多沙唑嗪光学异构体对多种促增殖因子因子诱导的大鼠主动脉

1、多沙唑嗪光学异构体对多种促增殖因子因子诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响Effects of doxazosin and its enantiomers on cell proliferation of the rat aortic VSMCs induced by different stimulatorsWANG Rong-Ying1,2, REN Lei-Ming1 *(1Department of Pharmacology, Hebei Medical University School of Pharmacy，Shijiazhuang 050017; 2Department of

2、Emergency, The 2nd Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China)Abstract Objective: To investigate the effect of ()doxazosin, (-)doxazosin and (+)doxazosin on cell proliferation of the rat aortic VSMCs induced by different stimulators. METHODS: VSMCs of the rat aorta w

3、ere cultured by tissue-piece attachment method and MTT assay was used to determine the cell proliferation. RESULTS: Incubation of the rat aortic VSMCs with (-)doxazosin, (+)doxazosin and ()doxazosin (330molL-1) for 48h inhibited the cell proliferation stimulated by PDGF-BB、Ang、thrombin and the high

4、concentration of glucose (25.6mmolL-1) significantly (P0.05). CONCLUSION: ()Doxazosin and its enantiomers significantly inhibit cell proliferation in the rat aortic VSMCs stimulated by PDGF-BB, angiotensin II, thrombin and high concentration of glucose without chirally selective effects. 【key words】

5、doxazosin, enantiomer, vascular smooth muscle cell, stimulators,cell proliferation（PDGF-BB）、血管紧张素II（Ang）、凝血酶和髙糖（浓度为25.6mmolL-1）刺激的大鼠主动脉VSMCs增殖（P0.05）。结论：()Doxazosin及其光学异构体对PDGF-BB、Ang II、凝血酶和高糖诱发大鼠主动脉VSMCs增殖反应均有抑制作用，并且具有浓度依赖性；3种药物的同浓度的抑制作用无显著差异，【关键词】多沙唑嗪；光学异构体；血管平滑肌细胞；促增殖因子；细胞增殖动脉粥样硬化斑块和血管再狭窄的病理过程极为

6、复杂，如包括血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell ，VSMC）在内的多种细胞之间的交互作用，同时还涉及各种细胞合成和释放的细胞因子、趋化因子、生长因子和炎症介质1。国内外大量实验数据显示，血小板源生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、血管紧张素II（angiotensin，Ang II）、凝血酶和纤维蛋白原等具有显著的促进VSMCs增殖的作用。为了探索具有干预VSMCs增殖与迁移，并能用于临床的治疗AS药物，Hu等2研究了消旋多沙唑嗪()doxazosin抗人主动脉VSMCs增殖的作用和作用机制，并发现，对人主动脉

7、VSMCs，()doxazosin是一个强效抗增殖剂，其对PDGF-AB、Ang II、凝血酶、小牛血清和EGF（epidermal growth factor）诱导的增殖均具有浓度依赖性抑制作用；该作用与药物的受体阻断作用无关。国内外学者对()doxazosin进行了手性分离3-4，得到其单一对映体左旋多沙唑嗪(-)doxazosin和右旋多沙唑嗪(+)doxazosin。研究结果表明, 在兔离体胸主动脉、颈动脉、肠系膜动脉等血管标本，(-)doxazosin对血管a1受体的阻断作用明显弱于()doxazosin和(+)doxazosin 5-6，且其降低麻醉大鼠动脉血压的作用亦明显弱于()

8、doxazosin和(+)doxazosin，但是，(-)doxazosin降低麻醉大鼠和豚鼠的膀胱排尿压的作用与()doxazosin相同7-8。说明(-)doxazosin的药理活性，在心血管系统和下尿路系统之间，具有立体结构的选择性。因此，对于PDGF、Ang II和凝血酶等诱导的VSMCs增殖反应，(-)doxazosin和(+)doxazosin是否具有与()doxazosin相同的作用，值得进一步研究。1材料和与方法1.1 仪器、药品和动物：甲磺酸消旋多沙唑嗪()doxazosin，甲磺酸左旋多沙唑嗪(-)doxazosin和甲磺酸右旋多沙唑嗪(+)doxazosin均由华北制药集

