生物大分子谱学原理及应用

1、生物大分子谱学原理及生物大分子谱学原理及应用应用陆永明磬苑校区理工C楼B501结构结构功能功能决定调控u 荧光光谱u 圆二色谱u 紫外-可见光谱u 红外光谱u 核磁共振波谱u 质谱 第一章第一章核磁共振及其在生命科学核磁共振及其在生命科学中的应用中的应用 自1945年观察到凝聚态物质的NMR现象之后,经过60多年的发展,NMR的研究领域和应用范围已经从物理学延伸到化学、生物学、医学、材料科学、信息学等几乎所有自然科学领域。 先后有5次诺贝尔奖授予了核磁共振研究工作者,其中物理学奖两次(Rabi,1944年;Bloch和Purcell,1952年),化学奖两次(Ernst, 1991年; W t

2、hrich等, 2002年),生理和医学奖一次(Lauterbur和Mansfield, 2003年)。蛋白质数据库(PDB)收录的生物大分子结构中,用X射线晶体学、核磁共振波谱学(NMR)和电子显微学(EM)方法测定的结构，2010.09一一. 核磁共振波谱学的基本原理核磁共振波谱学的基本原理核自旋（核自旋（spin)自旋角动量自旋角动量 自旋角动量自旋角动量 大小大小原子核、原子核、 质子、中子数质子、中子数 方向方向自旋轴自旋轴I(1)2ihJJI I I0I 自旋磁矩自旋磁矩 原子核自旋运动产生的微观磁场原子核自旋运动产生的微观磁场 磁旋比，磁矩与角动量之比（可查表）磁旋比，磁矩与角动

3、量之比（可查表） 约化普朗克常数约化普朗克常数 sJ 34100545726. 1I奇偶规则： 如果上述各对参数均为偶数时，I0，叫“偶偶无NMR”。0I 质量数A原子序数只要二者不同时为偶数，0I 质子数Z中子数（或质量数）不同时为偶数时，或质量数A质子数Z中子数NI例子偶数偶数偶数012C6 16O8 32S16 4Ne2 20Ne10奇数偶数奇数1/2,，3/2，5/21H0 3He2 13C6 17O8奇数奇数偶数1/2，3/2，5/231P15 1H1 11B5 15N7 19F9偶数奇数奇数1,2,32H1（2D） 10B5 14N7自然界共有约一百多种NMR核。number of

4、 half-integer quadrupolar nuclei : 77spin-3/2: 29 (e.g., 7Li,11B,23Na,39K,87Rb)spin-5/2: 22 (e.g., 27Al, 17O, 55Mn)spin-7/2: 18spin-9/2: 8nI=1/2的核是球对称的，无电四极矩，对NMR特别重要，容易得到高分辨NMR谱和高质量的NMR图像。如1H，13C，19F，31P，3He，129Xe等等。nI1/2的核是椭球形的，有电四极矩，因为电四极矩与电场梯度相互作用相当强，对NMR干扰相当大，从而使NMR信号观察要困难得多。如23Na自旋I3/2，对人体成像也是

5、常用的核。 如果将有自旋磁极的原子核置放于外加磁场中，原子核一方面绕其自旋轴旋转，另一方面自旋轴又与外加磁场保持一定夹角进动，称为拉莫尔（Larmor）进动。B0核磁共振的产生核磁共振的产生?取向与外加磁场取向与外加磁场相反相反自旋核自旋核2I+1种取向种取向外加磁场外加磁场H核核m=-1/2m= 1/2B0E2I+1种种能量状态能量状态取向与外加磁场取向与外加磁场一致一致02BhE电磁辐射电磁辐射NS外加磁场外加磁场中的中的H核核Em=1/2m= -1/2E核自旋核自旋能级跃迁能级跃迁E=hv能级差能级差电磁辐射能量电磁辐射能量hBh0202BB0=2.3487T： (1H)=100MHzB

