在起译码ATG上游约10bp处，有一个富含嘌呤核苷酸的SD保守序列区，一般为GGAGGA（以G为主），由此区转录的序列是翻译时核糖体识别、结合mRNA的位置。核糖体由此位置向前移动，寻找起译码AUG。l 原核生基因转录终止之前有一段回文序列结构，称为终止子，使RNA聚和酶减缓移动或停止RNA的合成，但不是所有的回文序列结构都是终止子。1283.1.1.3真核生物结构基因的组成l 真核生物染色体基因组的基因是单独存在的，并且

51、两个基因之间有很长的间隔序列区，甚至起译码和休止码之间除编码序列区外还有一至多个非编码序列间隔区，称为内含子，而编码序列区称为外显子。129l 真核生物结构基因的转录启动子通常包含3个保守序列区：在-20到-30序列区有一个TATA框，DNA双链在此处开始解开；在-75序列区有一个CAAT框，其作用是与RNA聚合酶结合有关；在更上游处有一个GC框，是某些转录调控因子结合的序列。130l 对真核生物基因转录终止信号和终止过程目前了解不多，不过发现高等真核生物结构基因休止码序列下游有一保守的AATAAA序列提供转录产物的释放信号。l 此外，真核生物染色体基因组的结构基因不具SD序列区，核糖体与转录

52、的mRNA结合靠mRNA5端添加的“帽”结构。131目的基因的分离l 根据实验需要，待分离的目的基因可能是包含转录启动区、基因编码区和终止区的全功能基因，甚至是一个完整的操纵子或由几个功能基因、几个操纵子聚集在一起的基因簇；l 也可能是只具有基因的编码区，甚至是只含启动子或终止子等元件的DNA片段；而且不同基因组类型的基因大小和基因组组成也各不相同。l 因此分离目的基因应采用不同的途径和方法132l 目前采用的分离、合成目的基因的方法有很多种，下面介绍一部分：1. 鸟枪法 首先利用物理方法或酶化学方法（限制性内切酶法）将生物细胞染色体切割成很多基因水平的片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将

53、重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。 由于目的基因在整个基因组中太少太小，所以这个方法称为“鸟枪法”或“散弹枪”试验法。1333.1.1.2物理化学法l 利用核酸DNA双螺旋之间存在着碱基G和C配对，A和T配对的这一特性，从生物基因组分离目的基因的方法。常用的方法有：1. 密度梯度离心法2. 单链酶法3. 分子杂交法134分子杂交法135化学合成法l 根据氨基酸顺序以及密码关系可以推测出目标基因的一种可能的碱基排列方式，由此可用化学法进行合成（全合成或半合成）。1363.1.1.4通过构建cD

54、NA文库和基因组文库分离目的基因l 通过转录和加工，每个基因转录出相应的一个mRNA分子，经反转录可产生相应的cDNA（互补DNA）。这样产生的cDNA只含基因编码序列，不具有启动子、终止子和内含子。l 某生物基因组经转录和反转录产生的各种cDNA片段分别与合适的克隆载体连接，通过转导（转化）贮存在一种受体菌的群体之中。把这种包含某生物基因组全部基因cDNA的受体菌群体称为该生物cDNA文库。137l 从概率原则来看，只有当此文库中重组子总数达到某一数目时，才能包含基因组中所有基因，才可称之为完整基因组文库。构成完整基因组文库所需要重组子的数目，主要取决于基因组的大小和目的基因片段的大小两个参

55、数。138l 对于某一特定的基因组构成其DNA文库所需的重组子的数目，在很大程度上与构建文库所用的载体的容量紧密相关。l 构建高等植物基因组DNA文库时，通常采用噬菌体载体和粘性质粒载体，因为它们具有更大的克隆容量。139l 基因组文库的构建一般包括下列基本步骤细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；载体DNA的制备；载体与外源大片段连接；体外包装及基因组DNA文库的扩增；重组DNA的筛选和鉴定140141cDNA的合成和克隆l 利用纯化的总DNA在逆转录酶作用下合成互补的DNA即cDNA，再按上述构建基因文库的类似方法对cDNA进行克隆，由此获得的克隆总称为cDNA文库。142l 构建c

