第五章分子生物学研究法(上)3

1、分子生物学基本研究法（上）分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术第五章 扉页：扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀翅膀”，否，否则，你就不可能走在别人的前面。则，你就不可能走在别人的前面。5.4 SNP的理论与应用 SNP的定义定义：单核苷酸多态性 ( singl

2、e nucleotide polymorphism，SNP) 主要是指在基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。 是第三代遗传标记。5.4.1 SNP概述 单倍型：是指位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点。 SNP分类： cSNP 同义cSNP 非同义cSNP pSNP rSNP基因调控区基因调控区SNP基因间随机非编码区基因间随机非编码区SNP基因编码区基因编码区SNP5.4.2 SNPs经典检测方法 一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如: 1 . 限制性片段长度多态性法 PCR-RFLP ; 2 .单链构象多态性法 PCR-SSCP ; 3 . 变性梯

3、度凝胶电泳 ( denaturing gradient gel eletrophoresis DGGE ); 4 .等位基因特异性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等PCR-RFLP方法 原理：原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。 特点：特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一.PCR-RFLP原理图单链构象多态性(SSCP) 原理：原理：单链DN

4、A 在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。特点：特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。变性梯度凝胶电泳（DGGE） 原理：原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开的电泳技术。 电泳开始时,DNA 在胶

5、中的迁移速率仅与分子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到达该DNA 变性浓度位置时, 使得DNA 双链开始分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异, 使得其变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条带。等位基因特异 PCR ( AS-PCR)原理：原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) ,另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没

6、有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的 SNP。5.4.3 SNPs高通量的检测方法 另一大类检测方法是近些年来发展起来的, 高通量、 自动化程度较高的检测 SNPs的方法,较为常用的有: 1 . DNA测序法; 2 . DNA芯片检测; 3 . 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 4 . 变性高效液相色谱 ( DHPLC )法等等DNA测序法 直接测序是最容易实施的SNP检测方法。原理原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其检出率可达100%。 特点：特点：可以得到SNP 的类型及其准确位

7、置等SNP分型所需要的重要参数。基因芯片技术( Genechips) 原理原理: :是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出待测序列的碱基类别。 特点：特点：基因芯片具有信息量大和自动化程度高的突出优点。但它也存在若干问题: 芯片造价高昂, 所需设备贵重, 不利于普及应用。MALDI-TOF 原理：原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后, 在硅芯片上进行引物的退火, 延伸反应, 突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰

8、而检测SNP。变性高效液相色谱( DHPLC)原理：原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来, 从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的碱基。特点：特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95%以上。但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差, 不能检测出纯合突变。 SNP及突变研究的最新工具

9、高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting）High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的之间微弱的Tm值差异，通过值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：5.4.4 SNP的应用Gene SNP by bioinformatics 真核生物基因组庞大，含有大量重复序列。真核生物基因组庞大，含有大量重复序列。无论是电泳分离技术还是通过杂交的方法，无论是电泳分离技术还是通过杂交的方法，都难以直接分离到目的基因片段。都难以直接分离到目的基因片段

10、。 尽管高等生物一般具有尽管高等生物一般具有3-5万种左右不同的万种左右不同的基因，在单个细胞或组织的特定时间段中，基因，在单个细胞或组织的特定时间段中，仅有仅有15-20%左右的基因得以表达。左右的基因得以表达。5. 5 基因克隆技术 cDNA克隆的基本过程是通过一系列酶催作克隆的基本过程是通过一系列酶催作用，使总用，使总poly（A）mRNA转变成双链转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的基因编码序列的cDNA基因文库。基因文库。基因工程基本步骤 目的DNA 制

11、备；载体DNA选择DNA体外重组技术 （ DNA酶切实验、 连接实验）重组DNA的转化（转染）试验 重组克隆的筛选与鉴定（重组体的表型筛选，（重组体的表型筛选，指纹图谱法， PCR方法，探针杂交法 ） 目的基因表达产物的筛选与鉴定（遗传互补法，免疫化学法遗传互补法，免疫化学法Western印杂交法，微细胞法微细胞法(microcell method)基因工程流程示意图基因工程流程示意图5.5.1 RACE(cDNA末端快速扩增末端快速扩增)5RACE1.在反转录酶的作用下，以已在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部。特异性引物知基因片段内部。特异性引物启始启始cDNA第一条链的合成第一条链的合

