重组DNA技术与重组蛋白表达PPT课件

1、A 酵母作为表达外源基因受体的特征6 外源基因在酵母中的表达 酵 母 （ Y e a s t ） 是 一 群 以 芽 殖 或 裂 殖 方 式 进 行 无 性 繁 殖 的 单 细 胞半 知 菌 类 （ 半 知 酵 母 ） ， 共 由 5 6 个 属 、 5 0 0 多 个 种 组 成 。 如 果 说 大 肠杆 菌 是 外 源 基 因 最 成 熟 的 原 核 生 物 表 达 系 统 ， 则 酵 母 菌 是 最 成 熟 的 真核生物表达系统。酵母的分类学特征真 核 生 物 ， 分 属 于 子 囊 菌 纲 （ 子 囊 酵 母 ） 、 担 子 菌 纲 （ 担 子 酵 母 ） 、第1页/共57页A 酵母作

2、为表达外源基因受体的特征6 外源基因在酵母中的表达酵母表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物第2页/共57页B 酵母的宿主系统6 外源基因在酵母中的表达提高重组蛋白表达产率的突变宿主抑制超糖基化作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主广泛用于外源基因表达的酵母宿主

3、第3页/共57页广泛用于外源基因表达的酵母宿主目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母包括：酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。第4页/共57页提高重组蛋白表达产率的突变宿主能导致酿酒酵母中重组蛋白

4、产量提高或质量改善的突变类型：ssc1ssc2rgr1ose1ssc11 rho-突变类型生物效应作用位点改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶提高重组蛋白表达转录后加工转录水平提高重组蛋白表达转录水平提高重组蛋白表达改善重组蛋白分泌羧肽酶Y转录水平提高重组蛋白表达第5页/共57页抑制超糖基化作用的突变宿主能抑制超糖基化的突变类型mnnalgoch突变类型生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超

5、糖基化缺陷株非常重要。甘露糖生物合成缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型外侧糖链添加缺陷型第6页/共57页减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体LysHOOCUbiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3 Lysubiquitin ligase E3 Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白第7页/共57页减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期

6、关闭UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7第8页/共57页减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主泛素降解途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能UBI 4缺陷型：正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。UBA 1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因

7、缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。Ubc4 - ubc5 双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。第9页/共57页C 酵母的载体系统6 外源基因在酵母中的表达酵母克隆表达质粒的构建酵母中的野生型质粒第10页/共57页酵母中的野生型质粒酿酒酵母中的2m环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB环状质粒，拷贝数达50至100个。IRs 反向重复序列，600 bp，重组FLP 编码产物驱动IRs的同源重组REP 编码产物控制质粒的稳定性STB REP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维

8、酵母属中的pKD1等均与2m质粒类似。第11页/共57页酵母中的野生型质粒乳酸克鲁维酵母中的线状质粒乳 酸 克 鲁 维 酵 母 中 含 有 两 种 不 同pGKL1 8.9 kbDNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亚基的 双 链 线 状 质 粒 p G K L 1 和 p G K L 1拷 贝 数 为 5 0 - 1 0 0 个 ， 分 别 携 带 K 1K 2 两 种 能 使 多 种 酵 母 菌 致 死 的 毒反向重复序列素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。第12页/共57页酵母克隆表达质粒的构建含有ARS的YRp质粒的构建 A R S 为 酵 母 菌 中 的 自

9、主 复 制 序 列 ， 0 . 8 - 1 . 5 k b ， 染 色 体 上 每 3 0 - 4 0 k b就 有 一 个 A R S 元 件 。 酵 母 菌 自 主 复 制 型 质 粒 的 构 建 组 成 包 括 复 制 子 、 标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 上 述 两 类 质 粒 在 酿 酒 酵 母 中 的 拷 贝 数 最 高 可 达 2 0 0 个 ， 但 培 养 几 代 以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。第13页/共57页酵母克隆表达质粒的构建含有CEN的YCp

10、质粒的构建 CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 5个含有TEL的YAC质粒的构建第14页/共57页酵母克隆表达质粒的构建含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建 在 大 肠 杆 菌 质 粒 上 组 装 酵 母 菌 染 色 体 D N A 特 定 序 列 和 标 记 基 因 ， 构建 出 来 的 质 粒 称 为 Y i p 。 目 的 基 因 表 达 盒 通 常 插 在 染 色 体 D N A 特 定 序 列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染

