生物技术大实验-自制2014年

1、实验一、PCR技术及应用实验原理 多聚酶链反应（多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。可简述为：的天然复制过程。可简述为： 在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板量模板DNA，四种脱氧核苷酸（，四种脱氧核苷酸（dNTP），），和耐热和耐热Taq聚合酶及两个合成的聚合酶及两个合成的DNA引物，引物，并有并有Mg2+存在。存在。实验原理加热使模板DNA在高温下（94）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（56）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72），

2、在Taq酶作用下，以四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。经过2535个循环，DNA扩增倍数可达106109。实验原理 实验目的 本实验以食蟹猴人芽囊虫虫本实验以食蟹猴人芽囊虫虫DNA为模板，设计引物，扩增出为模板，设计引物，扩增出1100 bp的的扩增产物。学习并掌握扩增产物。学习并掌握PCR 反应的基反应的基本原理与实验

3、技术。本原理与实验技术。器材和试剂器材 PCR扩增仪，旋涡振荡器，台式离心机，扩增仪，旋涡振荡器，台式离心机，加样枪及枪头等加样枪及枪头等器材与试剂器材与试剂试剂： 1、蓝色帽管：天根、蓝色帽管：天根2Taq MasterMix(内含内含Taq DNA 聚合酶、聚合酶、 dNTP 、Mg和上样和上样buffer等）等） 2、白色管：引物、白色管：引物 1 引物引物 2 3、白色管：无菌、白色管：无菌ddH2O 4、模板、模板DNA：人芽囊虫基因组：人芽囊虫基因组DNA 操作操作 无菌无菌ddH2O 8 ul 2Taq MasterMix 10 ul 引物引物1 0.5 ul 引物引物2 0.5

4、 ul 模板模板DNA 1ul 总体积总体积 20 ul混匀后，高速瞬时离心混匀后，高速瞬时离心 ，置，置PCR仪上仪上操作操作PCR扩增的设定：设置设置PCR扩增仪的热盖温度为扩增仪的热盖温度为99预变性：预变性：94 4min循环：循环： 95变性变性45s 54退火退火 45s 35个循环个循环 72延伸延伸1min最后延伸：最后延伸：72 5min产物进行电泳拍照。产物进行电泳拍照。注意事项注意事项由于由于PCR技术非常敏感，可使一个技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，装有分子得以扩增，装有PCR试剂的试剂的微量离心管打开之前，应先在微量离心微量离心管打开之前，应先在微量离心机上

5、作瞬时离心使液体沉积于管底。机上作瞬时离心使液体沉积于管底。最好在加完所有其它反应成分后才加模最好在加完所有其它反应成分后才加模板板DNA，加模板，加模板DNA时不要形成喷雾。时不要形成喷雾。若用没有热盖的若用没有热盖的PCR扩增仪，则需在反扩增仪，则需在反应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体系以防止反应过程中液体的蒸发。系以防止反应过程中液体的蒸发。 【思考题】【思考题】 1、PCR反应的原理是什么？反应的原理是什么？ 2、PCR反应体系包括那些？反应体系包括那些？实验二实验二 质粒质粒DNADNA的提取的提取质粒质粒 (plasmid)特点特点 能在宿主细胞

6、内独立自主复制；带有某些能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 载体的选择标准载体的选择标准 能自主复制；能自主复制； 有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNADNA插入点），常具有多插入点），常具有多个单一酶切位点，称为个单一酶切位点，称为多克隆位点多克隆位点； 具有两个以上的具有两个以上的遗传标记遗传标记，便于重组体的，便于重组体的筛选和鉴定；筛选和鉴定； 分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。质粒的复制型质粒的复制型v质粒在细胞内的复制一般有两种类型质粒在细胞内的复制一般有两种类型:

7、严谨型严谨型(Stringent control) ：只在细胞：只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有每个细胞内只有12个质粒个质粒 松弛型松弛型(Relaxed control) ：质粒在整：质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制停止后，质粒仍然能继续复制，体复制停止后，质粒仍然能继续复制，每个细胞中含有每个细胞中含有10-200个拷贝。个拷贝。实验目的 掌握碱裂解法抽提质粒的掌握碱裂解法抽提质粒的原理原理、步骤步骤及及各主要试剂的作用各主要

8、试剂的作用。质粒质粒 DNA 的分离和纯化的分离和纯化质粒提取的主要步骤：质粒提取的主要步骤：细菌的培养细菌的培养细菌的收集和裂解细菌的收集和裂解提纯的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质：要去除的物质：蛋白蛋白基因组基因组DNARNA 碱裂解法抽提质粒碱裂解法抽提质粒 1.1.质粒提取试剂盒质粒提取试剂盒(离心柱型离心柱型)实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异拓扑学上的差异来分离它们。来分离它们。 在在碱性碱性pH，染色体，染色体DNA的氢键断