12、成2.RNase混合物降解模板混合物降解模板mRNA，纯化，纯化cDNA第一条链。第一条链。3.用末端转移酶在用末端转移酶在cDNA链链3端端加入连续的加入连续的dCTP4.以连有以连有oligo(dG)的锚定引的锚定引物和基因片段内部特异的物和基因片段内部特异的nested引物进行引物进行PCR扩增，以扩增，以期得到目的片段，并可用期得到目的片段，并可用nest PCR进行检测。进行检测。5.5.2 应用应用cDNA差示分析法克隆基因差示分析法克隆基因 该法通过降低该法通过降低cDNA群体复杂性和更换群体复杂性和更换cDNA两端接头等两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。因为方法，特异性扩

13、增目的基因片段。因为Tester和和Driver在在接受差示分析前均经一个接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长碱基切割酶处理，形成平均长度度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。 每次每次T减减D反应后仅设置反应后仅设置72复性与延伸，复性与延伸，94变性这两变性这两个参数共个参数共20个个PCR循环，循环，PCR产物的特异性和所得探针产物的特异性和所得探针的纯度非常高。的纯度非常高。 RDA流程图。5.5.3 TA载体载体Topo TA载体载体Invitrogen Proprietary & Confidential3

14、8Different ways to generate the entry cloneTOPO CloningTOPO CloningTOPOTOPOBP ClonaseBP ClonaseBP CloningBP CloningPCR ProductPCR Product+ +TOPO-ActivatedTOPO-ActivatedEntry VectorEntry VectorL1L1L2L2GeneGene+ +attB attB PCR ProductPCR ProductB2B2GeneGeneB1B1Donor VectorDonor VectorP2P2ccdBccdBP1P1E

15、ntry CloneEntry CloneL2L2GeneGeneL1L1+ +digested DNA Fragmentdigested DNA FragmentGeneGeneB1B1digested Entry Vectordigested Entry VectorL2L2L1L14. Pre-made entry clone4. Pre-made entry clone5. Custom-made entry clone5. Custom-made entry cloneLigaseLigaseRestriction/Ligase CloningRestriction/Ligase C

16、loningORF CollectionORF CollectionL2L2ORFORFL1L1MultiSite Gateway - Extending the applicationsYour ApplicationYour ApplicationGene1Gene1Gene2Gene2Gene3Gene3Gene4Gene4Your ApplicationYour ApplicationGeneGeneProteinProteinLocalizationLocalizationGeneGeneGeneGeneProteinProteinPurificationPurificationGe

17、neGeneRNAiRNAiGeneGeneCell-FreeCell-FreeGeneGeneProteinProtein interactioninteractionGeneGeneGeneGeneEntry CloneEntry ClonePCRPCRGeneGenesynthesissynthesisORFORFcollectioncollectionLibraryLibraryYourYourSourceSourceGateway大规模克隆技术大规模克隆技术 大量的基因组序列被测定，要阐明这些基因大量的基因组序列被测定，要阐明这些基因的功能需要将不同的可译框架连入载体，传的功能需要将

18、不同的可译框架连入载体，传统的方法不能满足大规模克隆的需要。统的方法不能满足大规模克隆的需要。 Gateway基因大规模克隆法：利用基因大规模克隆法：利用噬菌体噬菌体进行位点特异性进行位点特异性DNADNA片段重组，实现了基因片段重组，实现了基因快速克隆和载体间平行转移。快速克隆和载体间平行转移。 Entry载体上的载体上的CCCTT被拓扑异构酶识别，切被拓扑异构酶识别，切开后通过开后通过274位酪氨酸位酪氨酸与切口处的磷酸基团形与切口处的磷酸基团形成共价键，加入成共价键，加入PCR产物后，形成的产物后，形成的3突出突出端端GTGG,攻击攻击PCR产产物的互补性末端并与接物的互补性末端并与接头

19、序列头序列CACC退火，切退火，切去去GTGG后使后使PCR产产物以正确方向连入物以正确方向连入Entry载体载体5.5.4基因的图位克隆（Map-based cloning）5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术蛋白质组与蛋白质组学技术 1995年，首次发表关于蛋白质组学年，首次发表关于蛋白质组学（proteome）概念的论文。）概念的论文。 蛋白质组是指一个基因组所表达的全部蛋蛋白质组是指一个基因组所表达的全部蛋白质白质 蛋白质组学是指在蛋白质组水平上研究蛋蛋白质组学是指在蛋白质组水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译与修饰、蛋白与蛋白相互作用等，