11、色体DNA区域。第15页/共57页D 酵母的转化系统6 外源基因在酵母中的表达转化质粒在酵母细胞中的命运酵母菌的转化程序用于转化子筛选的标记基因第16页/共57页酵母的转化程序酵母原生质体转化法 早 期 酵 母 菌 的 转 化 都 采 用 在 等 渗 缓 冲 液 中 稳 定 的 原 生 质 体 转 化 法在 C a2 +和 P E G 的 存 在 下 ， 转 化 细 胞 可 达 原 生 质 体 总 数 的 1 - 2 % 。 但 该 程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。 原 生 质 体 转 化 法 的 一 个 显 著 特 点 是 ， 一 个 受 体 细 胞 可 同 时 接

12、纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%。第17页/共57页酵母的转化程序碱金属离子介导的酵母完整细胞的转化 酿 酒 酵 母 的 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 （ 如 L i+等 ） 、 P E G 、 热 休 克 处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍共转化现象极为罕见第18页/共57页酵母的转化程序酵母电击转化法 酵 母 菌 原 生 质 体 和 完 整 细 胞 均 可 在 电 击 条 件 下 吸 收 质 粒 D N A ， 但在 此 过 程 中 应 避 免 使 用 P E G ， 它 对

13、 受 电 击 的 细 胞 具 有 较 很 大 的 负 作 用电 击 转 化 的 优 点 是 不 依 赖 于 受 体 细 胞 的 遗 传 特 征 及 培 养 条 件 适 用 范 围广，而且转化率可高达105 / mg DNA。第19页/共57页转化质粒在酵母细胞中的命运单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍；含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制；不 含 复 制 子 的 单 链 质 粒 进 入 细 胞 后 ， 能 高 效 地 同 源 整 合 入 染 色 体这对于体内定点突变酵母基因组极为有利；克 隆 在 Y I p 整 合 型 质 粒 上 的 外 源 基

14、 因 ， 如 果 含 有 受 体 细 胞 的 染 色 体D N A 的 同 源 序 列 ， 会 发 生 高 频 同 源 整 合 ， 整 合 子 占 转 化 子 总 数 的50-80%。第20页/共57页用于转化子筛选的标记基因 用 于 酵 母 菌 转 化 子 筛 选 的 标 记 基 因 主 要 有 营 养 缺 陷 型 互 补 基 因 和显性基因两大类： 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。营养缺陷型的互补基因第21页/共57页用于转化子筛选的标记基因 显性标记基因 显性标记基

15、因的编码产物大都是毒性物质的抗性蛋白 aph 氨基糖苷转移酶 抗G418 cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素 dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子 suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂标记基因编码产物遗传表型第22页/共57页E 酵母的表达系统6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母菌中表达的限制因素酵母菌启动子的可控性酵母菌表达系统的选择第23页/共57页酵母启动子的可控性pho4TS-PHO5启动子：酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开；PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子；

16、因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35时关闭，23诱导表达。温度控制型启动子PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35时失活；第24页/共57页酵母启动子的可控性 温度控制型启动子a - a 型启动子：酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATaa 型启动子hmla2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型启动子 受体细胞基因组 重组质粒a 型启动子hmla2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型启动子a2a12535两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hml

17、a2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型第25页/共57页酵母启动子的可控性酿酒酵母超诱导型启动子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由 G A L 1 G A L 7 和 G A L 1 0基因编码第26页/共57页外源基因在酵母中表达的限制因素外源基因稳态mRNA的浓度外源基因mRNA的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性在 酿 酒 酵 母 中 ， 高 丰 度 的 蛋

18、白 质 （ 如 甘 油 醛 - 3 - 磷 酸 脱 氢 酶G A P D H 、 磷 酸 甘 油 激 酶 P K G 、 乙 醇 脱 氢 酶 A D H ） 中 9 6 %以上的氨基酸是由25个密码子编码的。第27页/共57页酵母表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥

19、补。第28页/共57页酵母表达系统的选择 乳 酸 克 鲁 维 酵 母 的 双 链 环 状 质 粒 p K D 1 已 被 广 泛 用 作 重 组 异 源蛋 白 生 产 的 高 效 表 达 稳 定 性 载 体 ， 即 便 在 无 选 择 压 力 的 条 件 下 ， 也乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传40代以上。 乳 酸 克 鲁 维 酵 母 表 达 分 泌 型 和 非 分 泌 型 的 重 组 蛋 白 ， 性 能 均 优于酿酒酵母表达系统。第29页/共57页酵母表达系统的选择 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 是 一 种 甲 基 营 养 菌 ， 能 在 低 廉 的 含 甲 醇 培 养 基 中 生巴斯德毕赤

20、酵母表达系统长 ， 甲 醇 可 高 效 诱 导 甲 醇 代 谢 途 径 中 各 酶 编 码 基 因 的 表 达 ， 因 此 生 长 迅速 、 乙 醇 氧 化 酶 基 因 A O X 1 所 属 强 启 动 子 、 表 达 的 可 诱 导 性 是 巴 斯 德 毕赤酵母表达系统的三大优势。但甲醇易挥发，操作条件差。 由 于 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 没 有 合 适 的 自 主 复 制 型 载 体 ， 所 以 外 源 基 因 的表 达 序 列 一 般 整 合 入 受 体 的 染 色 体 D N A 上 。 在 此 情 况 下 ， 外 源 基 因 的有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功

21、表达。高 效 表 达 在 很 大 程 度 上 取 决 于 整 合 拷 贝 数 的 多 寡 。 目 前 已 有 5 0 余 种 具第30页/共57页酵母表达系统的选择 多 型 汉 逊 酵 母 也 是 一 种 甲 基 营 养 菌 。 其 自 主 复 制 序 列 H A R S 已 被 克多型汉逊酵母表达系统隆 ， 并 用 于 构 建 克 隆 表 达 载 体 ， 但 与 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 相 似 ， 这 种 载 体 在受 体 细 胞 有 丝 分 裂 时 显 示 出 不 稳 定 性 。 所 不 同 的 是 ， H A R S 质 粒 能 高 频自 发 地 整 合 在 受 体 的 染 色 体

22、D N A 上 ， 甚 至 可 以 连 续 整 合 1 0 0 多 个 拷 贝 ， 目 前 ， 包 括 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 在 内 的 数 种 外 源 蛋 白 在 该 系 统 中 获 得因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。成功表达。第31页/共57页F 利用重组酵母生产乙肝疫苗6 外源基因在酵母中的表达 由 乙 型 肝 炎 病 毒 （ H B V ） 感 染 引 起 的 急 慢 性 乙 型 肝 炎 是 一 种 严 重的 传 染 病 ， 每 年 约 有 2 0 0 万 病 人 死 亡 ， 并 有 3 亿 人 成 为 H B V 携 带 者 ， 其中 相 当 一 部 分 人

23、可 能 转 化 为 肝 硬 化 或 肝 癌 患 者 。 目 前 对 乙 型 肝 炎 病 毒还 没 有 一 种 有 效 的 治 疗 药 物 ， 因 此 高 纯 度 乙 型 疫 苗 的 生 产 对 预 防 病 毒感 染 具 有 重 大 的 社 会 效 益 ， 而 利 用 重 组 酵 母 大 规 模 生 产 乙 型 疫 苗 为 其广泛应用提供了可靠的保证。第32页/共57页乙型肝炎病毒的结构与性质 乙 肝 病 毒 是 一 种 蛋 白 包 裹 型 的 双 链 D N A 病 毒 ， 具 有 感 染 力 的 病 毒 颗乙型肝炎病毒的结构粒 呈 球 面 状 ， 直 径 为 4 2 n m ， 基 因 组

24、仅 为 3 . 2 k b 。 病 毒 颗 粒 的 主 要 结 构蛋 白 是 病 毒 的 表 面 抗 原 多 肽 （ H B s A g ） 或 S 多 肽 ， 它 具 有 糖 基 化 和 非 糖基 化 两 种 形 式 。 颗 粒 内 的 蛋 白 成 份 包 括 核 心 抗 原 （ H B c A g ） 、 病 毒 D N A 除 此 之 外 ， 被 乙 肝 病 毒 感 染 的 人 的 肝 脏 还 能 合 成 并 释 放 大 量 的 2 2聚合酶、微量病毒蛋白。n m 的 空 壳 亚 病 毒 颗 粒 ， 其 免 疫 原 性 是 未 装 配 的 各 种 包 装 蛋 白 组 份 的1000倍。包

