第8讲 蛋白芯片技

1、第8讲 生物芯片技术7/2/20221一、概述7/2/20222一根本概念与原理蛋白质芯片:以蛋白质分子作为配基，将其固定在固相载体的外表所形成的蛋白质微阵列免疫芯片immunochip或微陈列microarray: 一种特殊的蛋白质芯片，是将抗原抗体结合反响的特异性与电子芯片高密度集成原理相结合形成的高通量生物检测技术主要用于高通量激素测定、发情鉴定、妊娠诊断、生殖疾病监控等 7/2/20223免疫芯片原理将能和不同抗原特异性结合的多种抗体抗体芯片或将能和不同抗体特异性结合的多种抗原蛋白芯片高密度地固定到玻片或其他载体上，或使待测样品通过芯片外表，经过洗脱把非特异性结合的蛋白洗掉，从而对特异

2、性结合在上面的抗原或抗体进行检测芯片上固定的蛋白质是特异性的抗体或抗原、半抗原，将其配体-抗原或抗体加上各种标记，通过特异性免疫反响即可实现基于芯片的免疫检测7/2/20224二开展历史 Ekins et al，1989，微阵列的概念Ekins 等1990，包绕分析物型免疫分析原理ambientanalyte immunoassay：免疫检测依赖分析物对固相抗体占有率。因为固相抗体是“痕量的，所以分析物中只有极少局部被捕获并检测，分析物总浓度未被破坏，所以该小局部即反映了样品分析物浓度。每个微点小于100 um2，约含有106108个捕获抗体分子Ekins和Chu1991：将非同位素标记物和由

3、单克隆抗体构建的非竞争反响模式相结合，建立的免疫检测方法，可同步检测成千上万生物样品的微阵列多元免疫检测系统也称“免疫微阵列 Silzel 等1998：质量敏感型多元微阵列免疫分析原理，通过使每个微点所含抗体最大化，从而在样品中捕获分析物的实质量进行检测，可以得到更好的信噪比SNR。每个微点约为30 000m2，约含有1010个捕获抗体分子7/2/20225二开展历史MacBeath2000：成功制备了10 800点的蛋白微阵列，并研究了这种微阵列蛋白的多项生物学功能，包括蛋白与蛋白的相互作用，蛋白酶底物识别及小分子蛋白靶鉴定等，认为应用蛋白微阵列进行高通量表达蛋白筛选和功能鉴定切实可行 Hu

4、ang 等2001 ：实现了基于抗体微阵列的24 种细胞因子的检测张庆峰等2004：建立了用于检测雌二醇的免疫芯片技术，检测的灵敏度到达ng/ml水平 7/2/20226二开展历史Huang 等2004：用抗体芯片技术大量检测并分析来自137 名妇科肿瘤患者和20名健康者中5种血管生成因子angiogenin、白介素-8IL-8、血管内皮生长因子VEGF、血小板衍生因子PDGF和表皮生长因子EGF 的蛋白表达水平De Ceuninck 等2004：利用抗体芯片技术检测关节炎患者在不同的条件下软骨细胞中多种蛋白的表达差异，鉴定出局部未曾发现的软骨细胞的分泌性蛋白，包括某些生长因子及血管生成因子、

5、血小板生成素、巨噬细胞炎症蛋白3MIP3、IL-12 和IL-167/2/20227二开展历史国外目前有20 余家公司正在研究基于免疫芯片技术的产品，主要涉及的领域有：过敏源筛查，自身免疫病，肿瘤标志物，心血管疾病标志物，细胞因子，内分泌和激素，组织分型，感染性疾病检测，激酶和磷酸化，金属蛋白酶类美国有一家Rules-Based Medicine公司开发出一种有163个血清学指标的试剂、几乎涵盖了临床常用的诊断和科研血清学指标。另外还开发出一种有88 个老鼠血清学指标的试剂7/2/20228三分类主要根据载体形状、抗原抗体作用原理、检测体系等进行分类7/2/20229根据载体形状分类平板芯片微

