第14章核酸的物化性质

1、第第1414章章 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质一、核酸的水解一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交一、核酸的水解一、核酸的水解（一）酸水解（一）酸水解对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键 嘌呤嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键糖苷键嘧啶糖苷键脱嘌呤：脱嘌呤： pH1.6，37，对水透析，对水透析 pH2.8，100，1h脱脱嘧啶：嘧啶： 98-100%甲酸，甲酸，175，2h 三氟乙酸，三氟乙酸，155，60min（DNA）或）或 80min（RNA）利用酸水解可以研究核酸的碱基组

2、成利用酸水解可以研究核酸的碱基组成2（二）碱水解（二）碱水解RNA的磷酸酯键对碱敏感的磷酸酯键对碱敏感室温，室温，0.31mol/L KOH，18-24h，可将，可将RNA完全水解，完全水解，得到得到2-或或3-核苷酸的混合物。核苷酸的混合物。DNA抗碱水解抗碱水解生理意义：生理意义：DNA更稳定更稳定 ，遗传信息。，遗传信息。RNA是是DNA的信使，完成任务后迅速降解。的信使，完成任务后迅速降解。3（三）酶水解（三）酶水解非特异的磷酸二酯酶：非特异的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得）得5-核苷酸核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得）得

3、3-核苷酸核苷酸特异的磷酸二酯酶特异的磷酸二酯酶：核酸酶：核酸酶N-糖苷酶糖苷酶4核酸酶核酸酶的分类的分类底物底物专一性：专一性：核糖核酸酶核糖核酸酶 RNase脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶 DNase作用方式作用方式：核酸外切酶（核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶、核酸内切酶 (endonuclease)单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶磷酸磷酸二酯键的断裂方式：二酯键的断裂方式：5-（寡）核苷酸（寡）核苷酸3-（寡）核苷酸（寡）核苷酸 5 核酸酶（核酸酶（nuclease）ATCGTC CCGG TAGA化学本质是蛋白质化学本质是蛋白质53外

4、切酶外切酶内切酶内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶具有序列特异性的核酸酶具有序列特异性的核酸酶称为称为限制性限制性核酸内切酶核酸内切酶6二二、核酸、核酸的酸碱性质的酸碱性质磷酸和碱基均能发生两性解离。磷酸和碱基均能发生两性解离。DNA等电点等电点 44.5RNA等电点等电点 22.5两性电解质：两性电解质：酸性的磷酸基和碱性的碱基酸性的磷酸基和碱性的碱基 电泳电泳和离子交换分离纯化核酸和离子交换分离纯化核酸7三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收碱基、核苷、核苷酸和核酸在碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波的紫外波段有强烈的段有强烈的光吸收。光吸收。 max=260nm8鉴定鉴

5、定纯度纯度纯纯DNA的的A260/A280应为应为1.8（1.65-1.85）纯纯RNA的的A260/A280应为应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。比值明显降低。含量含量计算计算1ABS值相当于：值相当于：50ug/mL双螺旋双螺旋DNA 或或：40ug/mL单链单链DNA（或（或RNA） 或或：20ug/mL寡核苷酸寡核苷酸判断判断DNA是否变性是否变性在在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应增色效应）在在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应减

6、色效应）9四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交(一一)变性变性 (denaturation)核酸变性核酸变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。不涉及共价键断裂。102202402602800.10.20.30.4波长（波长（nmnm）光光吸吸收收123天然天然DNA变性变性DNA核苷酸总吸收值核苷酸总吸收值123变性变性因素：因素：热变性热变性 酸碱变性（酸碱变性（pH小于小于4或大于或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） 变性变性后的理化性质：后的理化性质：260nm吸收值升高。吸收值升高。

7、粘度降低，浮力密度升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。二级结构改变，部分失活。11DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。范围内。DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为解链温度解链温度（melting temperature, Tm）。）。12影响影响DNA的的Tm值的因素值的因素DNA均一均一性性均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性的均一性 。G-C含量含量与与Tm值值成正比成正比测定测定Tm，可推知，可推知G-

8、C含量含量。G-C%=（Tm-69.3）2.4413介质中离子强度介质中离子强度 离子强度离子强度高，高，Tm高。高。14（二）复性（二）复性 (renaturation) 变性变性的的DNA在适当的条件下，两条彼此分开的在适当的条件下，两条彼此分开的DNA单单链重新缔合成为双螺旋结构的过程。链重新缔合成为双螺旋结构的过程。15（三）核酸（三）核酸分子杂交分子杂交 (Hybridization)16不同来源的不同来源的DNA单链间或单链单链间或单链DNA与与RNA之间之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称螺旋区，称核酸分子杂交核酸分子

9、杂交（hybridization）。）。制备特定的制备特定的探针探针（probe）通过杂交技术可进行）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究基因的检测和定位研究。1753535353提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳、碱变性琼脂糖凝胶电泳、碱变性转移到转移到NC膜，高温烘烤膜，高温烘烤与与DNA杂交杂交放射自显影放射自显影Southern blotting可用于可用于DNA之间之间同源性分析，确同源性分析，确定特异性定特异性DNA序序列的大小和定位。列的大小和定位。Southern印迹法印迹法 19Northern Blotting研究对象是研究对象是mRNA，探针一般是，探针一般是DNA。总总RNA或或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）。）。Western Blotting抗原抗原与抗体的杂交与抗体的杂交研究对象是蛋白质，研究对象是蛋白质，“探针探针”是抗体。是抗体。2021小结小结 核酸的分子组成以及核苷酸之间的连接方式。核酸的分子组成以及核苷酸