细胞生物学技术(二)

1、1第三节第三节 显微技术显微技术细胞生物学的建立和发展得益于光学显细胞生物学的建立和发展得益于光学显微镜的发明；微镜的发明；电子显微镜的发明使对细胞结构和功能电子显微镜的发明使对细胞结构和功能的研究达到了新的水平。的研究达到了新的水平。2光学显微镜与电子显微镜的主要差别光学显微镜与电子显微镜的主要差别在所使用的光源不同，但分辨率却相在所使用的光源不同，但分辨率却相差非常大：差非常大：光学显微镜的最大分辨率：光学显微镜的最大分辨率：0.2m0.2m电子显微镜的分辨率：电子显微镜的分辨率：0.2nm0.2nm3一、显微镜的成像原理一、显微镜的成像原理所有类型的显微镜，镜像的形成都需要所有类型的显微

2、镜，镜像的形成都需要3 3个基本要素：个基本要素： 1 1、照明系统；、照明系统； 2 2、被观察的物品；、被观察的物品； 3 3、聚焦成像的透镜系统、聚焦成像的透镜系统4 照明系统的照明系统的波长波长是显微镜成像的重是显微镜成像的重要因素，波长能决定被检测物体的最小要因素，波长能决定被检测物体的最小极限极限。51 1、分辨率、分辨率（ResolutionResolution）是指能分辨出相邻两个物点间的最小距是指能分辨出相邻两个物点间的最小距离的能力。离的能力。一般规定：显微镜或人眼在一般规定：显微镜或人眼在25cm25cm明视距明视距离处，能清楚分辨被检物体细微结构最离处，能清楚分辨被检物

3、体细微结构最小间隔的能力，称分辨率。小间隔的能力，称分辨率。6分辨率可用下面公式计算结果来衡量：分辨率可用下面公式计算结果来衡量：D=0.61 /N.A.D=0.61 /N.A. N.A.N.A.sinsin式中：式中： = =波长；波长；n=n=介质折射率；介质折射率；=镜口镜口角（标本对物镜镜口张角的角（标本对物镜镜口张角的1/21/2），），N.A.=N.A.=镜镜口率（口率（numeric aperturenumeric aperture）。镜口角总是要）。镜口角总是要小于小于9090，sin sin 的最大值小于的最大值小于1 1。78不同光源的波长不同光源的波长名称可见光紫外光X

4、射线射线电子束0 . 1Kv10Kv波长(nm)4 5 0 -760133900.05130.00510.1230.012292 2、最大分辨率、最大分辨率D D值越小，分辨率越高，即需要值越小，分辨率越高，即需要尽可能尽可能地小，和地小，和N.A.N.A.尽可能大。尽可能大。可见光中以蓝光波长最短可见光中以蓝光波长最短， =450nm=450nm；目前最好的玻璃透镜的目前最好的玻璃透镜的=70 =70 ， sin sin =0.94;=0.94;空气的折射率空气的折射率nn1 1；所以所以光镜的最大分辨率光镜的最大分辨率： D=450/1D=450/1* *0.94=0.94=292nm29

5、2nm= =0.3m0.3m103 3、分辨极限与放大率、分辨极限与放大率显微镜的最大分辨率即是它的分辨极限。显微镜的最大分辨率即是它的分辨极限。最终成像的大小与原物体大小的比值称最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率（为放大率（magnificationmagnification）。）。总放大率总放大率= =物镜的放大率物镜的放大率* *目镜放大率目镜放大率放大率受分辨极限的限制。一般，光学放大率受分辨极限的限制。一般，光学显微镜的最大放大率只能是数值孔镜显微镜的最大放大率只能是数值孔镜（N.A.N.A.）的）的10001000倍。倍。11二、光学显微镜二、光学显微镜（一）、普通双目显微

6、镜（一）、普通双目显微镜* *照明系统：可见光源照明系统：可见光源* *光学放大系统：由物镜和目镜组成，都光学放大系统：由物镜和目镜组成，都是由玻璃透镜组构成；在物镜上方装有是由玻璃透镜组构成；在物镜上方装有4 4个棱镜，使物镜的光线平分为两路到达目个棱镜，使物镜的光线平分为两路到达目镜镜* *机械和支架系统：保证光学系统的准确机械和支架系统：保证光学系统的准确配制和灵活调控配制和灵活调控 121. The Light Microscopy1. The Light Microscopy（LMLM）13光镜观察样本的制备光镜观察样本的制备 石蜡切片石蜡切片.142 2、倒置显微镜、倒置显微镜 组

