体外分析技术

1、1 1彭志平彭志平重庆医科大学重庆医科大学体外分析技术体外分析技术2 2 生物活性物质是指来自生物体内，能作用于生物体、组织、细胞、生物大分子并产生某种效应的物质。 种类繁多：激素、酶、神经递质、信号转导信使物质、糖类、脂类、蛋白质多肽类、甾醇类、生物碱、甙类等等。 一般含量甚微，10-910-15g/ml。生物活性物质3 3 待测物质浓度与检测手段待测物质浓度与检测手段 临床化学分析临床化学分析1010-12-121010-9-91010-6-61010-3-31010-0-0pg/mLpg/mLng/mLng/mLmg/mLmg/mLmg/mLmg/mLg/Lg/L放射免疫分析放射免疫分析

2、Therapeutic DrugsTherapeutic DrugsThyroid HormoneThyroid HormoneFertility HormoneFertility HormoneAllergyAllergyCancer MarkersCancer MarkersInfectious DiseaseInfectious DiseaseVitaminsVitaminsSerum ProteinsSerum Proteins常量常量微量微量超微量超微量4 4现代医学的发展 疾病诊断的革新可在没有任何临床症状，而病人体内发生 1、基因表达异常； 2、受体分布异常或受体功能改变； 3、

3、器官代谢异常； 4、激素水平异常 酶、神经递质 等异常， 可早期发现。 体外分析和影像学的发展起了很大作用 例如 癌症的早期诊断5 5 以放射核素标记（或其他非放射性标记）的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。 主要用来测定患者血清或其他体液样品内的激素和其他生物活性物质及药物浓度等。体外分析技术6 6放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)Dr. Yalow 在体外条件下，利用Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分析技术。7 7开创了医学生

4、物学超微量分析方法使人体内微量生物活性物质的测量成为可能对现代医学的发展起到推动作用放射免疫分析法的创立放射免疫分析法的创立集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫发应的高特异性，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。8 8 R：放射性核素标记抗原 高灵敏（10 -9 -15 g/ml） 探测待测物上的标记信号 (标记物的放大效应)I：免疫学反应高特异以抗体为结合剂B：标记抗原与非标记抗原竞争与同种抗体结合9 9诺贝尔奖仪式上展示的拒绝信诺贝尔奖仪式上展示的拒绝信- - 幻灯中的故事幻灯中的故事 Yalow教授采用放射性核素标记胰岛素，发现了在II型糖尿病的病人体内胰岛素

5、消除慢，采用了同位素示踪法监测到了病人体内存在抗胰岛素抗体，并形成了胰岛素-抗体复合物。她的发明为我们检测体内微量物质提供了新的手段。但当Yalow教授将稿件投向科学杂志时，惨遭拒绝。然后她将文章改投JCI，暂被拒绝，审稿者要求她把“发现了胰岛素抗体”的词句改成“发现了结合球蛋白”，因为当时认为抗体是抗细菌的。事实证明Yalow的发现是正确的，是有重大价值的。她于1977年获得诺贝尔医学奖。在获奖演讲中，她特地向全世界展示了那封拒绝信。因为这封拒绝信，人们更能记住Yalow教授的风采，因为Yalow也曾被拒绝过，你我会更能承受，不是闪光的都是金子，但金子总会发光的10101111 体外分析以放

6、射免疫分析为代表 建立和推广免疫放射分析技术及其它放射分析技术 发展了非放射性标记免疫分析技术化学发光分析酶发光分析电化学发光分析时间分辨荧光分析1212体体外外分分析析技技术术体外放射分析体外放射分析体外非放射分析体外非放射分析放射性竞争放射性竞争结合分析结合分析放射性非竞放射性非竞争结合分析争结合分析1313RIARIA基本原理基本原理 Ag-Ab Ag-Ab + + Ag Ag * *AgAg Ab AbAgAg+ + +* *Ag-Ag-AbAb + + * *AgAg(B)(B)(F) (F) 4* *AgAg与与AgAg 免疫活性相同免疫活性相同4* *AgAgAg Ag AbAb

7、Ag=Ag= * * Ag , AgAbAg , AgAb= =* *AgAbAgAbAg Ag * *Ag , Ag , * *AgAbAgAb (B) (B) * *Ag(F)Ag(F)Ag Ag 90%2 2）半衰期足够长）半衰期足够长3 3）保持原有抗原的特性）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3H or 125I29293. 3. 非标记抗原非标记抗原 （标准品）（标准品）化学结构、免疫活性与被测抗原相同高纯度3030B B和和F F的分离的分离1.1.第一类第一类2.2.第二类第二类双抗体沉淀法双抗体沉淀法PEGPEG沉淀法沉淀法固相第二抗体法固相第二抗体法+ +AgAgA

8、bAb(1)(1)AbAb(2)(2)AbAb(2)(2)AbAb(1)(1)AgAg可溶性复合物可溶性复合物可沉淀复合物可沉淀复合物试管试管试管试管3131分离方法的要求分离方法的要求 分离完全、快速。 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 受环境因素（温度、pH值等）的影响小。 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。3232使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。 具体作用有：1检查误差的程度，决定测定结果的取舍。2识别误差的来源并消除其原因。3改进测定方法的设计以提高质量。质量控制（质量控制（

9、quality controlquality control）3333质量控制参数质量控制参数 1. 1.精密度（精密度（precisionprecision） 变异系数（变异系数（ CV CV ）7%10%7%10%2.2.准确度（准确度（accuracyaccuracy） 回收率回收率= =测定值测定值/ /真实值真实值100100% 90%110% 90%110% 3.3.灵敏度灵敏度 （sensitivitysensitivity） 方法的最小可测量方法的最小可测量4.4.特异性（特异性（specificityspecificity） 交叉反应率交叉反应率5.5.可靠性（可靠性（val