6、0=9.3948T： (1H)=400MHz二二. 核磁共振波谱学的基本参数核磁共振波谱学的基本参数1H NMR13C NMR( (一一) )、化学位移、化学位移 实际化合物中的核（例如1H核），常与其它原子（如C、O、N等）键合，导致不同化合物或基团中相应核的化学环境不同，则磁环境相异。同时核外电子或键合电子倾向于在垂直外加磁场H0的平面内作圆周运动，从而产生一比例于H0的对抗性小磁场，称为屏蔽常数。此时 同一种核在分子中随观测核所在的化学环境改变，其共振频率发生改变，将这种改变称为化学位移。 同一种原子核，由于旋磁比相同，因而在相同外磁场下只应有一个共振频率。0012H 因为化学位移的大小

7、与磁场强度成正比，为了避免化学位移值随测定磁场的不同而变化，实际工作中常用一种与磁场强度无关的，无量纲的值，来表示化学位移的大小。实际工作中测量的都是相对的化学位移，即以某一参考物的谱线为标准，最常用的参考物是四甲基硅(CH3)4Si（简称TMS） 。 高场低频，低场高频。其实这是对于两种不同的扫描方式而言的，不要混淆。 决定化合物中某核的化学位移的主要因素为该核及近邻核的轨道混合状态、电子密度及立体化学。除了结构因素外，还与测定条件有关：（1）温度效应；（2）溶剂效应（1H核13C核）。 化学位移范围： 1H在010ppm， 13C在0200ppm 。6010refsamHHppmH6010

8、samrefppm1. 1. 影响化学位移的因素影响化学位移的因素 决定化学位移的是观测核外的电子屏蔽常数 ，理论表达式： 式中： d 为反磁性屏蔽项，对1H核为主要项，因为s电子存在。它总是与外磁场方向相反，形成一个次级磁场。 p为顺磁性屏蔽项，对13C核为主要项，因p电子存在。这种化学键限制了核外电子在外场作用下的运动。 为其它附加因素形成的屏蔽，例如远程屏蔽，具各向异性。dp2 2、影响化学位移的结构因素、影响化学位移的结构因素局部逆磁作用局部逆磁作用局部顺磁作用局部顺磁作用邻近基团的磁各向异性邻近基团的磁各向异性杂化键不同的影响杂化键不同的影响氢键氢键溶剂作用溶剂作用诱导效应诱导效应共

9、轭效应共轭效应环流效应环流效应交换反应交换反应（1 1）局部逆磁作用）局部逆磁作用： s电子对核的屏蔽。若电子密度增加，d增加，屏蔽增加，引起高场位移；若减少电子密度，d减少，屏蔽减少，引起低场位移。 诱导效应：是通过成键电子传递，随着相连原子或基团的电负性增加，随着距离增加。通常在相隔3个以上的键后其影响可忽略不计。ClCH2CH3共轭效应：在具有多重键或共轭多重键的分子体系中，由于电子的转移,导致某基团电子密度和磁屏蔽的改变。苯环上的H被取代后明显。OCH36.817.116.867.27NO28.257.457.66CH2=CH2C=CC=COCOCH3H 7.18H 6.204.74

10、H4.43 HCOOCH36.38 H5.82 H5.28（2 2）局部顺磁效应）局部顺磁效应：当分子中具有不对称的电子云分布时，外加磁场引起激发态和基态波函数之间的混合，导致去屏蔽作用产生。一般s电子的电子云分布具有球对称性，没有这种作用，局部顺磁屏蔽项p为零。诱导磁力线环流电子(3)邻近基团的磁各向异性邻近基团的磁各向异性 杂化键不同的影响： 单键，sp3杂化 双键，sp2杂化 叁键，sp杂化 各向异性效应：邻近基团呈磁性各向异性屏蔽，随观测核所处位置而不同。CCCCCC增大，s电子成分增加，电子云密度减少。 乙炔分子HCCH乙炔质子位于正屏蔽区，因此其共振峰出现在高场区( =1.8ppm

11、) 0H环流电子诱导磁力线醛基质子位于去屏蔽区，加上由于羰基电负性引起的去屏蔽效应因此其共振峰出现在低场位置(9.2-10.5 ppm) 环流效应环流效应：由于苯环电子的离域性，在垂直于苯环平面的外磁场H0的作用下， 电子便沿着苯环碳链流动，形成环电流，从而产生方向与H0的相反感应磁场。芳烃质子的 = 7.30ppm烯烃质子的 = 5.25ppm0H环流电子诱导磁力线HHHHbHHHHHHHaHHHHHHH单键的屏蔽作用单键的屏蔽作用双键的屏蔽作用 (4)(4)氢键的影响氢键的影响 对质子化学位移的影响不能简单予以解释。当H和Y形成氢键X-HY时，一方面的存在使X-H键的电子云受到畸变，使质子