6、球芯片纳米陈列免疫芯片等7/2/202210根据抗原抗体反响体系形态分类固相芯片液相芯片7/2/202211根据抗原与抗体作用原理分类间接免疫芯片双抗体夹心法免疫芯片竞争法免疫芯片免疫-PCR芯片7/2/202212根据检测体系分类无探针标记检测法：即利用质谱等技术直接分析靶蛋白的分子量和相对含量，如外表增强激光解吸离子化技术、外表等离子体共振检测技术、光学蛋白质芯片、原子力显微镜技术等。这类方法由于不需要标记蛋白，摆脱了传统的酶标记和荧光标记会改变蛋白质本身性质的缺点，免去了二抗的桥联作用，减少了实验操作步骤，防止了交叉污染，降低了由于实验操作带来的实验误差，提高了检测速度探针标记检测法：即

7、使用同位素或荧光等物质标记探针，通过相应的仪器，如放射显像仪、电荷偶合装置CCD芯片扫描仪或激光共聚焦芯片扫描仪对信号进行检测，从而获得相关的生物学信息，如酶标记免疫芯片、放射性同位素标记免疫芯片、荧光标记免疫芯片、金标记免疫芯片以及生物素-亲和素标记免疫芯片等7/2/202213二、免疫芯片技术操作流程与本卷须知7/2/202214一操作流程微阵列免疫芯片制备技术的核心是抗体或抗原的固相化技术和微型化技术。因抗体和多数抗原为蛋白质，其固相化方法异于基因芯片的DNA 固定方法，而类似于常规固相免疫分析技术中的固化方法免疫芯片上微米尺度的探针微点阵列那么要依赖微点阵印刷仪器来完成，印刷方式有喷样

8、和点样等7/2/2022151、载体选择与质量要求用于芯片制作的载体是可连接、吸附或包埋各种生物分子使其以不溶性状态行使生物功能的固体材料生物芯片所用载体一般为固体片状或薄膜状目前采用玻璃片制作生物芯片来源方便其外表可用N，N-二乙氧基氨丙基三乙氧硅烷作外表处理，能很好地偶联核酸、酶、抗体抗原、蛋白多肽等生物分子大多数生物芯片均采用发光检测的方法，不管透射光还是反射光玻璃片都适用 7/2/202216载体必须符合的条件具有良好光学性质，能适应透射和反射光的测量外表具有可及时进行化学反响的活性基团，以便与生物分子进行偶联可使单位面积载体上结合的生物分子到达最正确容量惰性并具有足够的稳定性。惰性是

9、指载体其他性能或特异吸附不应该干扰生物分子的功能；稳定性是指芯片在进行分子结合时，可能遭受一定压力或酸、碱条件而不发生变化具有良好的生物兼容性7/2/2022172、待测物质量要求特异性：尽可能高。根据固定在芯片上物质的不同应采取相应的标准：微生物：要求有良好的抗原性，且未发生任何抗原变异；通过其他方法如基因工程表达或全程制备获得：要求有较好的抗原表位，相似的蛋白二级结构；抗体一般为单克隆抗体：一是不应发生所谓的“位点漏检，二是必须仔细地检查单克隆抗体的各种特性，如在冷冻、酸性和碱性环境下的稳定性、亲和力和作用位点等基因片段或寡核苷酸：序列与被检样品的配对百分率尽可能高。一个碱基的突变，便可在

10、基因杂交中显示出来，反过来一个碱基的全盛错误，在诊断时将产生误判7/2/2022182、待测物质量要求纯度：一般一次反响只需3ug mRNA或300g RNA。打印针每次打印在芯片上的溶液仅为510-3ul，沉积的直径约为50150um，而芯片的分辨率可以到达500um。如此微量的反响体积和反响物，给生物活性物质的纯度提出了十分高的要求，只有纯的物质，才能保证在这样的体积下有良好的反响7/2/2022192、待测物质量要求稳定性：固定的活性物质经过预处理后必须具备良好的稳定性。活性物质与载体的偶联、在特定温度下的贮存时间、与待检样本的结合过程以及经酸碱的处理等都可能对其活性产生影响。细菌和病毒