20、并由译与修饰、蛋白与蛋白相互作用等，并由此获得相关疾病发生、发展及细胞代谢等此获得相关疾病发生、发展及细胞代谢等过程的整体认识过程的整体认识 5.6.1双向电泳技术双向电泳技术 5.6.2蛋白质印迹法蛋白质印迹法 5.6.3蛋白质的质谱分析技术蛋白质的质谱分析技术 5.6.1双向电泳技术双向电泳技术 等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（Isoelectric focusing, IFE） 利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。梯度。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

21、 在有去污剂十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯在有去污剂十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳。酰胺凝胶电泳。依赖于蛋白质的两个性质：等电点和相对分子质量依赖于蛋白质的两个性质：等电点和相对分子质量 当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的白质都将迁移至与它的pI 相一致的相一致的pH处，具有不同处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，处，达到分离的目的。达到分离的目的。 蛋白质分子与蛋白质分子与SDS充分结合后，充分结合后，SDS负电荷掩负电荷掩盖或消除了不同种类蛋白质分子之间原有

22、的电荷差盖或消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异。异。 这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS复合物在复合物在SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率主要取决于蛋白质分子量凝胶系统中的电泳迁移率主要取决于蛋白质分子量大小。大小。如果将等电聚焦电泳与如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起结合起来，就是分辨率更高的双向电泳。双向电泳后来，就是分辨率更高的双向电泳。双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将它们在分子量上的

23、差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。相同而分子量不同的蛋白质分开。蛋白质样品蛋白质样品电泳电泳非标记抗体（一抗非标记抗体（一抗）发生免疫反应）发生免疫反应荧光素酶或放射性同位素荧光素酶或放射性同位素标记的第二抗体起反应标记的第二抗体起反应通过显色或放射自显影法通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分检测凝胶中的蛋白质成分转膜（硝酸纤维素薄膜）转膜（硝酸纤维素薄膜）方法：方法：图图528免疫印迹法示意图免疫印迹法示意图封闭封闭影响免疫印迹法成败的因素：影响免疫印迹法成败的因素：用于检测的二级抗体

24、一般分为以下三种用于检测的二级抗体一般分为以下三种 1. 放射性标记的抗体放射性标记的抗体 2. 与酶偶联的抗体：与酶偶联的抗体： 主要包括：辣根过氧化物酶主要包括：辣根过氧化物酶 碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 3. 与生物素相偶联的抗体与生物素相偶联的抗体western blot实验步骤视频Western Blot - SNAP i.d System5.6.3 蛋白质的质谱分析技术蛋白质的质谱分析技术 基质辅助的激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF） 电喷雾质谱（ESI-MS）质谱基础质谱基础样品样品离子源离子源质量分析器质量分析器离子检测器离子检测器固体固体液体液体蒸汽蒸汽形成离子形成

25、离子(带电分子带电分子)电离电离质量分选质量分选(过滤过滤)检测检测根据根据m/z分选离子分选离子数据处理数据处理质谱质谱检测离子检测离子基本步骤基本步骤:1. 样品离子化样品离子化 2. 根据质量根据质量(m/z)不同分离离子不同分离离子3. 检测每种质量离子的数目检测每种质量离子的数目 4. 收集、处理数据得到质谱图收集、处理数据得到质谱图 质谱的评价指标质谱的评价指标 质量范围质量范围 速度速度 灵敏度灵敏度 分辨率分辨率 精确度精确度+自由漂移区自由漂移区检测器检测器基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)样品探针样品探针激光激光335 nmm/z相对强度相对强度MH+MH+MH+特点：特点：灵敏度高灵敏度高准确度高准确度高分辨率高分辨率高质量范围广质量范围广图谱简明图谱简明速度快速度快ESI四级杆质量分析器四级杆质量分析器碰撞室碰撞室反射器反射器MCP检测器检测器碰撞气体碰撞气体串联质谱法串联质谱法 (MS/MS)ESI-Q-TOF 质谱仪质谱仪步骤：步骤：1 1质量分析质量分析 2 2碰撞碰撞( (离子裂解离子裂解) )3 3质量分析质量分析TOF质量分析器质量分析器 强的抗背景干扰能力强的抗背景干扰能力 极高的检测灵敏度和准确极高的