抑制消减杂交的原理及应用

1、主 要 内内 容 抑制消抑制消减杂减杂交的定交的定义义 抑制消抑制消减杂减杂交的基本原理及交的基本原理及实验过实验过程程 抑制消减杂减杂交的定义义抑制消减杂减杂交的原理抑制消减杂减杂交的原理巢式PCR示意图抑制消减杂减杂交的原理抑制消减杂减杂交的实验过实验过程抑制消减杂减杂交的实验过实验过程抑制消减杂减杂交的实验过实验过程PCR-TOPO 载体(T载体的一种)抑制消减杂减杂交的实验过实验过程抑制消减杂减杂交的实验过实验过程大肠杆菌大肠杆菌抑制消减杂减杂交的实验过实验过程蓝白斑筛选示意图抑制消减杂减杂交的实验过实验过程人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交 抑制消减杂减杂交的实验过实验过程核酸核酸抑

2、制消减杂减杂交的实验过实验过程探针种探针种类类 抑制消减杂减杂交杂杂交的实验过实验过程常见的为32P,它能量高信号强。放射性同位素具辐射 危害和半衰期限制。标记简单，但是效率较低，对于短探针不宜使用。将生物素链接在核酸探针上，利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理，分子杂交后用亲和素或链酶亲和素进行检测生物素与dUTP中尿嘧啶的C5相连，在聚合酶作用下掺入DNA地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连。用荧光素标记核酸；用荧光素标记抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。 抑制消减杂减杂交的实验过实验过程 抑制消减杂减杂交的实验过实验过程mRNA样品经电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上，与放射性标记样品经电泳分离后，

3、转移到硝酸纤维素膜上，与放射性标记的的DNA探针进行杂交，经放射自显影，即可检测特异性探针进行杂交，经放射自显影，即可检测特异性mRNA分子分子在样品中存在与否及其长度大小在样品中存在与否及其长度大小斑点杂交是将斑点杂交是将DNA或或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交以显示样品中是否存在特异的与核酸探针分子杂交以显示样品中是否存在特异的DNA或或RNA。利用类似利用类似Southern印迹法的方法对蛋白质进行印迹分析，蛋白质经印迹法的方法对蛋白质进行印迹分析，蛋白质经单向电泳分离后被转移到硝酸纤维滤膜上，然后用放射性或酶标记的单向电泳分

4、离后被转移到硝酸纤维滤膜上，然后用放射性或酶标记的特异抗体来检测相应抗原的存在。特异抗体来检测相应抗原的存在。将DNA电泳转印到固相支持物上，用探针（DNA/DNA杂交）进行检测的方法。是基因分离和鉴定的重要手段，广泛用于遗传多态性分析抑制消减杂减杂交的实验过实验过程斑点杂交点膜抑制消减杂减杂交技术术的优优点1234本技术对高、本技术对高、低丰度的差异低丰度的差异表达基因都能表达基因都能有效分离。主有效分离。主要原因是该技要原因是该技术利用了杂交术利用了杂交二级动力学原二级动力学原理理简便易行及重简便易行及重复性好：本技复性好：本技术所采用的方术所采用的方法简单、成熟、法简单、成熟、易掌握，易操易掌握，易操作，且假阳性作，且假阳性率低率低灵敏度高：用灵敏度高：用抑制消减杂交抑制消减杂交技术仅需要技术仅需要12ug的的mRNA快速：应用快速：应用这种方法一这种方法一般般34天即天即可获得差异可获得差异表达基因片表达基因片段的段的cDNA抑制消减杂减杂交技术术的应应用器官发育器官发育睾丸特异表达基因的研究免疫学免疫学T细饱杂交瘤比较获得一个新的TNF家族成员 TRANCE基因，编码产物能调节T细胞依赖