9、裂，双螺旋结构解开；的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条链不会完全分离。的两条链不会完全分离。 当当用用pH4.8的的KAc或或NaAc高盐缓冲液调节其高盐缓冲液调节其pH值到中性值到中性时，时，质粒质粒DNA分子分子能够迅速准确地复性，呈溶解状态，能够迅速准确地复性，呈溶解状态，离心时留在离心时留在上清上清中；而中；而线状染色体线状染色体DNA则不能复性，形则不能复性，形成缠绕的网状物，通过离心，染色体成缠绕的网状物，通过离心，染色体DNA与不稳定的大与不稳定的大分子分子RNA、蛋白质、蛋白质-SDS

10、复合物一起复合物一起沉淀沉淀下来而被除去。下来而被除去。 再用再用酚氯仿抽提酚氯仿抽提进一步纯化质粒进一步纯化质粒DNADNA，用，用无水乙醇无水乙醇沉淀沉淀质粒质粒DNADNA。平衡液平衡液BL (Buffer BL) 溶液溶液P1 (Buffer P1)溶液溶液P2 (Buffer P2)溶液溶液P3 (Buffer P3)去蛋白液去蛋白液PD (Buffer PD) 漂洗液漂洗液PW (Buffer PW)洗脱缓冲液洗脱缓冲液EB (Buffer EB)RNase A (10 mg/ml) 吸附柱吸附柱CP3 (Spin Columns CP3)收集管收集管(2 ml) (Collect

11、ion Tubes 2 ml) 质粒提取试剂盒组成质粒提取试剂盒组成 使用本试剂盒之前，先在溶液使用本试剂盒之前，先在溶液P1中加入中加入RNaseA。溶液。溶液P1使用完毕后，请立即至于使用完毕后，请立即至于4保存。保存。2. 漂洗液漂洗液PW在第一次使用前需加入无水乙醇，在第一次使用前需加入无水乙醇，15ml的漂的漂洗液中需加入洗液中需加入60ml的无水乙醇，混匀后方可使用。的无水乙醇，混匀后方可使用。3. 使用前先检查平衡液使用前先检查平衡液BL、溶液、溶液P2 和和P3 是否出现浑浊，是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在如有浑浊现象，可在37水浴中加热几分钟，即可恢复水浴中加热几分钟，即可

12、恢复澄清。澄清。 实验准备实验准备 实验仪器与材料实验仪器与材料（一）仪器：超净工作台，（一）仪器：超净工作台，恒温摇床，台式离心机，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅高压灭菌锅（二）材料：（二）材料：1.5ml 离心管，离心管，加样枪，加样枪，含有质粒含有质粒pVAX1pVAX1的大肠杆菌的大肠杆菌TOP10 TOP10 、LBLB液液体培养基体培养基实验步骤实验步骤 1. 细菌培养：细菌培养：接种含接种含质粒质粒pVAX1的的大肠杆菌大肠杆菌TOP10 10l 到到10ml含含氨苄青霉氨苄青霉素素(100g /ml)的的LB培养液中，培养液中， 37摇培过夜（摇培过夜（1012h）2. 柱平

13、衡柱平衡：向吸附柱中加入：向吸附柱中加入500ul的的平衡液平衡液BL，将吸附柱置于收集管上，将吸附柱置于收集管上 12000 rpm，1min倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于收集管上倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于收集管上3. 收集菌体：收集菌体： 取取1.5ml菌液转入小离心管中菌液转入小离心管中 12000 rpm，1min弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清。弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清。 4.悬浮悬浮： 加加250ul溶液溶液P1于细菌沉淀中，涡旋震荡（或用加样枪吹打），彻底于细菌沉淀中，涡旋震荡（或用加样枪吹打），彻底悬浮细菌沉淀。（注：一定要彻底悬浮，否则

14、抽提质粒悬浮细菌沉淀。（注：一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会的纯度及得率会大大降低）。大大降低）。5. 裂解：裂解：加加250ul溶液溶液P2，立即，立即轻柔颠倒离心管轻柔颠倒离心管6-8次次, （此时菌液应变得此时菌液应变得清亮粘清亮粘稠稠，所用时间，所用时间不应超过不应超过5min，以免质粒受到破坏）。，以免质粒受到破坏）。(注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质，造成提取的质粒中混有基因组片断。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，粒中混有基因组片断。如果未变得清亮，可能由于菌体过多

15、，裂解不彻底，应减少菌体量。应减少菌体量。)6.中和：中和： 加加350ul溶液溶液P3 ，立即温和颠倒离心管立即温和颠倒离心管6-8次次，充分混匀，此时将出，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。现白色絮状沉淀。（注：此时（注：此时质粒质粒DNA复性复性，染色体染色体DNA与蛋白质与蛋白质-SDS复合物沉复合物沉淀淀）。）。 12000 rpm, 10 min7.转移上清：转移上清：将上清转移到将上清转移到CP3中（注意尽量不要吸出沉淀）中（注意尽量不要吸出沉淀） 12000 rpm, 30-60sec8. 漂洗漂洗DNA：向吸附柱向吸附柱CP3中加入中加入600 l漂洗液漂洗液PW（请先检查（

