色谱分析方法之一高效液相色谱分析技术实用教案

1、2022-7-2一、高效(o xio)(o xio)液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定(wndng)有机及生化试样的高效分离分析方法。第1页/共17页第一页，共17页。2022-7-2二、流程(lichng)及主要部件1.流程(lichng)第2页/共17页第二页，共17页。2022-7-22.主要主要(zhyo)部件部件(1) 高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用(shyng)粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀

2、等特性第3页/共17页第三页，共17页。2022-7-2(2) 梯度(t d)淋洗装置外梯度(t d): 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度(t d)混合室，混合后进入色谱柱。内梯度: 一台高压泵, 通过比例(bl)调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例(bl)抽入高压泵中混合。第4页/共17页第四页，共17页。2022-7-2(3) 进样装置(zhungzh) 流路中为高压力工作状态， 通常(tngchng)使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：第5页/共17页第五页，共17页。2022-7-2(4) 高效(o xio)分离柱 柱体为直型不锈钢管，内

3、径(ni jn)16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。第6页/共17页第六页，共17页。2022-7-2(5) 高效(o xio)液相色谱检测器 紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9gmL-1，对流量和温度的波动(bdng)不敏感，可用于梯度洗脱。 最常用的检测器。第7页/共17页第七页，共17页。2022-7-2光电二极管阵列(zhn li)检测器 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定(tdng)波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第8页/共17页第八页，共17页。2022-7-2三、影响分离(fnl)(fnl)的因素 在高效

4、液相色谱中, 速率方程中的分子(fnz)扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示： 影响分离(fnl)的主要因素有流动相的流量、性质和极性。第9页/共17页第九页，共17页。2022-7-21. 影响影响(yngxing)分离的因素分离的因素流速流速 流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低(jingd)流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。第10页/共17页第十页，共17页。2022-7-22. 固定固定(gdng)相及分离柱相及分离

5、柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高(t go)柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高(t go)分析速度； 研制高效柱填料是一活跃领域。第11页/共17页第十一页，共17页。2022-7-23. 流动流动(lidng)相及流动相及流动(lidng)相的极性相的极性 （1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为(chn wi)：淋洗液，洗脱剂。 （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固

6、定相的极性，称为(chn wi)正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为(chn wi)反相液液色谱，非极性柱也称为(chn wi)反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 第12页/共17页第十二页，共17页。2022-7-2流动(lidng)相组成 流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度(t d)淋洗。常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第13页/共17页第

7、十三页，共17页。2022-7-2选择流动(lidng)相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声(zoshng)增加。（2）避免流动相与固定(gdng)相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定(gdng)液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定(gdng)相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。第14页/共17页第十四页，共17页。2022-7-2四、 高效(o xio)(o xio)液相色谱法的主要分离类型1. 吸附色谱（液-固

8、吸附色谱） 以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2. 分配(fnpi)色谱（液-液分配(fnpi)色谱）早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。第15页/共17页第十五页，共17页。2022-7-23. 3. 离子交换离子交换(l z jio hun)(l z jio hun)色谱色谱 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种( zhn)离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4. 凝胶色谱（空间排阻色谱） 以凝胶为固定相。凝胶是一种经