目的基因与载体的

1、目的基因与载体的连接与转化目的基因与载体的连接与转化 组名：二大组组名：二大组6 6小组小组组长：邱文霞组长：邱文霞组员：黄瑞、赵中先、杨组员：黄瑞、赵中先、杨 士芮、王彦、王珏士芮、王彦、王珏时间：时间：2012-5-102012-5-10 植物细胞壁是病原真菌在侵染过程中所遇到的第一道防线， 植物病原真菌可分泌一系列的酶来降解植物细胞壁内切多聚半乳糖醛酸酶( Endo-PG) 是病原真菌侵染寄主时分泌的第一个酶，PG 对植物细胞壁的降解使其他细胞壁降解酶对其底物的攻击变得更容易， 同时也为真菌的生长和发育提供了糖源6， 它可以降解植物细胞初生壁中的多聚半乳糖醛酸及其部分甲酯化衍生物， 从而

2、导致细胞液的外渗， 诱发植物发病7 然而， 植物产生 的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白( Polygalacturonase-inhibiting proteins， PGIP) 能够与病原菌的 Endo- PG 形成一种高亲和复合物， 从而抑制病原菌 Endo- PG的活性，抑制真菌对植物细胞壁的降解， 维持植物细胞壁的完整性; 此外， 两者相互作用会导致大片段寡聚半乳糖的积累， 而该物质能进一步激发植物防卫系统， 引发植物自身多种防卫反应， 增强植物抗性。PGIP 被认为是植物先天免疫系统的成分，在植物抗病育种中， PGIP 已成为关注的焦点之一。PGIP- PG 相互作用已成为在分子水平上研究

3、植物富含亮氨酸的重复单位( Leucine- rich repeatLRR) 介导的特异识别的一种模式系统。因此， PGIP 基因在植物抗病基因工程以及蛋白相互作 用研究方面具有广阔的应用前景 目前， 国内外对PGIP 基因的分离 PGIP 在植物抗病中的作用以及在抗病育种中的应用已进行了深入的研究， 并取得了一定的进展番茄是一种常见的用于转基因和基因功能研究的模式植物， 农杆菌介导的转基因方法体系已经非常成熟， 同时其遗传研究也相对较为深入， 为通过转基因技术研究外源基因的功能提供了良好的平台真菌病害在番茄上特别常见， 主要有早疫病 晚疫病 绵疫病和灰霉病等 利用基因工程技术将外源抗真菌病的

4、基因导入番茄， 一旦证实其对病原真菌具有抗性， 可作为抗病育种的材料或者抗病品种加以应用 利用 PGIP 基因转基因培育抗病品种， 在 多种作物上已有成功的报道 Toubart 等 分离和克隆了编码菜豆 PGIP 的基因， Desiderio 等14首次 将大豆 PGIP 基因置于烟草花叶病毒启动子的诱导之下， 构建了植物表达载体， 并对番茄 烟草和大豆进行转化， 部分转基因番茄对镰刀菌( Fusarium) 有抗性， 苹果 PGIP 基因转基因烟草能抑制苹果真菌Btryosphaeria obtusa 和 Diaporthe ambigua 以及羽扇豆炭疽病原真菌 PG， 李广平等15将梅的

5、 PGIP 基因构建了植物表达载体， 并对烟草进行了转化 Ben-net 等16 成功的将对真菌具有抑制作用的梨的PGIP 基因转入到番茄中， 并得到了高效表达， 且使番茄对易感真菌( Botrytis cinerea) 的抗性得到明显加强。本试验通过农杆菌介导法将苹果 PGIP 基导入到栽培番茄中蔬四号中， 旨在通过 PG基因因在件， 也为下一步转化其他植物奠定基础， 同时也丰富番茄体内的高效表达为其抑菌功能验证创造良好条了番茄抗真菌育种的基因资源。 材料和方法 1 材料 1 1菌株和质粒 大肠杆菌菌株 E coli DH5植物 中 间 载 体 质 粒 pWR306 根 癌 农 杆 菌 菌

