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1、病毒的复制 Eclipse/latent period(隐蔽期隐蔽期): 病毒即失去了完整的可见形态，病毒即失去了完整的可见形态， 同时也丢掉了感染性，用一切血清学方法和电镜检查，同时也丢掉了感染性，用一切血清学方法和电镜检查， 在细胞内已不能找到病毒颗粒。在细胞内已不能找到病毒颗粒。 复制周期复制周期(replication cycle)七大类型七大类型, 七种复制方式：七种复制方式： 区域：区域： DNA病毒病毒 核内（除痘病毒）核内（除痘病毒） RNA病毒病毒 胞质（除流感病毒及部分副粘病毒）胞质（除流感病毒及部分副粘病毒） You should remember1. Double st

2、randed DNA: dsDNA There are 22 families, such as Adenoviridae, Hepersviridae Topology is critical: linear or circular Using host or viral DNA dependent RNA polymerase to make mRNA2. Double strand gapped DNA genomes, hepatitis B virus The gap need to be filled to make ds DNA before make mRNA DNA is m

3、ade from the virus encoded, reverse transcriptase3. Single stranded DNA: ssDNA There are 5 families and 1 genus, such as Circoviridae, Parvoviridae (adeno-associated virus) Topology : linear or circular DNA synthesis must precede mRNA production, Tiny4. Double stranded RNA: dsRNA There are 7 familie

4、s, such as Reoviridae (rotavirus) Most of them are segmented dsRNA can not be translated by ribosome Virus encode RNA dependent RNA polymerase5. Single stranded (+) RNA: (+)ssRNA There are 22 families, such as Coronaviridae (SARS), Flaviviridae (Yellow Fever Virus), Picornaviridae (Poliovirus) (+)ss

5、RNA can be directly translated into protein6. Single stranded (+) RNA with DNA intermediate There are one families, Retroviridae(+)ssRNA is a real mRNA but it never be used as a message Virion enzyme: Reverse Transcriptase dsDNA integrated into host genome: “provirus”7. Single stranded (-) RNA: (-)

6、ssRNA There are seven families, Paramyxoviridae (measles virus), Filoviridae (Ebola virus), Orthomyxoviridae (Influenza virus), Rhabdoviridae (Rabies virus) segmented or non-segmented(-)ssRNA can not be directly translate Virion enzyme: RNA dependent, RNA polymerase that was wrapped inside the capsi

7、dWhat do viral genome look like in the virion? 半保留复制模式：半保留复制模式：DNA病毒病毒 全保留复制模式：全保留复制模式：dsRNA病毒病毒 病毒核酸复制的重要中间体：连结体、病毒核酸复制的重要中间体：连结体、RF、RI病毒核酸复制的重要中间体病毒核酸复制的重要中间体 连结体：病毒基因组的多个拷贝通过共价键或非共价键以连结体：病毒基因组的多个拷贝通过共价键或非共价键以串联或连环形成首尾相连的结构。串联或连环形成首尾相连的结构。 RFRF（replicative formreplicative form）：病毒核酸在复制过程中出现的）：病毒核酸

8、在复制过程中出现的一种结构，如单正链一种结构，如单正链RNARNA病毒转录出负链病毒转录出负链RNARNA，两条链配对，两条链配对形成形成RFRF。 RIRI（replicative intermediate)replicative intermediate)：部分单体，部分双体：部分单体，部分双体 非病毒自身固有成分，完成复制后消失。非病毒自身固有成分，完成复制后消失。 不同病毒在细胞内不同位置装配不同病毒在细胞内不同位置装配 除痘病毒外，除痘病毒外，DNA病毒病毒细胞核细胞核 RNA病毒、痘病毒病毒、痘病毒细胞质细胞质复制周期复制周期(replication cycle) 将生物合成的蛋白

9、和核酸等组装成子代核衣壳的过程将生物合成的蛋白和核酸等组装成子代核衣壳的过程 病毒的装配过程非常复杂病毒的装配过程非常复杂 无包膜病毒、疱疹病毒等先形成无包膜病毒、疱疹病毒等先形成20面体的空心衣壳，面体的空心衣壳， 病毒核酸从缝隙进入壳内病毒核酸从缝隙进入壳内 螺旋对称病毒：壳粒围绕核酸装配成核衣壳螺旋对称病毒：壳粒围绕核酸装配成核衣壳 无包膜病毒即为病毒体，有包膜病毒还需获得包膜无包膜病毒即为病毒体，有包膜病毒还需获得包膜复制周期复制周期(replication cycle) 成熟的标准：成熟的标准：形态结构完整形态结构完整具有成熟病毒颗粒的抗原性具有成熟病毒颗粒的抗原性具有感染性具有感染