12、去屏蔽，化学位移增加。另一方面，给体原子或基团的磁各向异性可能使质子受到屏蔽，化学位移减少。其中去屏蔽作用是主要的，所以观测到的是氢键形成低场位移。 (5) (5)溶剂效应溶剂效应 远程作用。由于溶剂与溶质分子间的相互作用，使得在不同溶剂下的溶质分子的化学位移不同。 (6) (6)交换反应的影响交换反应的影响 交换反应，使得H不固定。(ppm)1,1,2-三氯乙烷的三氯乙烷的HNMR1、自旋偶合、自旋偶合(spin-spin coupling)机理机理( (二二) )、自旋偶合与裂分、自旋偶合与裂分NSNSNSBB0010010010010Ha的实际谱图的实际谱图(1). 偶合机理偶合机理以以

13、1,1,2- 三氯乙烷三氯乙烷为例说明：为例说明：ClCCClClHbHaHaHb对对Ha的影响的影响JabNS010ClCCClClHbHaHaHa 对对Hb的影响的影响010NS010NSBB0NSNS010B自旋偶合：自旋偶合：相邻质子间的自旋相互作用相邻质子间的自旋相互作用自旋裂分：自旋裂分：自旋偶合引起的共振吸收峰分裂现象自旋偶合引起的共振吸收峰分裂现象Hb的实际谱图的实际谱图010Jab(2). n +1 规则规则 比较大量化合物的比较大量化合物的NMR裂分峰的数量裂分峰的数量裂分峰数量裂分峰数量n+1邻近质子的数目邻近质子的数目不计活泼氢不计活泼氢裂分峰强度裂分峰强度符合二项式符

14、合二项式(a+b)n的系数的系数1:11:2:11:3:3:11:4:6:4:1注注此规则仅此规则仅适用于适用于简单偶合简单偶合(3). 偶合常数偶合常数(coupling constant) 偶合产生的共振吸收峰间的频率差。偶合产生的共振吸收峰间的频率差。 J，HzJ值仅与偶合系统有关值仅与偶合系统有关与外加磁场强与外加磁场强度无关度无关|J |值通常随偶合核值通常随偶合核间距离增大而减小间距离增大而减小同碳偶合同碳偶合2J或或J同同通常不裂分通常不裂分邻碳偶合邻碳偶合3J或或J邻邻H谱主要谱主要偶合方式偶合方式远程偶合远程偶合(4). 核的等价性核的等价性 (1) 化学等价核：化学等价核：

15、分子中化学环境完全相同，化分子中化学环境完全相同，化学位移完全相同的一组核。（化学全同核）学位移完全相同的一组核。（化学全同核） CH3CH3 CH3CH2OH (2) 磁等价核：磁等价核：化学等价且对其它核的偶合常数化学等价且对其它核的偶合常数都相等的一组核。（磁全同核）都相等的一组核。（磁全同核）CH3CH2OHCH32、常见的自旋偶合系统常见的自旋偶合系统(1). 核磁共振氢谱谱图分类核磁共振氢谱谱图分类 根据根据其复杂程度其复杂程度一级一级谱图谱图(First order spectra) 特征特征：两组质子间两组质子间 J ;偶合峰裂分偶合峰裂分符合符合n+1规律规律 ; 由由谱图可

16、读出谱图可读出和和J 二二级谱图级谱图(Second order spectra) Dn /J 6，谱图较复杂，谱图较复杂(2). 一级谱图中常见的自旋偶合系统一级谱图中常见的自旋偶合系统 符号说明：符号说明：A，M，X表示具有不同化学位表示具有不同化学位移的偶合核移的偶合核 (1) AX系统系统 两组两重峰，此系统较少见，例如：两组两重峰，此系统较少见，例如：(E) -C6H5CH=CHCOOH Cl2CHCH(OEt2)(2) AX2系统系统 两组峰，一组两重峰，一组三重峰两组峰，一组两重峰，一组三重峰 例如：例如： 1,1,2-三氯乙烷三氯乙烷 Cl2CH-CH2Cl1,1,2-三氯乙烷