10、idityvalidity） 平行性试验平行性试验6.6.稳定性（稳定性（stabilitystability）B B0 0%，NSBNSB，EDED2525，EDED5050，EDED7575 A AB BC C3434RIA小结1. 灵敏度高2. 特异性好3. 精确的定量4. 方法操作简便3535免疫放射分析法免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab + *Ab（immunoradiometricimmunoradiometric assay,IRMA assay,IRMA）B%B%Ag（B B）（F F）在体外，利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量

11、。标记抗体，抗体是过量的。3636IRMA与RIA工作原理的主要区别RIAIRMA竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗体三种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是过量的*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关反应到达平衡慢反应到达平衡快非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素3737B%B%B%B%拟合的标准曲线拟合的标准曲线拟合的拟合的NSBNSB拟合的标准曲线拟合的标准曲线拟合的拟合的NSBNSBIRMAIRMA的标准曲线及的标准曲线及非特异结合曲线非特异结合

12、曲线RIARIA的标准曲线及的标准曲线及非特异结合曲线非特异结合曲线3838RIARIA+ + +或或01IRMAIRMA+ +13939非放射性标记免疫分析技术非放射性标记免疫分析技术酶标记免疫分析技术化学发光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术4040酶标记免疫分析技术酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。 是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。41414242 ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMA相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，

13、利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。 常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四甲基联苯胺 (TMB) ，反应后显黄色。 4343化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。 化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。44441.1.化学发光免疫分析化学发光免疫分析 是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量

14、就可以反映复合物的量。 常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯。 45452.2.化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析 和ELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物-金刚烷，使底物发射出光子。 此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。 46463.电化学发光免疫分析(略) 4.生物发光免疫分析(略) 4747时间分辨荧光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassaytime-resolved fluoroimmunoassay） 时间分辨荧光免疫分析采用稀土元素标记抗体，利用时间分辨荧光仪特定的延

15、迟时间测量，获得稀土元素的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。4848标记物为具有独特荧光特性的标记物为具有独特荧光特性的稀土金属稀土金属镧系元素镧系元素镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种 钐（Sm），铕（Eu），镝（Dy），鋱（Te）镧系元素荧光重要特点： 1、极长的荧光衰退时间 铕：730000ns，钐：50000ns，一般荧光物质：10ns 2、200nm的Stokes位移 铕：激发光340nm，发射光613nm 荧光素的Stokes位移为273nm 3、狭窄的发射峰 4、解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍4949时间分辨荧光免疫分析技术（time-r

16、esolved fluoroimmunoassay）基本原理镧系元素（镧系元素（1515）：铕（）：铕（EuEu），钐），钐（SmSm），镝（），镝（DyDy），鋱（），鋱（TeTe）Eu+EuEu+增强液增强液+Eu“ “解离增强镧系荧光免疫分析解离增强镧系荧光免疫分析”5050时间分辨荧光检测的基本原理示意图时间分辨荧光检测的基本原理示意图荧光衰退时间荧光衰退时间铕：铕：730000 ns730000 ns钐：钐：50000 ns50000 ns一般荧光物质：一般荧光物质：10 ns10 ns铕的荧光铕的荧光5151TrFIATrFIA的特点的特点1.最大限度提高测量方法的灵敏度2.有与R

17、IA相似的特异性和精密度3.可同时测定两种以上的抗原4.无辐射污染5252DELFIA技术的特点为临床检测带来的先进性技术特点检验先进性时间分辨波长分辨将特异性荧光与非特异性荧光分离开零背景高特异性解离-增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围更宽重复性更好低分子量原子标记标记位点多可达20个对标记物的结构与活性影响小无衰变受环境影响小灵敏度更高高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标多标记单，双，三，四标记一个试剂盒可同时测多个项目5353总结总结 体外分析的发展体外分析的发展方法设计的改变：竞争结合分析 非竞争结合分析，代表方法是免疫放射分析标记物的改变

18、：放射性核素 荧光、酶、化学发光、稀土元素结合体的改变 5454方法学基础方法学基础结合反应结合反应遵守可逆反应的质量作用定律：遵守可逆反应的质量作用定律： k1, v1k1, v1R+L RL R+L RL k2, v2 k2, v25555定量手段定量手段放射性测量技术放射性测量技术酶定量技术酶定量技术化学发光定量技术化学发光定量技术5656生物学基础生物学基础 特异性结合反应：特异性结合反应： 抗原抗原- -抗体的免疫结合反应；抗体的免疫结合反应； 配基配基- -受体的结合反应；受体的结合反应； 底物底物- -催化酶之间的酶促反应；催化酶之间的酶促反应； 结合体：结合体： 抗原抗原- -抗体抗体 激素激素- -激素结合球蛋白激素结合球蛋白 受体受体- -配体配体5757总结总结 体外分析的发展体外分析的发展方法设计的改变：竞争结合分析 非竞争结合分析，代表方法是免疫放射分析标记物的改变：放射性核素 荧光、酶、化学发光、稀土元素结合体的改变 5858 微生物 RMA 酶 REA 受体 RRA 特异结合蛋白 CPBA 改变结合体对放射性技术 Ag Ag-Ab RIA + Ab免疫学技术 Ag Ag-Ab 改变标记物第一阶段 第二阶段 第三阶段小分子半