10、性 破胞释放：细胞裂解，释放大量子代病毒破胞释放：细胞裂解，释放大量子代病毒 出芽释放：以出芽方式获得包膜，细胞不立即死亡。出芽释放：以出芽方式获得包膜，细胞不立即死亡。 CMV：通过细胞间桥或细胞融合在细胞间传播。：通过细胞间桥或细胞融合在细胞间传播。复制周期复制周期(replication cycle)复制周期复制周期(replication cycle) 病毒进入细胞并在细胞内复制的本质是病毒与宿主细胞病毒进入细胞并在细胞内复制的本质是病毒与宿主细胞 相互作用的过程；相互作用的过程； 并非所有的病毒即使进入宿主细胞都能完成子代病毒的复制并非所有的病毒即使进入宿主细胞都能完成子代病毒的复制

11、 产生完整的、有感染性的子代病毒；产生完整的、有感染性的子代病毒； 顿挫感染（顿挫感染（abortive infection） 细胞为病毒的细胞为病毒的非容纳细胞非容纳细胞，病毒进入，病毒进入非容纳细胞非容纳细胞感染过程；感染过程； 缺乏部分缺乏部分/全部病毒增殖需要的酶、能量等，不能产生完整的全部病毒增殖需要的酶、能量等，不能产生完整的 感染性的子代病毒；感染性的子代病毒；Non-permissive cellPermissive cell 带有不完整基因组或者某一基因位点发生突变的病毒体；带有不完整基因组或者某一基因位点发生突变的病毒体； 不能产生完整的感染性的子代病毒；不能产生完整的感染

12、性的子代病毒； 在辅助病毒或辅助细胞系的帮助下完成复制；在辅助病毒或辅助细胞系的帮助下完成复制； 能够干扰同种成熟病毒体进入易感细胞（能够干扰同种成熟病毒体进入易感细胞（DIP) 可以为天然缺陷，也可以为人工缺陷病毒可以为天然缺陷，也可以为人工缺陷病毒 HDV HBV 两种病毒感染同一细胞；两种病毒感染同一细胞； 一种一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象。病毒抑制另一种病毒增殖的现象。 异种病毒异种病毒 同种、同型病毒同种、同型病毒 灭活病毒灭活病毒活病毒之间活病毒之间 发挥干扰作用的发挥干扰作用的缺陷病毒称缺陷病毒称 缺陷干扰颗粒缺陷干扰颗粒 （defective interfering par

13、ticles, DIP），与，与亲代病毒（标准病毒）之间存在着亲代病毒（标准病毒）之间存在着波动的共存波动的共存。 应注意下列原则应注意下列原则尽可能在发病初期采集病毒，越迟阳性率越低尽可能在发病初期采集病毒，越迟阳性率越低在最适宜的部位采集在最适宜的部位采集 对本身带有杂菌对本身带有杂菌 (如咽拭子、粪便如咽拭子、粪便) 或易受污染的标本，要进行或易受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素病毒分离培养时，应使用抗生素因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存并尽快送检因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存并尽快送检 血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后血清学诊断标本的采取应在发病初

14、期和病后23w内各取内各取1份血份血清，以便对比双份血清抗体效价的动态变化清，以便对比双份血清抗体效价的动态变化 动物接种动物接种 鸡胚接种鸡胚接种 细胞培养细胞培养 是最原始的病毒培养方法，常用小白鼠、豚鼠、家兔、猴等是最原始的病毒培养方法，常用小白鼠、豚鼠、家兔、猴等 根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位 如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内 痘病毒可接种于家兔角膜或皮内痘病毒可接种于家兔角膜或皮内接种后逐日观察实验动物发病情况，取病变组织剪碎，制成接种后逐日观察实验动物发病情况，取病变组织

