第十一章 核酸的物理化学性质

1、第十一章第十一章 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质 一一.核酸的水解核酸的水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。水解切断。DNA和和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，溶液中，RNA几乎可几乎可以完全水解，生成以完全水解，生成2-或或3-磷酸核苷；磷酸核苷；DNA在在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与别，与RNA核糖基上核糖基上2-OH参与作用有很大的参与作用有很大的关系。在关系。在RNA水解时，水解

2、时，2-OH首先进攻磷酸基，首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用下形成水解产物。碱的作用下形成水解产物。酸易水解酸易水解N-糖苷键糖苷键，嘌呤碱基比嘧啶碱，嘌呤碱基比嘧啶碱基易被酸水解，脱氧核糖比核糖的糖苷基易被酸水解，脱氧核糖比核糖的糖苷键易水解，键易水解，DNA的嘌呤碱在的嘌呤碱在pH2以下即以下即脱落而成嘌呤酸。脱落而成嘌呤酸。碱易水解碱易水解磷酸酯键磷酸酯键，RNA在在0.3N碱中即碱中即被水解，被水解，DNA对碱相对稳定。对碱相对稳定。 酶水解酶水解生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解生物体内存在多种核酸水

3、解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。核酸酶的分类核酸酶的分类按底物专一性分：以按底物专一性分：以DNA为底物的为底物的DNA水解酶水解酶（DNases）和以和以RNA为底物的为底物的RNA水解酶（水解酶（RNases）。）。按作用方式分：按作用方式分：核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶和核酸内切酶。 核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3-端或端或5-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中的作用方式刚好和外切酶相

4、反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。按作用键分：水解按作用键分：水解3-磷酸酯键和磷酸酯键和5-磷酸酯键的核酸酶，磷酸酯键的核酸酶，产物分别是产物分别是5-磷酸核苷和磷酸核苷和3-磷酸核苷磷酸核苷 核糖核酸酶举例核糖核酸酶举例牛胰核糖核酸酶（牛胰核糖核酸酶（RNase I）,内切酶，水解嘧内切酶，水解嘧啶啶3-磷酸和其他核苷酸磷酸和其他核苷酸5 -OH形成的酯键，产形成的酯键，产生生3 -磷酸核苷。磷酸核苷。核糖核酸酶核糖核酸酶T1，内切酶，发现于米曲霉，水解内切酶，发现于米曲霉，水解3 -鸟苷酸与其他核酸鸟苷酸与其他核酸5 -OH形成的酯

5、键，形成的酯键，产物为产物为3 -鸟苷酸为末端的寡核苷酸。鸟苷酸为末端的寡核苷酸。脱氧核糖核酸酶举例脱氧核糖核酸酶举例1.牛胰脱氧核糖核酸酶（牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase I），内切酶，水解内切酶，水解DNA 3 -磷酸酯键，产生磷酸酯键，产生5 -磷酸的寡核苷酸，平均长磷酸的寡核苷酸，平均长度为度为4个核苷酸。个核苷酸。2.牛脾脱氧核糖核酸酶（牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase II），内切酶，水解内切酶，水解DNA 5 -磷酸酯键，产生磷酸酯键，产生3 -磷酸的寡核苷酸，平均长磷酸的寡核苷酸，平均长度为度为6个。个。3.限制性内切酶限制性内切酶，可识别特异的碱基序列并水解断开，产，可识别特异

6、的碱基序列并水解断开，产物带物带5 -磷酸基，已发现数千种，是基因工程的重要磷酸基，已发现数千种，是基因工程的重要工具酶。工具酶。N-糖苷酶糖苷酶 水解糖苷键，产物为含氮碱基和无碱基末湍的寡核苷酸水解糖苷键，产物为含氮碱基和无碱基末湍的寡核苷酸 二二.核酸的酸碱性质核酸的酸碱性质两性解离两性解离：DNA无，只有酸解无，只有酸解，碱基被屏蔽碱基被屏蔽（在分子内部形成了氢键）。（在分子内部形成了氢键）。RNA有两性解离，有两性解离，有有pI。核酸的碱基核酸的碱基、核苷核苷、核苷酸均能发生解核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质离，因此核酸是两性电解质碱基的解离碱基的解离：嘧啶和嘌呤环上的：嘧啶和