6、株 EHA105 及克隆有 PGIP 基因的克隆载体质粒 pMD- 18T 均为本实验室保存 1 2 化学试剂和工具酶类 Taq DNA 聚合酶dNTP 限制性内切酶 Sal BamH T4 DNA 连接酶 DNA 分 子 量标 准 DL2000; DNA 片段凝胶回收试剂盒; 质粒微量抽提试剂盒; 琼脂糖为 In-vitrogen 产品; 胰蛋白胨 酵母提取物为 ENGLAND OXOID 产品; 卡那霉素( Kan) 、 头孢霉素( Cef ) 、 利福平( Rif) 、 链霉素( Str ) 、 玉米素( ZT) 、 3-吲哚乙酸( IAA) 1 3 PCR 引物设计及合成 根据本项目前

7、期已经克隆的苹果 PGIP 基因序列设计 1 对引物， 分别为 PGIP 基因的上 下游特异引物， 命名为引物 1 和引物 2 引物 1 和 2 的序列分别为 CTGGATCCATG-GAACTCAAGTTCTCC 和 TTGTCGACTTGCAGCTT-GGGAG， 下划线部分分别为 Sal BamH 酶切位点， 引物生工合成公司购买。 1 4 植物材料及培养基组成 试材为番茄中蔬 四号种子无菌苗叶片及茎段， 基本培养基为 MS 培养基， 各培养基附加蔗糖 30 g /L， 琼脂 8 g /L， pH 调至 5. 8 分化培养基为 MS + ZT 1. 0 mg /L + IAA 0. 1m

8、g /L; 筛选培养基为 MS + ZT 1. 0 mg /L + IAA 0. 1mg /L + Kan 100 mg /L + Cef 500 mg /L; 继代培养基为 MS + ZT 1. 0 mg /L + IAA 0. 1 mg /L + Kan 50mg /L + Cef 500 mg /L; 生根培养基为 MS + IAA 0. 1mg /L + Kan 50 mg /L + Cef 300 mg /L。 1 2 方法 1 2 1 PGIP 基因植物表达载体的构建 用 Sal、 BamH分别双酶切植物表达载体 pWR306 和 PGIP 克隆载体 pMD- 18T， 琼脂糖凝胶

9、电泳后用胶回收试剂盒回收目的基因片段和线性化的植物表达载体片 段。用 T4 DNA 连接酶 16 下连接 12 h， 将目的基因片段插入酶切回收后的植物表达载体的 Sal、 BamH位点之间， 连接产物转化大肠杆菌 DH5，用含有 Kan 50 mg /L 的 LB 平板筛选抗性克隆。 1 2 2 重组质粒的鉴定 随机挑取抗性单菌落， 分 别接种在加有 Kan 50 mg /L 的 LB 液体培养基中， 37振荡培养过夜， 用碱裂解法小量提取质粒， PCR 检测质粒 DNA 中有无目的基因片段插入， 以 PGIP 基因克隆载体为正对照 同时用 Sal BamH 双酶切质粒， 检查有无目的片段插

10、入 PCR 扩增 反应条件: 94 预变性 5 min; 94 45 s， 58 45 s， 72 90 s， 15 次循环; 94 45 s， 64 45 s， 72 90 s， 35 次循环; 72保温 10 min， 4保存 PCR 产物和 酶切产物分别进行 1. 0% ( W/V) 琼脂糖凝胶电泳 1 2 3 表达载体导入农杆菌 农杆菌 EHA105 感受态细胞的制备， 按文献4的方法进行， 表达载体 导入农杆菌采用冻融法4， 在含 Str 50 mg /L、 Rif 20mg /L、 Kan 50 mg /L 的 LB 固体培养基上筛选阳性农杆菌克隆。 1 2 4 工程农杆菌鉴定 随机挑取抗性单菌落， 分别接种在附加 Kan 50 mg /L Rif 20 mg /L Str 50mg /L的 LB 液体培养基中， 28振荡培养过夜， 碱裂解法小量提取转化质粒， PCR 扩增检测 PGIP 基因，PCR 反应条件同上。 1 2 5 PGIP 基因农杆菌介导转化番茄 以番茄中 蔬四号无菌苗叶片及茎段为受体， 横向划伤， 背面向上接在 MS 培养基上， 黑暗条件下预培养 2 d 之后 将叶片及茎段用 OD600 值为 0. 5 的菌液侵染 20 min，共培养 3 d 共培养完成后将叶片转移到附加 Kan100 mg /L 及 Cef