比较蛋白质组学及系统研究方法

1、LOGOLOGO比较蛋白质组学比较蛋白质组学及系统研究方及系统研究方法法LOGOLOGO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法蛋白质的合成受时空等多种因素调控，在不同的组织细胞中蛋白质合成及表达的种类和数量有很大的差异，即使在细胞发育的不同阶段，因不同时期、不同条件，蛋白质组的构成也在不断的变化，是动态的过程第一部分：基本概念LOGOLOGO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第一部分：基本概念蛋白质组蛋白质组(Proteome) 指由一个基因组，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。比较蛋白质组比较蛋白质组学学：蛋白质组间差异蛋白差异蛋白的研究。LOGOLO

2、GO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第一部分：基本概念生物学问生物学问题的提出题的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照实验组和对照组样品的制备组样品的制备图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后胰酶对脱色后蛋白质消化蛋白质消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离比较蛋白质组学基本技术路线LOGOLOGOIntroduct

3、ion蛋白质的提取蛋白质的提取1蛋白质的分离蛋白质的分离2蛋白质样品的分析蛋白质样品的分析3验证4第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法LOGOLOGOIntroduction蛋白质的提取蛋白质的提取1荚膜层细胞粘液层比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法应应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。白），且制备方法应具有可重现性。v防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时

4、发生蛋白的聚集和沉淀。v防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。学性降解等）。v完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。v尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性的可检测性。 样品样品的分级处理的分级处理可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。 样品制备对于获得可靠、准确的2D电泳结果至关重要LOGOLOGOIntroduction比比较

5、较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段变性剂：变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团一种表面活性剂来溶解疏水基团。还原剂：还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，

6、加用还原剂可使已变性的在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底蛋白质展开更完全，溶解更彻底。LOGOLOGO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法水浴加热处理Triton X-114相分离法提取膜蛋白蛋白质沉淀及透析除杂真空冷冻干燥硫转运膜蛋白质的有效分离和提取LOGOLOGO双向电泳分离膜蛋白比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGO双向电泳具体步骤双向电泳具体步骤v 蛋白预处理（裂解，水化）蛋白预处理（裂解，水化）n蛋白质上样缓冲

7、蛋白质上样缓冲液的液的配制：一定量配制：一定量的的 蛋白质样品溶解在蛋白质样品溶解在 缓冲液含缓冲液含 7 mol/L 尿素，尿素， 2 mol/L 硫硫脲，脲，4% CHAPS，1% NP-40，2% IPG 缓冲液，缓冲液，65 mmol/L DTT ，0.002%溴酚蓝溴酚蓝v IPG条重泡涨及上样条重泡涨及上样v 第一向：第一向：IEFv IPG条平衡条平衡n平衡缓冲液平衡缓冲液(还原还原)n平衡缓冲液平衡缓冲液(巯烷基化巯烷基化)v 第二向：第二向：SDS-PAGEv 胶条胶条染色及脱色染色及脱色v 凝胶成像凝胶成像及图像分析及图像分析比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方

8、法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGO凝胶凝胶的图像处理分析的图像处理分析和差异蛋白质点的挖取及胶内酶和差异蛋白质点的挖取及胶内酶切切v 凝胶图像的扫描凝胶图像的扫描v 图像加工图像加工v 斑点检测和定量斑点检测和定量v 凝胶配比凝胶配比v 数据分析数据分析v 数据呈递和解释数据呈递和解释v 2-DE数据库的数据库的建立建立v 差异差异蛋白质点的挖取蛋白质点的挖取v 胶胶内酶切内酶切Image Master 2d Platinum 图像分析软件可 用于胶的图像分析比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGOI

9、ntroduction比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法差异蛋白质点的挖取及脱色、胶内酶切差异蛋白质点的挖取及脱色、胶内酶切元素硫基质中膜蛋白2-DE图谱亚铁基质中膜蛋白2-DE图谱选取差异表达的蛋白质点，经过脱色处理后用胰蛋白酶（Trypsin）进行特异性酶切，最后进行质谱分析得到相关肽指纹图谱LOGOLOGO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法目前双向电泳需解决的问题目前双向电泳需解决的问题v 样品的制备及溶解样品的制备及溶解n膜蛋白疏水性强膜蛋白疏水性强v 初步分离初步分离v 高丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白

10、高丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白v 灵敏度及可重复性灵敏度及可重复性第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGON-端测序端测序： 得到的是序列。未知蛋白测序。称为Protein Sequencing 。生物质谱分析生物质谱分析 ：返回的数据是分子量。可以和已知的蛋白（数据库）比对，告诉你是什么蛋白。称为Protein Identification by MS。比较蛋白质组学主流手段是生物质谱分析生物质谱分析 ，价格便宜，分析速度快。比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法蛋白质样品的分析蛋白质样品的分析3LOGOLOGO比比较较蛋

11、白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGO质谱分析原理进样系统进样系统1.气体扩散2.直接进样3.色谱离子源离子源1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光 质量分析器质量分析器1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间4.四极杆 检测器检测器MALDI-TOF 一级质谱仪，二级质谱，MALDI-TOF-TOF 串联质谱仪，LC-MS/MS 色谱质谱连用比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGOA. ferrooxidans 胞外蛋白质斑点的肽指纹图质谱结果比比较较蛋白蛋白质组

12、学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGO软件名称MascotSEQUESTX!Tandem软件类型商业软件商业软件免费开源软件数据格式MGF、DTA、 PKLRAW、 DTADTA 、PKL、MGF、mzXML注：在线检索均为免费蛋白质质谱检索常用软件常用的是Mascot比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGO检索的数据库，可以知道数据库大小检索的数据库，可以知道数据库大小

13、匹配的结果匹配的结果大于大于70分分即成功鉴定即成功鉴定(可靠性达到显著水平可靠性达到显著水平)纵坐标：匹配的蛋白数目纵坐标：匹配的蛋白数目阴影线：区分匹配结果阴影线：区分匹配结果可靠与不可靠的分界线可靠与不可靠的分界线横坐标：匹配的蛋白得分横坐标：匹配的蛋白得分小红柱：匹配的结果小红柱：匹配的结果比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法第二部分：比较蛋白质组学系统

14、研究方法LOGOLOGO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法ProtParam蛋白质序列的物理-化学参数（氨基酸、原子组成，等电点，消光系数等）MultiIdent通过等电点、分子量、氨基酸组成、序列标签、肽指纹数据等识别蛋白AACompSim蛋白质氨基酸组成与数据库进行对比分析AACompIdent通过氨基酸组成识别蛋白质 3D Protein Display and Sequence Analysis for the PC (UIUC) 蛋白质三维构象展示第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGO验证4比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法1.蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot 试剂准备 样品制备 含量测定 SDSPAGE电泳 转膜 免疫反应 化学发光 凝胶图象分析第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法LOGOLOGO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及系统研统研究方法究方法未知样品的 Ct 值，从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法2.荧光实时定量PCR（Real-time qPCR） 实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。RT-PCR结果LOGOLOGO比比较较蛋白蛋白质组学质组学及系及