荧光定量PCR原理、应用及Stratagene_Mx3000P介绍

1、Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理及应用原理及应用上海吉泰生物科技有限公司上海吉泰生物科技有限公司Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 内内 容容 提提 纲纲 荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科

2、技有限公司www.Gwww.G 常规核酸定量方法常规核酸定量方法 Southern 杂交杂交 Northern 杂交杂交 原位杂交原位杂交 传统传统 RT-PCR 半定量半定量 PCR存在的问题存在的问题 3灵敏度3准确性3特异性3时间Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 实时荧光定量实时荧光定量PCR 定义定义利用荧光信号对利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控反应的过程进行实时监控 目的目的对起始模板进行定量对起始模板进行定量 优点优点 灵敏灵敏, 重复性重复性, 动态范围宽动态范围

3、宽, 高通量高通量l原理原理 C(t)值与起始模板浓度的对数成反比值与起始模板浓度的对数成反比Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 什么是什么是C(t)C(t)值值C(t)Threshold（域值）域值）Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 值与起始模板的关系值与起始模板的关系Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有

4、限公司www.Gwww.G 为什么要引入为什么要引入C(t)值值CtEndpoints96 replicates of B7 gene molecular beaconGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 1221利用电泳定量利用电泳定量11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold differenceGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 实时荧光定量实时荧

5、光定量Ct 18 and Ct 22, 2(4 Ct shift) = 16 fold differenceGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 如何定量如何定量标标 准准 曲曲 线线 未未 知知 样样 品品 的的 C(t) 值值 定量定量Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有

6、限公司www.Gwww.G 常用的荧光试剂常用的荧光试剂 SYBR Green ITM TaqMan / TaqMan-MGB Molecular Beacons MGB EclipseTM Probes Lux primers ScorpionsTM Amplifluor Q-Zyme Others.dsDNA DetectionTarget-specific DetectionGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G ssDNA = free dye(weak fluorophore)dsD

7、NA =Binds minor groove(intense fluorophore)SYBR Green I (双链双链DNA结合染料结合染料)Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G SYBR Green I DetectionGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G TaqMan 探针探针未结合的探针未结合的探针探针、引物与目的片段结合，探针、引物与目的片段结合，FRET光发射或者以热量形式

8、散失光发射或者以热量形式散失Donor dye (Reporter)Acceptor dye (Quencher)LightEnergy transferTaqTaq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离TaqLight EmissionLightGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G HCV (FAM) RNA virus65bp ampliconHIV-1 (HEX) RNA Virus74bp ampliconHBV (CY5) DNA virus 8

9、1bp ampliconTaqman 三通道实验三通道实验Daniel Candotti - Cambridge, UKGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 荧光定量荧光定量PCR应用应用 特异核酸（基因）定性、定量特异核酸（基因）定性、定量 RNA (RNA (cDNAcDNA) ) 基因表达差异分析基因表达差异分析 基因芯片结果验证基因芯片结果验证 DNADNA 病原体定性与定量病原体定性与定量 GMO (GMO (遗传改良组织遗传改良组织) )检测检测 序列特异性序列特异性 等位基因分

10、型等位基因分型, , SNP SNP 检测检测Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 应用之一：病原体检测与定量应用之一：病原体检测与定量绝对定量（特异基因的拷贝数病原体的多少）绝对定量（特异基因的拷贝数病原体的多少）标准品（如质粒）：梯度稀释标准品（如质粒）：梯度稀释未知样品未知样品阴性对照（阴性对照（NTCNTC）Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 应用之一：病原体检测与定量应用之一：

11、病原体检测与定量Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 应用之一：病原体检测与定量应用之一：病原体检测与定量Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的倍数倍数两种样品：两种样品：CalibratorCalibrator（对照，如正常组织）对照，如正常组织） 与与Sa

12、mpleSample（待测样品）待测样品）两个基因：目的基因与看家基因两个基因：目的基因与看家基因Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Normalizer看家基因看家基因应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析CalibratorSampleGene of Interest目的基因目的基因CtCtCtCt Ct1 Ct2Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 应用之二：基因表达

13、差异分析应用之二：基因表达差异分析基因表达差异基因表达差异2 /2 Ct1 Ct2 Ct1 - Ct2Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析RNA抽提抽提RT定量定量PCRcDNA产物产物系列稀释系列稀释两个基因的扩增效率两个基因的扩增效率Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析Genet

14、imes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 4 fold down3 fold up应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 两条探针分别针对不同等位基因两条探针分别针对不同等位基因应用之三：应用之三：SNPSNP分析分析Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.