56、DNA文库通常包括：mRNA的提取及其完整性的确定；cDNA的合成和克隆；目的cDNA的鉴定等步骤。143cDNA的合成和克隆144（3）cDNA与载体的重组 合成的cDNA与载体DNA进行连接一般有3种方法。借助于末端转移酶的3OH端合成均聚物的能力，双链cDNA和线性化载体DNA的30H端分别加上均聚核苷酸链。双链cDNA和线性化载体DNA分别用Klenow片段进行末端补平，然后用T4DNA连接酶进行齐头连接，形成重组分子。通过粘性末端连接。145（4）转化 受体菌株经氯化钙处理后成为感受态，可以较高的效率接受外来DNA进入。重组体载体DNA分子在一定条件下转化大肠杆菌，形成携带质粒的菌株

57、。当不同重组的DNA含有不同的cDNA基因时，整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这样的转化子群体构成该mRNA群体全部遗传信息的cDNA基因文库。146(5)特定cDNA的克隆 特定cDNA克隆的获得可以有以下几种方法。从某组织总mRNA为模板得到的cDNA基因文库中分离特定的cDNA克隆从该蛋白质已知序列推知C末端56个氨基酸的相应DNA序列，合成一组寡聚脱氧核苷酸片段作为引物。在总mRNA中这组引物只与该蛋白质的mRNA可以氢键配对，以此引物进行逆转录酶反应，得到特异性cDNA用逆转录PCR技术可以得到特定cDNA杂交选择法筛选特定mRNA。147(6)目的cDNA克隆的鉴

58、定用于从cDNA文库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有3种：核酸杂交；免疫学杂交检测；cDNA的同胞选择。148PCR技术l PCR技术的发明 PCR技术是在核酸研究的基础上发展起来的。l PCR的反应体系所要具备的条件：1.要由于被分离的目的基因的DNA双链两端的序列相互补的DNA引物（约20个碱基）2.具有热稳定性的酶（如Taq DNA 聚合酶）3.dNTP4.作为模板的目的DNA序列 一般PCR反应可扩增出1005000bp的目的基因片段。变性53533535引物复性35355335P1P2延伸35355335P1P2再变性再复性P1P1P2P2再延伸参与参与PCR反应的主要试剂：反应

59、的主要试剂：1. 上下游引物上下游引物(10-50pmol)2. 缓冲液缓冲液(pH 8.3)3. Mg+(0.5-2.5mM)4. dNTPs (0.2mM)5. Taq DNA聚合酶聚合酶(2.5U)6. DNA模板模板(1ng)P1P1P2P2短片段以指数形式扩增短片段以指数形式扩增长片段以线性形式扩增长片段以线性形式扩增最终主产物片段长度在最终主产物片段长度在P1-P2之间之间PCR循环的主要参数：循环的主要参数：1. 预变性：预变性：92C-95 C， 2-5min2. 变性：变性： 92C-95 C，30s-1min3. 复性：复性： 40 C-60 C，20s-2min4. 延伸

60、：延伸： 70 C-75 C，30s-3min5. 总延伸：总延伸：72 C， 7minPCR技术的特点（1）特异性强（2）敏感性高；（3）快速；（4）简便；（5）可扩增cDNA或RNA（6）对起始材料质量要求低；（7）具有一定程度单核苷酸错误掺入引物设计：引物设计：1.长度在长度在15-30bp，GC含量在含量在45-55%之间。之间。Tm=4(G+C)+2(A+T)。2. 碱基分布表现出随即性，避免相同碱基碱基分布表现出随即性，避免相同碱基连续排列。连续排列。3. 3不能与引物内部互补，以免形成二级不能与引物内部互补，以免形成二级结构。结构。4. 两个引物各自的两个引物各自的3不能互补，以