17、三氯乙烷 CHCl2-CH2Cl 的的 HNMR 谱谱 (3) AX3系统系统 两组峰，一组两重峰，一组四重峰两组峰，一组两重峰，一组四重峰 例如：例如： 2-氯丙酸的氯丙酸的 HNMR谱谱 CH3CHClCOOH (4) A2X2系统系统 两组三重峰两组三重峰 例如：例如： CH3COO-CH2-CH2-ph 的的 HNMR 谱谱乙酸苯乙酯乙酸苯乙酯 phenethyl acetate (5) A2X3系统系统 两组峰：一组三重峰，一组四重峰两组峰：一组三重峰，一组四重峰 例如：例如：氯乙烷的氯乙烷的 HNMR 谱谱 CH3CH2Cl (6) AX6系统系统 两组峰：一组两重峰，一组七重峰两

18、组峰：一组两重峰，一组七重峰 例如：例如： 2-苯丙烷（异丙苯）的苯丙烷（异丙苯）的 HNMR 谱谱 C6H5CH(CH3)2(7) A3M2X2系统系统 三组峰：三组峰：3、6、3重峰重峰 例如：例如：硝基丙烷硝基丙烷(CH3CH2CH2NO2)的的HNMR谱谱1-nitropropane (8) AMX系统系统 常见的偶合系统，常见的偶合系统，NMR视具体情况而定视具体情况而定 例如：例如： HCCCH=CHOCH3的的 HNMR 谱谱一些氨基酸的自旋系统一些氨基酸的自旋系统AMXAMXAMXHIS(组氨酸) in D2O AMX+AX( (三三) )、峰面积和积分、峰面积和积分NMR峰强

19、度峰强度(面积，即积分高度面积，即积分高度)与质子数与质子数量成正比。例如：量成正比。例如： CH3CH2CH2Cl三三. 高级高级核磁共振方法核磁共振方法(一一)、采用高频、采用高频(高场高场)NMR仪器仪器 高频高频NMR可使可使v 增大，而增大，而J不变，从而使相互不变，从而使相互重叠的峰组分离开来。重叠的峰组分离开来。 例如：分别用例如：分别用60 MHz和和270 MHz的核磁的核磁共振仪测出的苯胺的共振仪测出的苯胺的NMR谱图如下：谱图如下：苯胺的苯胺的 60 MHz HNMR谱谱苯胺的苯胺的 270 MHz HNMR谱谱( (二二) )、位移试剂位移试剂 能使样品的质子共振吸收峰

20、发生化学位能使样品的质子共振吸收峰发生化学位移的试剂。常用的是镧系稀土配合物。移的试剂。常用的是镧系稀土配合物。O=CCHOCR1R2M3+3Pr (dpm)3: R1=R2=CMe3Eu (dpm)3: R1=R2=CMe3Eu (fod)3: R1=CMe3 ,R2=n-C3F7 Pr : 镨镨 , Eu : 铕铕 Dmp : -二羰基化合物二羰基化合物 这些试剂均是这些试剂均是Lewis酸酸，与样品中的碱性基团结，与样品中的碱性基团结合，使邻近的质子受到其磁场的影响，而产生位移。合，使邻近的质子受到其磁场的影响，而产生位移。 在低温下，在低温下，CDCl3中测定，效果最好。中测定，效果最

21、好。例如：例如：( (三三) )、双照射去偶技术双照射去偶技术 在在NMR的测定过程中，同时用一强功率的射的测定过程中，同时用一强功率的射频频(频率等于偶合体系中的某个核的共振频率频率等于偶合体系中的某个核的共振频率)照射照射体系，与被照射核的偶合作用将消失，谱图将被简体系，与被照射核的偶合作用将消失，谱图将被简化。化。 （1）（2）（3）abcd照射照射0510CCHHH3CCHOacdb偶合谱偶合谱Ha被照射被照射去去Ha偶合偶合Hd被照射被照射去去Hd偶合偶合DEPTs二维核磁共振（二维核磁共振（2D NMR）谱分类：）谱分类： 二维二维J分解谱（分解谱（J resolved spect