25、装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。第33页/共57页乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因ATGATGATGTAA108 aa55 aa226 aapreS1preS2SS 多肽226 aaM 多肽281 aaL 多肽399 aa第34页/共57页乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫传统乙肝疫苗的制备苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。第35页/共57页产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 2 0 世 纪 8 0 年 代 开 始 选 择 酿 酒 酵

26、母 表 达 重 组 H B s A g ， 主 要 工 作 包 括将 S 多 肽 的 编 码 置 于 A D H 1 启 动 子 控 制 下 ， 转 化 子 能 表 达 出 具 有 免 疫 活性 的 重 组 蛋 白 ， 它 在 细 胞 提 取 物 中 以 球 形 脂 蛋 白 颗 粒 的 形 式 存 在 ， 平均 颗 粒 直 径 为 2 2 n m ， 其 结 构 和 形 态 均 与 慢 性 乙 肝 病 毒 携 带 者 血 清 中的病毒颗粒相同。 目 前 ， 由 酿 酒 酵 母 生 产 的 重 组 H B s A g 颗 粒 已 作 为 乙 肝 疫 苗 商 品 化重组产物的最终产量可达细胞总蛋白

27、量的1%-2%。 进 一 步 的 研 究 表 明 ， M 多 肽 和 L 多 肽 对 S 型 疫 苗 具 有 显 著 的 增 效 作用 ， 由 三 者 （ 或 两 者 ） 构 成 的 复 合 型 乙 肝 疫 苗 还 可 以 诱 导 那 些 对 S 抗原缺乏响应的人群的免疫反应。第36页/共57页产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建PARS2Bgl II5 AOX1HBsAgPHIS43 AOX1Bgl IIpBSAG15111 kbBgl II5 AOX1 HBsAgPHIS43 AOX1his+的转化子重组分子转化his-的受体细胞染色体DNA第37页/共57页产

28、乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母重组巴斯德毕赤酵母的性能 由 于 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 染 色 体 D N A 上 还 拥 有 第 二 个 乙 醇 氧 化 酶 基 因AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。 重 组 菌 首 先 在 含 有 甘 油 的 培 养 基 中 培 养 ， 待 甘 油 耗 尽 后 ， 加 入 甲醇 诱 导 H B s A g 表 达 ， 最 终 S 蛋 白 的 产 量 可 达 细 胞 可 溶 性 蛋 白 总 量 的 3 %在 大 规 模 的 生 产 过 程 中 ， 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 工 程 菌 在 一 个 2 4 0 L 的 发 酵 罐中

29、培 养 ， 最 终 可 获 得 9 0 克 2 2 n m 的 H B s A g 颗 粒 ， 足 够 制 成 9 0 0 万 份 乙 肝疫苗。第38页/共57页G 酵母糖蛋白生产的人源化改造6 外源基因在酵母中的表达 除抗体外，哺乳动物绝大多数糖蛋白的半衰期和功能依赖于糖链末端的唾液酸，其它裸露的末端糖（如甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖等）会被糖特异性的受体或凝集素清除。由于不少药用糖蛋白需要唾液酸化，因此其生产目前只能依靠哺乳动物宿主，因为后者能进行人样化的N-糖基化反应，包括在末端加唾液酸的能力。酵母和丝状真菌作为重组蛋白表达系统，与哺乳动物细胞相比，具有较高的重组蛋白表达率、较短的发酵

30、周期、能在化学成分确定的培养基中生长等很多优势。然而，野生型酵母往往将高甘露糖型的多糖链加在蛋白质上，直接影响表达产物在人体内的稳定性与功效。第39页/共57页ERER两种多糖合成途径的比较人类糖蛋白侧链多聚糖的成熟，涉及下列基因编码的酶系：MnsI： a-1,2-甘露糖苷酶 IMnsII：a-1,2-甘露糖苷酶 IIGnTI： b-1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶 IGnTII：b-1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶 IIGalT： b-1,4-半乳糖苷转移酶SiaT： a-2,6-唾液酸苷转移酶巴斯德毕赤酵母细胞中不存在上述酶系。第40页/共57页巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造JC308 WTR