15、G 应用之三：应用之三：SNPSNP分析分析FAMFAMTETTETFAMFAMTETTETGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 应用之三：应用之三：SNPSNP分析分析Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 应用之四：应用之四：GMO检测检测目的：检测食品等中转基因成分的含量目的：检测食品等中转基因成分的含量大量的作物被遗传改良来获得一些性状，大量的作物被遗传改良来获得一些性状，如：抗除草

16、剂，抗虫，抗病等如：抗除草剂，抗虫，抗病等Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 应用之四：应用之四：GMO检测检测抗除草剂的转基因大豆抗除草剂的转基因大豆广泛使用的除草剂的作用成分是草甘膦。广泛使用的除草剂的作用成分是草甘膦。草甘膦是草甘膦是EPSPSEPSPS（5-5-烯醇丙酮莽草酸烯醇丙酮莽草酸-3-3-磷酸合成酶磷酸合成酶 ）的竞争抑制物。在草甘膦存在的条件下，）的竞争抑制物。在草甘膦存在的条件下，EPSPSEPSPS的活性被抑制。的活性被抑制。植物被转化了一种耐受草甘膦的植物被转化了

17、一种耐受草甘膦的EPSPSEPSPS基因，获得基因，获得抗性。抗性。Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 检测策略抗性EPSPS基因的量 转基因大豆的量 Lectin基因的量 食品中大豆总量应用之四：应用之四：GMO检测检测EPSPSLectin CtGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 荧光定量荧光定量PCR仪的硬件条件仪的硬件条件激发光源激发光源热循环加热、制冷热循环加热、制冷 样品样

18、品检测设备检测设备Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 荧光定量荧光定量PCR仪应满足的要求仪应满足的要求 光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 能检测的灵敏度与动态检测范围 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪Genetimes

19、TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Stratagenes New Mx3000P!High Performance Personal PriceGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Stratagene 公司成立于公司成立于1984年年,致力于致力于发展生命科学领域的创新产品与科技发展生命科学领域的创新产品与科技. 总部位于美国总部位于美国 La Jolla, California .在欧在欧洲与日本设有

20、分公司洲与日本设有分公司.Stratagene 公司简介公司简介Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P 整体设计整体设计热盖热循环系统石英卤钨灯发射光滤镜轮激发光滤镜轮光纤扫描臂Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P 热循环系统热循环系统 96 孔样品槽孔样品槽 半导体加热制冷半导体加热制冷 温度均一性温度均一性: +/- 0.25C 升降温速率升降温速率: u

21、p to 2.5C/secGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 热循环系统热循环系统 半导体加热制冷半导体加热制冷 resistive and convective heat exchange 独特的温度补偿条，整板温度均独特的温度补偿条，整板温度均一性一性 +/- 0.25C 热盖热盖 反应体积反应体积10-100ulGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P 光路系统光路系统

22、PMT96 well plate石英卤钨灯激发光滤镜轮发射光滤镜轮扫描式检测同轴光纤Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P 光学系统光学系统 石英卤钨灯(350-750nm) 2 个滤镜轮 可选择的滤镜: Filter sets: FAM/SYBR, HEX/JOE/VIC, ROX/Texas Red, Cy5, Alexa350, TET, NED/TAMRA, Cy3 1 PMT（光电倍增管）检测器 350-700nm 发射光检测范围 扫描式检测设计Genetimes T

23、echnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P 扫描系统扫描系统 整板扫描3.5s 滤镜轮旋转进行多通道扫描Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Lasers: 光强高, 波长范围窄；石英卤钨灯石英卤钨灯: 中等光强, 波长范围宽；LED: 光强低, 波长受限制。Halogen LampLaserLEDGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰

24、生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P 可用荧光染料可用荧光染料Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 发射光滤镜发射光滤镜荧光滤镜系统荧光滤镜系统Ex. Filter350 nm750 nm10 nm InterferenceMx3000PGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 四通道设计，避免光谱重叠四通道设计，避免光谱重叠Mx3000P 发射光滤镜轮发射光滤镜轮Geneti

25、mes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 荧光检测系统的发展荧光检测系统的发展PMT光电倍增管光电倍增管冷冷CCDCCDPhotodiodes光电二极管光电二极管Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G PMT (光电倍增管光电倍增管)冷 CCDCCDPhotodiodes光电二极管Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.