7、成和普通显微镜一样，只不过组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，普通显微镜在物镜与照明系统颠倒，普通显微镜在载物台之下，倒置显微镜在载物台之载物台之下，倒置显微镜在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。差物镜。15163 3、暗视野显微镜、暗视野显微镜（dark field microscopedark field microscope） 聚光镜中央有挡光片，使照明光线聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物

8、体的边缘是亮的。是黑的，物体的边缘是亮的。 能观察能观察 4200nm4200nm的微粒子，分辨率的微粒子，分辨率可比普通显微镜高可比普通显微镜高5050倍。倍。17184 4、荧光显微镜、荧光显微镜 是对能发荧光的物质进行定性和定是对能发荧光的物质进行定性和定量研究的工具。量研究的工具。 细胞中有些物质如叶绿素等，受紫细胞中有些物质如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；外线照射后可发荧光； 有些物质本身虽不能发荧光，但用有些物质本身虽不能发荧光，但用荧光染料染色，紫外线照射也发荧光。荧光染料染色，紫外线照射也发荧光。 1920荧光显微镜和普通显微镜区别荧光显微镜和普通显微镜区别：1 1、照明方

9、式通常为落射式，即光源通过、照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；物镜投射于样品上；2 2、光源为紫外光，波长较短，分辨力高、光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；于普通显微镜；3 3、有两个特殊的滤光片，光源前的用以、有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。除紫外线，用以保护人目。2122235 5、激光共聚焦扫描显微境、激光共聚焦扫描显微境（laser confocallaser confocal scanning scanning microscopemicroscope）* *用激光

10、作光源，逐点、逐行、逐面扫描成像，用激光作光源，逐点、逐行、逐面扫描成像，激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。* *调焦一次，扫描限制在样品一个平面。调焦深调焦一次，扫描限制在样品一个平面。调焦深度不一时，可获样品不同层次图像，经计算机模度不一时，可获样品不同层次图像，经计算机模拟，能显示样品的立体结构。拟，能显示样品的立体结构。* *激光波长短，光束细，分辨率是光镜的激光波长短，光束细，分辨率是光镜的3 3倍。倍。24252627Comparison of conventi

11、onal and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below th

12、e plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo. 286 6、相差显微镜、相差显微镜（phase-contrast phase-contrast microscopemicroscope） 由由ZernikeZernike于于19321932年发明，并因此年发明，并因此获获19531953年诺贝尔物理奖。年诺贝尔物理奖。 最大的特点是可以

13、观察未经染色的最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。标本和活细胞。29 基本原理：把透过标本的可见光的基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差（明暗差），从而光程差变成振幅差（明暗差），从而提提高了各种结构间的对比度高了各种结构间的对比度，使结构变得，使结构变得清晰可见。清晰可见。 光线透过标本后发生折射，偏离了光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了原来的光路，同时被延迟了1/41/4，如再，如再增加或减少增加或减少1/41/4，则光程差变为，则光程差变为1/21/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差小，提高反差。30

14、构造上，相差显微镜不同于光镜之处：构造上，相差显微镜不同于光镜之处：1 1、环形光阑（、环形光阑（annular diaphragmannular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器位于光源与聚光器之间，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。2 2、相位板、相位板（annular phaseplateannular phaseplate）在在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟直射光或衍射光的相位推迟1/41/4。3132Figure 3-2. Figure 3-2. Int

15、erference between light waves. Interference between light waves. When When two light waves combine two light waves combine in phase,in phase, the amplitude of the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light w

16、aves that are increased. Two light waves that are out of phaseout of phase partially cancel each other and produce a wave partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is whose amplitude, and therefore brightness, is decreased. decreased. 33347 7、微分干涉显微镜、微

17、分干涉显微镜（differential-interference differential-interference microscopemicroscope） 1952 1952年，年，NomarskiNomarski在相差显微镜在相差显微镜原理的基础上发明原理的基础上发明。 优点是能显示结构的三维立体投影优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，标本可略厚，影像。与相差显微镜相比，标本可略厚，折射率差别更大，故影像立体感更强。折射率差别更大，故影像立体感更强。35图图2-10 DIC显微镜显微镜下的硅藻下的硅藻（伪彩色）（伪彩色）36DICDIC显微镜使细胞的结构，特别是一显微

18、镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。显微操作常在这种显微镜下进行。37四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较：四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较： (A) 明视野显微镜； (B) 相差显微镜； (C) 微分干涉显微镜； (D) 暗视野显微镜38二、电子显微镜二、电子显微镜 光学显微镜受照射光波长的限制，在光学显微镜受照射光波长的限制，在可见光下其分辨极限只有可见光下其分辨极限只有