31、DP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006敲除4个基因，摧毁巴斯德毕赤酵母原有的超糖基化系统： Doch1，Dpno1，Dmnn4B，Dbmt2导入9个基因，构建人的糖基化系统： UgnT：小鼠的UDP-N-乙酰葡糖胺转运蛋白 UgnT：克鲁维酵母的UDP-N-乙酰葡糖胺转运蛋白 MnsI：小鼠的a-1,2-甘露糖苷酶 I MnsII：果蝇的a-1,2-甘露糖苷酶 II GnTI：人的b-1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶 I GnTII：大鼠的b-1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶

32、II GalE：裂殖酵母的半乳糖差向异构酶 GalE：果蝇的UDP-半乳糖转运蛋白 GalT：人的b-1,4-半乳糖苷转移酶YSH577rEPO第41页/共57页巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPOJC308 WTRDP750b-1,N-GlcNAcb-1,4-GlcNAcb-1,2-GlcNAcb-1,4-Mana-1,6-Mana-1,3-Mana-1,2-Manb-1,4-Gal第42页/共

33、57页巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPO再导入5个基因，构建末端唾液酸的添加系统： GNE：人的UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶 / SPS：人的N-乙酰甘露糖胺丙酮酸-9-磷酸合成酶 CSS：人的CMP-唾液酸合成酶 CST：小鼠的CMP-唾液酸运输因子 ST： 人的唾液酸转移酶与酵母II型转膜定位肽 遗憾的是，YSH577株并未像预期的那样在糖基末端有效添加唾液酸。N-乙酰甘露糖胺激酶

34、融合体第43页/共57页巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPO改善唾液酸化反应的效率：优化GNE、SPS、CSS、CST基因的密码子；构建其它形式的唾液酸转移酶（ST）融合肽，发现来自小鼠a-2,6-ST的催化功能域与酿酒酵母甘露糖基转移酶1将上述五个基因全部克隆在一个表达载体上，并用该表（Mnt1）的靶向信号肽相融合的嵌合体，特别有效；达载体转化YSH577株，获得YSH597株。第44页/共57

35、页巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2006YSH577rEPOJC308 WTYSH597b-1,N-GlcNAcb-1,4-GlcNAcb-1,2-GlcNAcb-1,4-Mana-1,6-Mana-1,3-Mana-1,2-Manb-1,4-Gala-2,6-SiaRDP750第45页/共57页重组巴斯德毕赤酵母分泌的rEPO的鉴定JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551YS

36、H577rEPO重组rEPO的HPLC图谱分析：第46页/共57页重组巴斯德毕赤酵母分泌的rEPO的鉴定JC308 WTRDP750YSH557YSH597Y11430 WTYSH551YSH577rEPO重组rEPO的血细胞比容分析：YSH551株YSH597株注射第 8 天注射第15天第47页/共57页H 酵母转录机器的基因工程综合改造6 外源基因在酵母中的表达 化石能源的日益消耗大大促进了可再生型生物燃料（如乙醇等）的开发与生产。然而，大规模发酵生产燃料乙醇的关键是酵母对高浓度乙醇和葡萄糖的耐受性。长期以来，人们普遍关注的是对乙醇生物合成基因和耐受基因的遗传操作，这些努力虽然取得了显著的

37、进步，但似乎触及了极限。基因工程改良能否突破这一极限呢？Hal Alper等人提出的所谓转录机器综合基因操 作 战 略 （ G l o b a l t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r yengineering，gTME）让我们看到了新的希望。第48页/共57页酿酒酵母转录机器的定向改造在酿酒酵母中，乙醇生物合成基因与其他看家基因一样，由RNA聚合酶 II 负责转录。RNA聚合酶 II 系统包含 75 种一般转录因子或共激活因子，其中最关键的是TFIID复合物，包含TATA-BOX结合蛋白（TBP，由基因 SPT15 编码）及其及 14 种激活因子（TAFs）。有证据显示，TATA-BOX结合蛋白的突变会改变RNA聚合酶对启动子的特异性识别性质，进而影响众多不同基因的表达谱。这便是转录机器综合基因操作战略的Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2006理论基础。TATA-BOXTBPTAFsTFIID complex第49页/共57页酿酒酵母转录机器的定向改造 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2006利 用 易 错 P C R 技 术 构 建SPT15的突变文库，转入酿酒酵母标准单倍体BY4741株，该单倍体含有