9、团新药研究开发有限责任公司提供。DMEM粉、小牛血清和胰蛋白酶购自美国GIBICOGibco？公司，二甲基亚砜（DMSO）购自天津百世化工有限公司。四唑盐（MTT）及鼠抗人a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（Mouse mouse monoclonal anti-smooth muscle a-actin antibody）购自Sigma公司。医用净化工作台，苏州市金燕净化设备有限公司；CO2恒温培养箱，日本Yamato公司；全自动酶标分析仪，美国Thermo electron corporation；低温高速离心机，德国Heraeus公司；光学倒置显微镜为广州梧州市光学仪器厂；96孔细胞培养板,美

10、国Corning公司。(-)doxazosin、(+)doxazosin和()doxazosin均以无菌双蒸水配制，过滤除菌。4-6周龄雄性SD大鼠，4-6周，体质量120-150g/只，雄性，由河北省实验动物中心提供。1.2 VSMCs培养和鉴定采用组织块贴壁培养法，将SD大鼠脱臼处死，无菌开胸，取胸主动脉，纵向剖开血管，钝性剥离内膜，将动脉剪成1mm1mm 大小的组织块。移入100mLml培养瓶，置入5% CO2恒温培养箱中，37原代培养；用胰酶消化法进行传代，实验采用第3-6代VSMCs。培养过程中，定期观察VSMCs的形态学变化和生长方式；对第5代细胞进行a-actin免疫组织化学鉴定

11、。1.3 细胞增殖抑制实验（MTT法）：将细胞悬液按每mlml含3104个的细胞密度接种于96孔培养板，每孔200l，标准条件培养。当细胞贴壁、生长至覆盖孔底80%时，换无血清DMEM培养液200l 同步化24h。弃液，换为含0.4%小牛血清的DMEM液180l。在Ang作为刺激剂的实验中，溶媒对照组先加入10l双蒸水，60min后加入10l 2nmolmlml-1 浓度的Ang溶液（终浓度为100 nmolL-1），标准条件下培养48 h；实验组分别加入不同浓度（0.3、3.0、10.0和30.0molL-1）的(-)doxazosin、(+)doxazosin和()doxazosin各10

12、l代替双蒸水，其他条件同溶媒对照组。在以PDGF-BB、髙糖或凝血酶作为刺激剂的实验中，仅将上述实验中10l的Ang替换为10l的0.02nmolmlml-1浓度的PDGF-BB溶液（终浓度为1 nmolL-1）或0.5mmolmlml-1的高糖溶液（终浓度为25.6mmolL-1）或20Umlml-1的凝血酶溶液（终浓度为1 Umlml-1），其他实验条件不变。每组均设6个复孔。于培养结束前4 h，各孔加入0.5的MTT溶液（MTT溶于PBS，5gL-1 ）20 l。培养结束后，弃上清，每孔加入DMSO 150 l，于微量振荡器上震振荡10 min；于自动酶标仪上测定各孔OD值（l = 49

13、0 nm），计算细胞抑制率。计算公式为：抑制率（）=（1实验组OD值D(490)溶媒对照组D(490)OD值）100% 。1.4 统计学处理：实验数据以实测值或变化百分率的S表示。各组均数的比较时，同一药物多浓度的效应比较或相同浓度多个药物的效应比较，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P0.05时进一步采用Dunnetts test。两个药物之间的量效曲线的统计学分析，采用双因素方差分析（two-way ANOVA），P0.05时进一步采用Bonferronis test。两组间数据的统计学分析采用非配对t-test检验。统计学分析及图形处理使用GraphPad Prism 5