7、嘌呤环上的N及各取代基及各取代基具有结合和释放质子的能力。具有结合和释放质子的能力。核苷的解离核苷的解离：碱基和核糖具有结合和释放质子：碱基和核糖具有结合和释放质子的能力的能力核酸的解离核酸的解离：磷酸基具有较强的酸性，核酸的：磷酸基具有较强的酸性，核酸的两性解离主要决定于两性解离主要决定于磷酸基和含氮碱基磷酸基和含氮碱基。 三三. .核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤碱在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在光谱，一般在260nm左右有左右有最大吸收峰，可以作为核酸最大吸收峰，可以

8、作为核酸及其组分定性和定量测定的及其组分定性和定量测定的依据。依据。以以A260/A280进行定性、定量进行定性、定量DNA和和RNA溶液中加入溶液中加入溴化溴化乙锭（乙锭（EB），在紫外线下发在紫外线下发出荧光。出荧光。用用A260/A280还可用来表示还可用来表示核酸的纯度：核酸的纯度： 大于大于1.8，DNA很纯；很纯； 大于大于2， RNA很纯。很纯。样品中如含有杂蛋白及苯酚，比值明显样品中如含有杂蛋白及苯酚，比值明显降低降低。对于纯的样品，只要读出对于纯的样品，只要读出260nm的的A值即值即可算出含量。通常以可算出含量。通常以A值为值为1相当于相当于50g/ml 双螺旋双螺旋DNA

9、，或或40 g/ml单链单链DNA（或或RNA），或或20 g/ml寡核苷酸寡核苷酸计算。计算。有时核酸的紫外吸收以有时核酸的紫外吸收以摩尔磷的吸光度摩尔磷的吸光度来表示，来表示，摩尔摩尔磷即相当于摩尔核苷酸磷即相当于摩尔核苷酸。先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数摩尔磷吸光系数(P) 。 (P)=A/cLA为吸收值，为吸收值，c为每升溶液中磷的摩尔数，为每升溶液中磷的摩尔数，L为比色杯内径。为比色杯内径。 c=每升中磷的重量（克）每升中磷的重量（克）W/磷的原子量（磷的原子量（30.98） (P)=30.98 A/WL一般

10、天然一般天然DNA的的(P)为为6 600，RNA为为7 700-7 800。核。核酸的酸的(P)值较所含核苷酸单体的值较所含核苷酸单体的(P)要低要低40%-45%。单链多核苷酸的单链多核苷酸的(P)值比双螺旋结构多核苷酸的值比双螺旋结构多核苷酸的(P)要要高，所以核酸发生变性时，高，所以核酸发生变性时， (P)升高约升高约25%，此现象，此现象称为称为增色效应（增色效应（hyperchromic effect）。复性后复性后(P)又又降低，这现象称降低，这现象称减色效应减色效应(hypochromic effect)。四四. .核酸的变性，复性及杂交核酸的变性，复性及杂交( (一一) )

11、变性变性稳定核酸双螺旋的次级键断裂，空间结构破坏，变稳定核酸双螺旋的次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。成单链结构的过程。核酸的一级结构核酸的一级结构(核苷酸顺序核苷酸顺序)保保持不变。持不变。变性表征变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）外吸收增加（增色效应）变性因素变性因素 pH（11.3或或5.0） 变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛） 低离子强度低离子强度 加热加热 热变性与热变性与TmDNA的变性过程的变性过程是突变性的，它在很窄的温度是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此

12、，通常将紫外吸收的增加量区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称达最大量一半时的温度称熔解温度熔解温度，用，用Tm表示。表示。（或者把加热变性使（或者把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一的双螺旋结构失去一半时的温度称为该半时的温度称为该 DNA的熔点或熔解温度）。的熔点或熔解温度）。一般一般DNA的的Tm值在值在82-95 C之间。之间。DNA的的Tm值大小与下列因素有关：值大小与下列因素有关：（1）DNA的均一性。均质的均一性。均质DNA，如一些病毒的如一些病毒的DNA，人工合成的人工合成的poly d(A-T),poly d(G-C)熔熔解过程发生在一个较小的范围内。