11、除非发生变异，一般抗原性是相对稳定的；基因工程表达的或多肽合成的抗原或抗体，与天然的相比一般稳定性较差，如前列腺素F2、GnRH等良好的偶联性或吸附性：能否与载体紧密的吸附是芯片制作和长期保存的关键7/2/2022203. 抗体或抗体库抗体是制备免疫芯片必不可少的原材料，另外抗体也是制备和纯化抗原常用的亲和层析材料。如果是采用双抗体夹心法更是如此。大局部抗体可以采购获得。采购不到的抗体可以利用抗原免疫兔子制备多抗，或者免疫小鼠利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。由于免疫芯片的原理仍是抗原抗体反响，所以样本一般不需进行处理，考虑到芯片检定用量极少，所以反响前要进行适当稀释，并应保证样本不被污染。此外，

12、对第二抗体的要求，一是特异性强，二是纯度高。 7/2/2022214. 抗体或抗原固定化用人工或全自动微阵列点样制备系统，将待检的抗体或抗原固化在一片面积不大的固相载体或微球上，且保存其抗原结合能力，制成抗体芯片膜，芯片上每个抗体都是并列双点，以增加结果的可靠性常用的固相载体材料有载玻片、尼龙膜、硅片，金属片或微球等载体的活化：活化条件和根本要求与ELISA方法中抗原或抗体固相化类似，可参考?酶免疫测定技术?一书点样：主要方法有接触式点样、喷墨式点样、分子印章DNA合成和原位合成等载玻片的外表平整度和活化的好坏是影响点样质量的重要因素;点样要圆，点的直径大小必须一致；点与点之间距离必须相等，不

13、宜间隔过大或过小7/2/2022225. 抗原抗体反响芯片膜与蛋白质样品一起孵育，在孵育过程中根据抗体可特异识别和结合蛋白的特性，芯片膜识别并捕捉抗原，经过洗脱将未能与芯片上的抗体识别结合的成分洗去可以在芯片上设计一些微细的结构，使不同抗原抗体系统的混合、浓缩，别离、反响以及免疫复合物与未反响的游离标记物的别离，清洗等反响操作集中在同一张芯片中进行芯片扫描仪有极高的灵敏度和分辨率，芯片上很小的尘埃或杂质污染都会引起非常明显的背景和噪音，所以芯片制作最好在洁净台或洁净间中操作，所有使用的溶剂、溶液和试剂的纯度必须符合规定；所用溶剂、溶液应过滤或除菌；严格按照芯片制作和清洁的规程操作7/2/202

14、2236. 检测分析芯片完成杂交或抗原抗体反响及清洗后，尽可能立即扫描测定，以防止荧光标记靶分子的降解杂交后的芯片应防止长时间暴露在强光下，以防光漂白，影响测定结果反响结果用同位素、荧光、生物化学发光、酶的成色反响等显示，然后用扫描仪或CCD 摄像技术进行记录，通过计算机软件分析，综合成可读的生物样品信息值得注意的是，抗体芯片检测的结果不是蛋白的绝对含量，而是目的蛋白的相对丰度为了提高芯片测定的稳定性，降低背景，提高灵敏度，生物芯片一般采用激发波长较长、斯托克斯位移较大的荧光染料标记7/2/2022247. 数据处理扫描所得图象常用芯片数据处理系统进行处理。该系统包括图象分析、数据提取、数据统

15、计学分析和生物学分析等内容较常用的分析软件有GenePix、ImaGen和GeneChip Workstation等。在数据分析和处理中，图象背景确定、样本斑点的识别及数据的提取最为重要，所以应提高这些步骤的准确性。7/2/2022257. 数据处理本卷须知扫描所得的图象既是样本点光密度值的反响，又是样本信号和芯片背景信号的总和，所以在提取各样本点数据前必须将背景扣除斑点识别是数据分析和处理的重要环节，最常用的识别方法是在图象中选择识别的区域，输入芯片阵列的行数和列数，计算机自动生成一个网格框，套在芯片图象上，使每个网格内包括一个样本点，但对好些不规那么的阵列应进行人工调整套框后，计算机便在框