14、.0软件。2 结果2.1 ()Doxazosin及其光学异构体对PDGF-BB诱发VSMCs增殖的影响 与溶媒组相比，(-)doxazosin、(+)doxazosin和()doxazosin（330molL-1）作用于VSMCs 48h，均显著抑制PDGF-BB刺激的大鼠主动脉VSMCs增殖（P0.01）。在含0.4%小牛血清及PDGF-BB的DMEM培养液中，()doxazosin及其光学异构体作用于VSMCs 48h时的最大抑制率为(95.216.05)(99.671.99)。在3molL-1浓度时，(+)doxazosin的抑制率显著低于()doxazosin（P0.05）。(-)Do

15、xazosin、(+)doxazosin和()doxazosin抑制VSMCs增殖达50%的浓度（IC50）分别为5.443.16、7.503.40和4.984.52molL-1。2.2 ()Doxazosin及其光学异构体对Ang诱发VSMCs增殖的影响 (-)doxazosin、(+)doxazosin和()doxazosin在330mmolL-1浓度作用于VSMCs 48h，均显著抑制Ang刺激的大鼠主动脉VSMCs增殖（P0.05）。 ()doxazosin及其对映体作用于VSMCs 48h时的最大抑制率为93.013.2394.613.11。(-)Doxazosin、(+)doxaz

16、osin和()doxazosin抑制VSMCs增殖的IC50值分别为13.382.5、14.242.47和13.712.89mmolL-1。2.3 ()Doxazosin及其光学异构体对凝血酶诱发VSMCs增殖的影响 (-)doxazosin、(+)doxazosin和()doxazosin在330mmolL-1浓度作用于VSMCs 48h，均显著抑制凝血酶刺激的大鼠主动脉VSMCs增殖（P0.05）； ()doxazosin及其对映体作用于VSMCs 48h时的最大抑制率为91.875.1394.633.33。(-)Doxazosin、(+)doxazosin和()doxazosin抑制VS

17、MCs增殖的IC50值分别为13.522.87、14.602.95和14.322.75mmolL-1。2.4 ()Doxazosin及其光学异构体对髙糖诱发VSMCs增殖的影响 (-)doxazosin、(+)doxazosin和()doxazosin在330mmolL-1浓度作用于VSMCs 48h，均显著抑制髙糖刺激的大鼠主动脉VSMCs增殖（P0.01）。 (-)doxazosin在浓度为3mmolL-1时的抑制率显著高于同浓度(+)doxazosin（PAng II凝血酶；其中PDGF诱导DNA合成的能力约为凝血酶的10倍，Ang II的作用略强于凝血酶2。我们在大鼠胸主动脉VSMCs

18、实验中发现，三3个促增殖剂的活性序列未变，Ang II的作用亦略强于凝血酶；但是，PDGF-BB促增殖活性仅为凝血酶的1.4倍。这种差异可能与两个实验所用的组织标本不同、细胞增殖的测定指标不同以及PDGF的种类不同有关。国内张健等9采用MTT法，观察PDGF-BB（2nmolL-1）对大鼠胸主动脉VSMCs的促增殖作用，PDGF-BB的作用强度与本研究中的凝血酶相似。在前期的研究中10，10%小牛血清（5.6mmolL-1葡萄糖）促VSMCs增殖的实验条件下，(-)doxazosin、(+)doxazosin和()doxazosin对体外培养的大鼠主动脉VSMCs具有抗增殖作用，其中(-)do

19、xazosin的作用强于(+)doxazosin；30mmolL-1的(+)doxazosin预处理48h产生的最大抑制率为33.002.79%。以PDGF-BB、Ang II、凝血酶和高糖作为促增殖剂时，30mmolL-1的(+)doxazosin预处理48h的最大抑制率分别为（99.671.99）%、94.613.11%、94.633.33%和96.163.09%。尽管双因素方差分析结果显示，(+)doxazosin抗PDGF-BB的促增殖作用弱于()doxazosin（P0.05），且其抗高糖促增殖作用弱于(-)doxazosin（P0.05）；然而，(-)doxazosin、(+)do