15、剪碎，制成悬液，继续传代，并做鉴定悬液，继续传代，并做鉴定 动物接种动物接种 鸡胚对多种病毒敏感。鸡胚对多种病毒敏感。 一般采用孵化一般采用孵化914天的鸡胚。天的鸡胚。 根据病毒种类不同，将病毒标本接种于鸡胚的不同部位。根据病毒种类不同，将病毒标本接种于鸡胚的不同部位。 最常用的鸡胚接种部位有：最常用的鸡胚接种部位有： 羊膜腔羊膜腔 尿囊腔尿囊腔 绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜 卵黄囊等卵黄囊等 鸡胚接种鸡胚接种 原代细胞原代细胞(primary cultural cells)：原胚肾细胞：原胚肾细胞 二倍体细胞株二倍体细胞株(diploid cell strain)：有限传：有限传50代左右，代左右

16、， 人胚肺人胚肺WI-26株细胞株细胞 传代细胞株传代细胞株(continuous cell line)：癌细胞：癌细胞 细胞培养细胞培养 病毒形态学观察病毒形态学观察 完整病毒在细胞中的增殖完整病毒在细胞中的增殖 病毒的成分病毒的成分 病毒的血清学鉴定病毒的血清学鉴定 病毒的快速诊断病毒的快速诊断 病毒形态学观察：病毒形态学观察： 电镜电镜 免疫电镜免疫电镜艾滋病患者血清的免疫电镜所见艾滋病患者血清的免疫电镜所见 病毒在细胞中增殖的指标：病毒在细胞中增殖的指标： 细胞病变效应细胞病变效应-cytopathic effect, CPE 红细胞吸附现象红细胞吸附现象-hemadsorption，

17、HAd 干扰现象干扰现象-interference 免疫荧光检测病毒蛋白免疫荧光检测病毒蛋白-immunofluoresence细胞病变效应细胞病变效应-cytopathic effect, CPEq有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应 (CPE)。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。q有些病毒如麻疹病毒、有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等作用于细胞膜，可使邻近的细等作用于细胞膜，可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。胞相互融合，形成多

18、核巨细胞或称融合细胞。 q有些病毒有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养细胞中形成胞浆或可在培养细胞中形成胞浆或核内的包涵体。核内的包涵体。细胞病变效应细胞病变效应-cytopathic effect, CPEMost virus are non-cytopathic virus多核巨细胞，融合细胞多核巨细胞，融合细胞-syncytia狂犬病毒包涵体狂犬病毒包涵体（Vegri bodyVegri body）巨细胞病毒包涵体巨细胞病毒包涵体细胞内包涵体细胞内包涵体-inclusion body血凝实验血凝实验-Hemagglutination test, HA血

19、凝抑制实验血凝抑制实验-Hemagglutinatia inhibition test, HIq 流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素，具有吸附流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素，具有吸附脊椎动物脊椎动物 (豚鼠、鸡、猴等豚鼠、鸡、猴等) 红细胞的能力，这一现象称红细胞吸附；红细胞的能力，这一现象称红细胞吸附；q 常用来测定具有常用来测定具有HA的粘病毒与副粘病毒的增殖；的粘病毒与副粘病毒的增殖；q 若有相应的抗血清，则能中和细胞膜上的若有相应的抗血清，则能中和细胞膜上的血凝素血凝素，HA不再发生，称红细不再发生，称红细胞吸附抑制试验。胞吸附抑制试验。干扰

20、现象干扰现象-interferenceq 某些病毒感染细胞时不出现某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化或其他易于测出的变化(如红细胞吸附如红细胞吸附)，q 但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖，q 如风疹病毒感染如风疹病毒感染Vero细胞时细胞时CPE不明显，但它能干扰后感染的埃可病毒的不明显，但它能干扰后感染的埃可病毒的增殖，从而阻抑后者所特有的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE。 病毒感染性的定量测定：病毒感染性的定量测定： 空斑形成单位空斑形成单位, PFU/mL 50%致死量（致死量（LD50）或）或50%组织细胞感染量（组织细胞感染量（TCID50）免疫荧光免疫荧光- immunofluoresence检测病毒编码的酶检测病毒编码的酶-measurement of virus enzyme activity 下列情况需要进行血清学检查：下列情况需要进行血清学检查： 采集标本中分离病毒已很困难；采集标本中分离病毒已很困难； 目前尚未建立分离该病毒的方法和技术；目前尚未建立分离该病毒的方法和技术； 判断临床治疗效果；进行流行病学调查；判断临床治疗效果；进行流行病学调查； 基层医疗机构无法开展病毒分离实验。基层