16、请先检查是否已加入无水乙醇），是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心离心30-60 sec，倒掉收集管，倒掉收集管中的废液，将吸附柱中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。放入收集管中。9 . 重复步骤重复步骤8。10. 去漂洗液：去漂洗液：将将空吸附柱空吸附柱重新置于收集管上，重新置于收集管上，10000rpm，2min，以除去吸附柱中残余的漂洗液。，以除去吸附柱中残余的漂洗液。11. 收集质粒：收集质粒：将吸附柱置于一个干净的小离心管上将吸附柱置于一个干净的小离心管上，向吸附膜，向吸附膜的中间部位滴加的中间部位滴加30-50ul洗脱漂洗液洗脱漂洗液EB（或（或dw），放置，放置2mi

17、n，12000 rpm，2min，离心管中即为收集的质粒溶液，做好标记，离心管中即为收集的质粒溶液，做好标记，低温保存备用。低温保存备用。DNADNA的保存的保存 1 1、短期贮存：、短期贮存： 44或或-20-20存放于存放于TETE（TrisTris和和EDTAEDTA）缓冲液中。）缓冲液中。 TETE缓冲液的缓冲液的PHPH与与DNA DNA 贮存有关，贮存有关，PHPH为为8 8时，可减少时，可减少DNADNA脱氨反脱氨反应，应，PHPH低于低于7.07.0时时DNADNA容易变性。容易变性。2 2、长期贮存：、长期贮存： 置于置于TETE缓冲液中缓冲液中-70-70可保存数年；在可保

18、存数年；在DNADNA溶液中加一滴氯仿溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。可有效防止细菌和核酸的污染。离心的注意事项离心的注意事项1. 重量相等重量相等离心管或试管需离心管或试管需平衡（称重）平衡（称重）2. 位置对称位置对称平衡好的离心管平衡好的离心管或试管需或试管需对称对称放置放置实验三实验三 质粒质粒DNA的限制性酶切的限制性酶切与鉴定与鉴定【实验目的实验目的】 学习通过限制性酶切法签定阳性克隆的方学习通过限制性酶切法签定阳性克隆的方法原理与技术，熟悉琼脂糖电泳原理及操法原理与技术，熟悉琼脂糖电泳原理及操作作 。【实验原理实验原理】 限制性内切酶是限制性内切酶是DNA操作过程中所

19、使用的基本工操作过程中所使用的基本工具。限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识具。限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为类限制酶，其识别位点长度为4、5或或6个核苷酸个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘片段，而另一些产生带有粘性末端的性末端的DNA。1、质粒、质粒DNA的限制酶切的限制酶切

20、pVAX1酶切位点的分布示意图【实验仪器与试剂实验仪器与试剂】一、实验仪器一、实验仪器 1、微量移液器、微量移液器 2、离心机、离心机 3、恒温水浴箱、恒温水浴箱二、试剂二、试剂 1、EcoR I 和和 Hind 2、ddH2O【实验步骤实验步骤】 在一个洁净的在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：离心管中混匀下列反应物：反应物反应物体积（体积（l）质粒质粒DNA1010M Buffer2Hind 0.5EcoR-I0.5水7总计202、将反应物置于、将反应物置于37水浴，温浴水浴，温浴2小时。小时。3、加入、加入5 l加样缓冲液，混匀后即可加样加样缓冲液，混匀后即可加样进行电泳。进

21、行电泳。4、在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。、在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。一、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。1、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳二、试剂与器材二、试剂与器材电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽缓冲液缓冲液琼脂糖琼脂糖凝胶槽凝胶槽梳子梳子取液器取液器溴酚蓝溴酚蓝试试 剂剂 1、50Tris-乙酸-EDTA缓冲液（TAE缓冲液），

22、pH8.3：称取Tris 242g，EDTA-Na2 37.2 g 溶于800 ml去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1 ml的乙酸，充分混匀定容至1000mL。 2、琼脂糖： 1g 溶于TAE缓冲液中加热配成100mL。 3、0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液（5Loading Buffer ） ：取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。 4、0.5g/mL溴化乙啶染色液：称取5mg溴化乙啶，用去离子水溶解，定容至100mL。从中取1mL，用无离子水稀释至100mL。（有毒，戴手套，通风柜内进行。） 5、DNA Marker （TaKaRa公司） 1）DL2,000TM DNA

23、Marker本本 Marker为已含有为已含有1Loading Buffer的的DNA溶液溶液可取可取5L直接电泳直接电泳 1、水平板型电泳槽 2、直流稳压电泳仪 3、微量移液枪 4、凝胶成像系统：可发射紫外光，通过电脑进行凝胶图像的实时观测 器器 材材三、操作方法三、操作方法 1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g 琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂糖。注注 意意要完全融化混匀要完全融化混匀 2、凝胶板的制备 置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表面保持0.5-1mm的间隙。待琼脂糖冷至65左右，小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开在水平板表面形成一层约3mm厚均匀胶层。静置0.5小时。注注 意意液内不存有气泡液内不存有气泡 待凝固完全后，用滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板，则在胶板上形成相互隔开的样品槽。将凝胶连