22、roscopy) 二维化学位移相关谱（二维化学位移相关谱（chemical shift correlation spectroscopy） 多量子谱（多量子谱（multiple quantum spectroscopy）图谱类型：图谱类型： 堆积图：准三维立体图堆积图：准三维立体图 平面等值线图：平面等高线图平面等值线图：平面等高线图 截面图：全谱的某个剖面截面图：全谱的某个剖面 积分投影图：一维图积分投影图：一维图( (四四) )、二维核磁共振、二维核磁共振1、二维二维J分解谱分解谱1H同核二维同核二维J分解谱分解谱异核碳、氢二维异核碳、氢二维J分解谱分解谱2、同核化学位移相关谱（、同核化学

23、位移相关谱（1H-1H COSY）1H-1H TOCSY1H-1H NOESY3、异核碳氢化学位移相关谱、异核碳氢化学位移相关谱(HSQC)HMBC1H NMR 谱（一维）CH, CH2, CH3中质子信号的归属1H 化学位移相关二维 NMR 谱 （自旋体系的解析）13C NMR 谱（一维）INEPT 谱（识别碳原子基团）1H-13C 化学位移相关二维 NMR 谱确定碳原子骨架NOE 相关二维 NMR 谱 NOE 差谱（确定 1H 的空间排布） 确定分子结构（ 1H 原子的归属）13C 原子的归属结构解析的一般程序结构解析的一般程序 测定生物大分子空间结构测定生物大分子空间结构 研究生物大分子

24、与配基的相互作用研究生物大分子与配基的相互作用 测定生物大分子的动力学性质测定生物大分子的动力学性质 跟踪蛋白质的折叠过程跟踪蛋白质的折叠过程,捕获折叠过程中瞬态中间物捕获折叠过程中瞬态中间物 测定可滴定基团的解离常数测定可滴定基团的解离常数 测量溶液中分子的扩散系数测量溶液中分子的扩散系数 研究酶反应机理研究酶反应机理 跟踪活细胞的代谢过程跟踪活细胞的代谢过程 用于医学成像以及神经科学中的脑功能成像用于医学成像以及神经科学中的脑功能成像四四.核磁共振在生命科学中的应用核磁共振在生命科学中的应用1.1.蛋白质的蛋白质的1H谱谱 蛋白质的第一张1H谱(核糖核酸酶, 40 MHz),记于1957年

25、 Adapted from Jeremy N.S.Evans (1995) Biomolecular NMR Spectroscopy. p.3, Oxford University Press Inc. 2.0 mM Rnase T1的900 MHz 1H谱 Protein NMRAromaticIminesAmidesHCb, , , . HCawater10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 02.2.结构解析结构解析12.510.07.55.02.50.00.99, br s6.70, s6.48, s7.53, s6.89, d, J=8.4Hz7.62, d, J=8.4Hz3.

26、86, s4.88, d, J=10.2Hz 5.34, t, J=9.5Hz3.47, m3.49, m3.34, m3.61, m; 3.80, m2.06, m1.25, m1.25, m0.60, t, J=7.2Hz0.69, d, J=6.9HzMeMeOOHOHOOOHHOOHOOMeOOHHaHbHMeMeOOHOHOOOHHOOHOOMeOOHHaHbH7.55.02.50.99, br s6.48, s3.86, s0.69, d, J=6.9Hz2.06, m1.25, m1.25, m0.60, t, J=7.2Hz 5.34, t, J=9.5Hz3.47, m3.4

27、9, m3.61, m; 3.80, m3.34, m4.88, d, J=10.2Hz7.53, s6.70, s7.62, d, J=8.4Hz6.89, d, J=8.4Hz161.8MeMeOOHOHOOOHHOOHOOMeOOHHaHbH164.6102.4182.1161.894.6162.7103.2155.6104.2121.7114.1145.9150.1115.7119.670.771.575.770.682.361.356.6174.540.225.711.216.41751501251007550250DEPT Spectrum of Trolliuside IMeMeOOHOHOOOHHOOHOOMeOOHHaHbH23612561234561234581066255233662211OMeOMe6666343, 45522333355441H-1H COSY Spectrum of Trolliuside IMeMeOOHOHOOOHHOOHOOMeOOHHaHbH164.6102.4182.1161.894.6162.7103.2155.6104.2121.7114.1145.9150.1115.7119.670.771.575.770.682.361.356.6174.540.225.711.216.46256321OMe 6634523354