26、Gwww.G PMT与与CCD的检测原理的检测原理 hvhve-e-PMTCCDGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G CCD与与PMT检测区别检测区别无边缘效应边缘效应CCDMirrorGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 19.019.520.020.521.021.522.0113253749617385Well numberCtSimultaneous Illumination/De

27、tection20.521.021.522.022.523.023.5113253749617385Well numberCtCCD与与PMT检测结果均一性对比检测结果均一性对比Ct vs. Well number(across plate groupings)Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P均一性实验均一性实验96 well uniformity run. SYBR Green I detection96 wellsMean Ct = 18.1St.Dev. = 0.0

28、5C.V . = 0.3%Ct Range = 0.26 cyclesGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 2-fold serial dilution (20,000 to 1.2 copies hgDNA. -Actin Mol. Beacon)Std. CurveR2 = 0.996Slope = -3.183Amplification Efficiency =106.1% Mx3000PMx3000P的分辨率与灵敏度检测图。的分辨率与灵敏度检测图。Genetimes Technolo

29、gyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 10 x dynamic range, T7 hydrolysis probe, 8 replicates each concentration10 x dynamic range standard curve, Ct range 6-39, Rsq=0.999, Efficiency=98.6% Mx3000PMx3000P检测动态范围检测图（高达十个数量级）。检测动态范围检测图（高达十个数量级）。Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科

30、技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P Multiplex - 4 Color ResultFAMGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G FAMHEXMx3000P Multiplex - 4 Color ResultGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G FAMHEXROXMx3000P 4通道实验结果通道实验结果Genetimes TechnologyGenet

31、imes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G FAMHEXROXCy5Mx3000P Multiplex - 4 Color ResultGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P 4通道标准曲线通道标准曲线 Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 利用利用FullVelocity 技术提高技术提高PCR运行速度运行速度最新的工程聚合酶

32、最新的工程聚合酶 Archaeal (non-Taq) DNA polymerase 同样具有优越的同样具有优越的: 灵敏度 特异性 可重复性Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P 软件软件 易学易用易学易用 各种数据分析方式：自动分析或者各种数据分析方式：自动分析或者手动分析手动分析 支持荧光定量支持荧光定量PCRPCR的多种应用模式的多种应用模式Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.G

33、www.G 多种应用模式多种应用模式Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 软件的结构软件的结构Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G PCR板的设定板的设定Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G PCR程序设定程序设定Genetimes TechnologyGenetimes Technol

34、ogy吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 运行时的状态运行时的状态Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 实时扩增数据实时扩增数据Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 软件自行优化的数据分析软件自行优化的数据分析Adaptive baseline correctionAmplification-based thresholdGenetimes TechnologyG

35、enetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 标标 准准 曲曲 线线Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 相对定量相对定量4 fold down3 fold upGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 基因分型结果显示基因分型结果显示User defined genotypes, color coded populations, and

36、automatic calling on text reportGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G “只读板只读板”实验结果实验结果Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 结果文本显示结果文本显示Text Report or raw data can be exported to Excel or a text fileCustomize reportGenetimes Technolog

37、yGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 多种格式输出结果多种格式输出结果Text ReportExcel spreadsheetPowerPoint presentationAny screen shotGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Brilliant QRT-PCR and QPCR Reagents Master mixes and reagent kits for any fluorescent chemistry

38、 Compatible with sequence-specific probes SYBR Green kitsGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G DNA AmplificationBrilliant SYBR Green QPCR Master Mix Brilliant SYBR Green QPCR Core Reagent KitRNA AmplificationBrilliant SYBR Green QPCR Master Mix, 1-StepBrilliant SYBR

39、Green QPCR ReagentsGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G DNA AmplificationBrilliant QPCR Core Reagent Kit Brilliant Plus Core Reagent KitBrilliant QPCR Master Mix2-step RT-PCRRNA AmplificationBrilliant QRT-PCR Core Reagent Kit, 1 - StepBrilliant QRT-PCR Master Mix Ki

40、t, 1 - StepBrilliant QRT-PCR Plus Core Reagent Kit, 1 - Step1-step RT-PCRBrilliant QRT-PCR Core Reagent Kit, 2 - StepBrilliant QRT-PCR Plus Core Reagent Kit, 2 - StepBrilliant Probe-based QPCR ReagentsGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 2-fold discrimination using

41、the Brilliant SYBR QPCR master mix on the Mx3000P instrumentCt variation 0.5Cts10,000 copies5,000 copiesBrilliant QPCR KitsTarget = Beta actin / Template = Human genomic DNA36 wells of 10,000 copies with a Ct variation of 0.5 Cts and 36 wells of 5,000 copies with Ct variation of 0.5CtsGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 引物探针设计软件引物探针设计软件设计设计SYBR Green 引物引物,