19、0.2m0.2m，即使在，即使在紫外光下，最大分辨率也只有紫外光下，最大分辨率也只有0.1 m0.1 m，要观察更精细的结构，只有借助分辨率更要观察更精细的结构，只有借助分辨率更高的电子显微镜。高的电子显微镜。39（一）透射电子显微镜（一）透射电子显微镜(transmission electron (transmission electron microscopemicroscope，TEM)TEM)Ruska 1932Ruska 1932年发明。年发明。以以电子束电子束为光源，波长比可见光和紫外为光源，波长比可见光和紫外光短得多，且电子束的波长与发射电子束光短得多，且电子束的波长与发射电子束

20、的电压平方根成反比。的电压平方根成反比。最大分辨率最大分辨率达达0.2nm0.2nm。40411 1、透射电镜的结构、透射电镜的结构由由5 5部分组成：部分组成：1 1、电子照明系统、电子照明系统：电子枪；：电子枪；2 2、真空系统、真空系统：用真空泵和油扩散泵获得：用真空泵和油扩散泵获得高真空；高真空；3 3、电磁透镜成像系统、电磁透镜成像系统：规范电子的行为；：规范电子的行为；4 4、记录系统、记录系统：用荧光屏观察影像，用照：用荧光屏观察影像，用照相系统记录影象；相系统记录影象；5 5、电源系统、电源系统：提供高压稳压。：提供高压稳压。42432 2、电镜制样技术、电镜制样技术44（1）

21、超微切片技术）超微切片技术石蜡切片: 3-10um; 超薄切片: 40-50nmSections of LM: 5um;Sections of TEM: 100nm 45 由于电子束的穿透力很弱，因此用于由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约电镜的标本须制成厚度约50nm50nm左右的超薄左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotomeultramicrotome）制作。）制作。4647Thin sectionscopper grid used to support the thin sections of copper gr

22、id used to support the thin sections of a specimen in the transmission electron a specimen in the transmission electron microscope. microscope. 48 Specimen Preparation for Electron Microscopy Two common chemical fixatives used for electron microscopy. The two reactive aldehyde groups of glutaraldehy

23、de enable it to cross-link various types of molecules, forming covalent bonds between them. Osmium tetroxide is reduced by many organic compounds with which it forms cross-linked complexes. It is especially useful for fixing cell membranes, since it reacts with the C=C double bonds present in many f

24、atty acids. 49Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen. 50通过连续切片达通过连续切片达到被检样品的三到被检样品的三维结构的重构维结构的重构 51（2 2）负染色技术）负染色技术 负染是用重金属盐（磷钨酸、醋酸双负染

25、是用重金属盐（磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色； 吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，呈负染效果，分辨力可达料沉积，呈负染效果，分辨力可达1.5nm1.5nm。52经负染的肌动蛋白纤维经负染的肌动蛋白纤维53(3)(3)冰冻冰冻蚀刻蚀刻(freeze-etching)(freeze-etching) 样本置样本置-196-196C C液氮中冰冻。然后用冷刀液氮中冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，冰在真空下迅速升华，骤然将标本断开，冰在真空

26、下迅速升华，暴露出断面结构，称蚀刻暴露出断面结构，称蚀刻。蚀刻后，向断面喷涂一层铂和碳，加强蚀刻后，向断面喷涂一层铂和碳，加强反差和强度。再用次氯酸钠溶液消化样反差和强度。再用次氯酸钠溶液消化样品，剥下碳和铂的膜，即复膜。复膜代品，剥下碳和铂的膜，即复膜。复膜代表标本蚀刻面的形态，电镜下的影像即表标本蚀刻面的形态，电镜下的影像即代表标本断面的结构。代表标本断面的结构。54555657（二）扫描电镜（二）扫描电镜（Scanning electron microscope Scanning electron microscope (SEM)(SEM) * *问世于问世于2020世纪世纪6060年代

27、；年代；* *用来观察标本的表面结构。用来观察标本的表面结构。* *扫描电镜的分辨力为扫描电镜的分辨力为610nm610nm，最大有，最大有效放大倍率为效放大倍率为20000X20000X。 5859工作原理工作原理* *用细的电子束扫描样品，在样品表面激用细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品的发出次级电子，次级电子的多少与样品的表面结构有关。表面结构有关。* *次级电子由探测器收集，转为光信号，次级电子由探测器收集，转为光信号，再经光电倍增管和放大器转为电信号来控再经光电倍增管和放大器转为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示扫描图像。制荧光屏上电子束的强度，显示扫描图像。图像为立体，显示标本表面结构。图像为立体，显示标本表面结构。 6061 为了使标本表面发射出次级电子，为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。出次级电子信号。 6263培养中的小鼠成纤维细胞扫描照片培养中的小鼠成纤维细胞扫描照片6465三、