16、内设置一个圆，圆内的信号就是样本的信号。这些信号就是样本的像素光密度值，此值的大小与被检样本的含量成正比7/2/202226二操作本卷须知确保预处理后基片的高活性和均匀性，保证后续固化反响的高效，并防止微阵列不同区域的差异性。主要解决途径是选择适宜的活化试剂和预处理方案确保抗体抗原在固相化过程中始终处于水溶性状态，以免因三维结构被破坏而失去活性。解决方法:在固化缓冲液中参加放蒸发剂，并在较高的湿度环境下进行制备操作，以防止样品溶液的蒸发，提高固化转移效率确保所有剩余活性基团完全被封闭，防止所使用封闭试剂带来新的活性位点，以降低非特异性，提高信噪比。而选用匹配的封闭试剂是解决该问题的关键所在，目

17、前各种类型的封闭试剂已有商品出售7/2/2022277/2/202228三、免疫芯片存在的问题与改进措施 7/2/2022291. 抗体制备中存在的问题及改进目前新蛋白发现率远超过当前传统方法制备抗体的需求。传统的杂交瘤细胞技术研制单克隆抗体时间长，制约了抗体阵列密度的要求噬菌体抗体库技术能同时有效地处理大量的分子，且抗体分子可不经过动物的阴性选择，能从任一种属获得少有的专一性抗体，并提高其亲和力 7/2/2022302. 抗体特异性的问题及改进用11 个多克隆或单克隆抗体对大约5 000 种放在载玻片上不同的酵母蛋白质进行筛选，发现抗体除了识别其同源的蛋白质外，还不同程度地与其他酵母蛋白质发

18、生交叉反响为了解决这一问题，可采用芯片酶联免疫吸附法，即用芯片上的捕获抗体结合目标蛋白，再用生物素化的另一抗体在不同抗原表位识别同一目标蛋白7/2/2022313. 抗体芯片制作中存在的问题及改进如何不破坏抗体功能而到达最正确吸附?保持固定在基片上的抗体折叠结构的完整并且不失活?利用活性离子蚀刻法将抗体点在聚合物基质外表，扫描电镜显示合成的外表亲水性增强，傅立叶变换红外线光谱法显示，经化学修饰的基片更利于抗体的固定 7/2/2022323. 抗体芯片制作中存在的问题及改进目前常用的芯片片基主要是尼龙膜和各种方法处理过的玻璃载玻片尼龙膜因荧光背景的问题无法克服，其结果只能采用非荧光法显示，如同位

19、素、胶体金等，经处理过的玻璃片性能较好，但因本钱较高，先期投资大，难以开展和推广与生物芯片相配套的、用于显示结果的试剂，用于生物芯片检测分析的仪器本钱高，风险大芯片的封装储存也是应该值得注意的问题 7/2/2022333. 抗体芯片制作中存在的问题及改进应将生物大分子的固相化、亲和层析、过滤、浓缩等多项高新技术有机结合，将标本的制备、抗原抗体的别离、浓缩与检测技术融为一体，实现抗原抗体的别离、浓缩、混合、反响以及免疫复合物与未反响的游离物和标记物的别离等操作的一体化，提高检测的灵敏度，免疫芯片应该进一步同其他技术结合，以便更好地发挥优势比方，与噬菌体抗体库技术结合，在一张芯片合成更大数量的抗体

20、，与多肽技术结合，用于药物的筛选，抗原表位确实定，以及蛋白质功能的测定等方面 7/2/2022344. 抗体芯片结果检测中存在的问题检测结果是目的蛋白的相对丰度抗体芯片数据的正确使用和解释需要有一个适宜的标准，这方面尚无系统研究Hamelinck 等2005在人血清样品中确定了抗体芯片蛋白表达数据的最适标准，通过对重复性、准确性和数据的动态性进行比较，证明多个参数分析比单个参数测量具有更高的准确性，也增加了对信号检测的灵敏性 7/2/202235四、几种免疫芯片简介7/2/202236一纳米阵列免疫芯片随着芯片微型化技术的开展，微点的尺度进一步缩小至纳米尺度，出现了纳米阵列nanoarray免