20、xazosin和()doxazosin对四4种促增殖剂的最大抑制率均超过了90%。显然，()doxazosin及其两种光学异构体对PDGF-BB、Ang II、凝血酶和高糖诱发大鼠主动脉VSMCs增殖反应的抑制效应强于对小牛血清的抑制效应。Hu等2亦发现对于PDGF-AB、Ang II、凝血酶和EGF诱导的人主动脉VSMCs增殖，()doxazosin是一个强效抗增殖剂。在作用机制方面，初步实验结果表明，()doxazosin的抗VSMCs增殖作用似乎与PDGF受体酪氨酸激酶、酪氨酸蛋白激酶Src、Ras-MAPK或核糖体S6蛋白激酶无关2。()Doxazosin的作用可能涉及某种新的药物靶点

21、。综上所述，()Doxazosin及其光学异构体对PDGF-BB、Ang II、凝血酶和高糖诱发大鼠主动脉VSMCs增殖反应的抑制效应强于对小牛血清的抑制效应，并且具有浓度依赖性，三3种药物的同浓度的抑制作用无显著差异。【参考文献】1 Jia G, Cheng G, Agrawal DK. Autophagy of vascular smooth muscle cells in atherosclerotic lesionsJ. Autophagy, 2007, 3(1): 63-64.2 Hu ZW, Shi XY, Hoffman BB. Doxazosin inhibits prolif

22、eration and migration of human vascular smooth-muscle cells independent of a1-adrenergic receptor antagonismJ. J Cardiovasc Pharmacol, 1998, 31(6): 833-839.3 Courtney CH, McCance DR, Atkinson AB, et al. Effect of the alpha-adrenergic blocker, doxazosin, on endothelial function and insulin actionJ. M

23、etabolism, 2003, 52(9): 1147-1152.4 张健, 蔡生业, 姚成芳. 花刺参粘多糖对血小板源生长因子BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响J. 中国动脉硬化杂志, 2007, 15(1): 1-5.5 McNamara CA, Sarembock IJ, Gimple LW, et al. Thrombin stimulates proliferation of cultured rat aortic smooth muscle cells by a proteolytically activated receptorJ. J Clin Invest, 19

24、93(1), 91: 94-98.6 Patterson C, Stouffer GA, Madamanchi N, et al. New tricks for old dogs: nonthrombotic effects of thrombin in vessel wall biologyJ. Circ Res, 2001, 88(10): 987-997. 7 Hatton MW, RossB, Southward SM, et al. Platelet and fibrinogen turnover at the exposed subendothelium measured over

25、 1 year after a balloon catheter de-endothelializing injury to the rabbit aorta: thrombotic eruption at the late re-endothelialization stageJ. Atherosclerosis, 2002, 165(1): 57-67.8 Wilcox JN, Rodriguez J, Subramanian R, et al. Characterization of thrombin receptor expression during vascular lesion

26、formationJ. Circ Res, 1994, 75(6): 1029-1038.9 张健, 蔡生业, 姚成芳. 花刺参粘多糖对血小板源生长因子BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响J. 中国动脉硬化杂志, 2007, 15(1): 1-5.10 王荣英，任雷鸣. 多沙唑嗪光学异构体对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的选择性抑制作用J.中国药理学通报,2009,25(1):81-84.收稿：修回：表请随文走附表 表1 ()Doxazosin及其光学异构体对PDGF-BB（1 nmol/L-1) 和 AngII（100 nmol/L-1) 诱导的VSMCs增殖的影响 (s, D(490)，n =6)Drugs molL-1Cell viability (OD490 nm)AngIIPDGF-BBSolvent0.510.