13、异质解过程发生在一个较小的范围内。异质DNA熔熔解的过程发生在一个较宽的范围内。所以解的过程发生在一个较宽的范围内。所以Tm 值可作为衡量值可作为衡量DNA样品均一性的标准。样品均一性的标准。（2）分子中）分子中G和和C的含量。的含量。 G和和C的含量高，的含量高，Tm值高值高。因而测定。因而测定Tm值，可值，可反映反映DNA分子中分子中G, C含量，可通过经验公式计含量，可通过经验公式计算：算：（G+C)%=(Tm -69.3) 2.44（3）介质的离子强度。一般离子强度较低的介）介质的离子强度。一般离子强度较低的介质中，质中，DNA的熔解温度较低，而且溶解温度的的熔解温度较低，而且溶解温度

14、的范围较宽。范围较宽。RNA的变性的变性：RNA也具有螺旋也具有螺旋 线团线团之间的转变。但这种较变不如之间的转变。但这种较变不如DNA明显。明显。变性曲线不陡，变性曲线不陡， Tm值较低。值较低。tRNA具有较具有较多的双螺旋区，所以具有较高的多的双螺旋区，所以具有较高的Tm值，值，变性曲线也较陡。变性曲线也较陡。 （二）复性（二）复性变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为螺旋结构的过程称为复性复性。DNADNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，

15、具有般只能得到部分的恢复，具有减色效应减色效应。将热变性的将热变性的DNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。不可能复性。变性的变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火退火”。 退火温度退火温度Tm25复性影响因素复性影响因素 片段浓度片段浓度/ /片段大小片段大小/ /片段复杂性（重复序列数目）片段复杂性（重复序列数目）/ / 溶液离子强度溶液离子强度将热变性的将热变性的DNA骤然冷却时，骤然冷却时，DNA不可能复不可能复性性DNA的片段越大，复性越慢的片段越大，复性越慢DNA的浓度越大，复性越快的浓度越大，复性越快在一定条件下，复性反应的

16、速度用在一定条件下，复性反应的速度用Cot 1/2来衡来衡量，量，Co为变性为变性DNA复性时的初始浓度，复性时的初始浓度，t为时为时间，间， Cot 表示复性一半时的表示复性一半时的DNA浓度。浓度。两种浓度相同但来源不同的两种浓度相同但来源不同的DNA，复性时间的复性时间的长短与基因组的大小有关长短与基因组的大小有关有很多重复序列的有很多重复序列的DNA复性也快复性也快 （三）核酸的杂交三）核酸的杂交DNA单链与在某些区域有互补序列的异源单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为这样形成的新分子称为杂交杂交D

17、NA分子分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。有重要意义。Southern 杂交（杂交（Southern bolting）Northern 杂交（杂交（Northern bolting）Western 杂交杂交 （Western bolting）核酸的杂交核酸的杂交核酸分子杂交的意义：核酸分子杂交的意义：发现原核生物的基因是连续基因，而真核生物发现原核生物的基因是连续基因，而真核生物的基因是断裂基因。的基因是断裂基因。连续基因连续基因：基因中的：基因中的bp序列能够连续的在成熟序列能够连续的在成熟的蛋白质中找到其相应的的蛋白质中找到其

18、相应的AA，电镜显示这种电镜显示这种基因能够和它的成熟基因能够和它的成熟mRNA形成平滑的杂交分形成平滑的杂交分子。子。断裂基因断裂基因：基因中的：基因中的bp序列能够断续的在成熟序列能够断续的在成熟的蛋白质中找到其相应的的蛋白质中找到其相应的AA，电镜显示这种电镜显示这种基因和它的成熟基因和它的成熟mRNA只能形成带泡的杂交分只能形成带泡的杂交分子。子。发现癌基因的普遍性发现癌基因的普遍性：肿瘤病毒的：肿瘤病毒的RNA能够与能够与人类正常的人类正常的DNA分子形成带泡的杂交分子形成带泡的杂交分子。核酸分子杂交的技术核酸分子杂交的技术Southern Blotting（南印迹）南印迹）：用于钓基因，即用已知：用于钓基因，即用已知的的DNA单链或单链或RNA，钓取未知钓取未知DNA分子中的基因，方分子中的基因，方法如下：法如下：未知的未知的DNA -DNA限制性内切酶限制性内切酶 DNA片段片段 琼脂糖电泳分离琼脂糖电泳分离 碱液变性碱液变性 影印在硝酸纤维薄影印在硝酸纤维薄膜上膜上 与放射性标记的已知与放射性标记的已知DNA单链或单链或RNA杂交杂交 放射自显影放射自显影Northern Blotting（北印迹）北印迹）：用已知的：用已知的D