21、疫芯片纳米点阵应用原子力显微镜Atom Force Microscopy，AFM的针尖制作，纳点nanospot直径大小一般约100350um，仅为微米阵列中微点尺度的1/1000 左右。其检测手段仍然是利用AFM，它可根据针尖与捕获探针如抗体之间的作用力得到探针分子的纳米级高度当靶物质如抗原与捕获探针结合时，其高度会发生变化，这样即可定性检测抗体抗原的结合，又可经统计处理后，得到两者结合反响的定量结果7/2/202237一纳米阵列免疫芯片纳米免疫芯片不仅微型化程度高，而且检测程序无需进行分子标记，可直接实现反响复合物的测定，与外表等离子体共振检测方法有异曲同工之妙。2002 年，美国利用AF

22、M制作了以免疫球蛋白为捕获探针的纳米阵列免疫芯片，并验证其可与抗免疫球蛋白结合反响国内目前可以使用AFM 制备纳点直径约50 纳米的点阵，并鉴定了局部性能指标。当然需要指出的是，探针点并非越小越好，当点尺度小到一定程度时，因每点所含捕获分子数量过少，检测体系将表现出较大的差异性，从而失去统计学意义 7/2/202238二液态芯片liquidchip该仪器在我国进口注册时被称为“多功能流式点阵仪。该技术的核心是将微小的乳胶颗粒用荧光染色的方法进行编码，每种颜色的微粒或称为荧光编码微粒代表一种检测标志物。应用时，将针对不同检测物的彩色编码微粒混合后再参加微量标本，在悬液中靶分子与微粒进行特异性地结

23、合，最后用激光流式仪判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为免疫反响是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以一个微量液态反响体系中同时检测100个指标 7/2/202239液态芯片优势高效或高通量，因为许多颜色的乳胶颗粒可以放在同一个反响体系内，所以一次可同时检测多种100种指标检测灵敏，每个乳胶带粒上都以共价结合的方式包被上许多抗原、抗体或核酸分子DNA芯片。因其参与反响的分子多，产生的信号就强，加上使用荧光检测，所以敏感性大大高于现有的诊断方法，也高于玻璃或膜芯片。据报道，用该平台检测IL-8时，最低检出限可达0. 01pg7/2/202240液态芯片优势检测速度快：杂交或免疫反响在悬

24、浮的液相中进行，反响需要时间短；杂交后不用清洗就可以直接读数，所以检测效率大大高于固相杂交所用时间从几小时缩短到十几分钟重复性好。液态芯片抗原抗体反响发生在均质液体中，结果稳定，重复性好。另外，每个指标在一个反响体系中有10005000 颗相同的微粒。检测时，抽取其中的100500颗读数，最终的数据是取其均值，这样已经把误差减到最小，相比固相芯片每个指标只有12 个数据，其数据的可靠性就会差很多 7/2/202241三外表增强激光解吸/离子化芯片外表增强激光解吸离子化技术surface enhanced laser desorption/ionization，SELDI先选择性地从待测生物样品

25、中捕获配体，将其结合在芯片的固相基质外表，再用激光使得蛋白质与芯片外表解吸为离子，然后通过质谱、亲和色谱-质谱等方法进行定性分析7/2/202242四外表等离子体共振检测芯片surface plasmon resonance，SPR无探针标记的检测方法利用外表等离子体共振现象检测传感器外表介质的折射率变化，而这一变化又与传感片外表结合的生物大分子的量成正比，溶液中的分子不会干扰，因此非常特异、敏感 目前，SPR 应用于蛋白质芯片上的困难是不能在很短时间内测量成千上万的蛋白质斑点，这一技术还没有建立蛋白质定量的尺度 7/2/202243五同位素标记检测芯片存在着放射线对人体健康的危害、标记探针废物的处理等问题，因而现在同位素标记已很少用于蛋白质芯片的标记32P 能够同时标记蛋白质、DNA和RNA，并使它们点样在同一个微阵列上，从而使研究蛋白质和蛋白质、蛋白质和DNA、蛋白质和RNA、蛋白质和配体的相互作用成为可能优势在于能够完全激化样本中的蛋白质、量化阵列中的蛋白质或生物分子7/2/202244六荧光标记检测芯片因其敏感性较高，已成为目前使用最多的一种标记方法需注意的是荧光素的淬灭和漂白，后者将减少芯片的的信号强度。因为Cy3 和Cy5 染料和其他荧光染料很少发生相互作用，以及它们