分光光度法在职业卫生检测中的应用20131028

1、紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法在职业卫生检测中的应用在职业卫生检测中的应用姜素霞2013年10月u熟悉紫外可见分光光度法相关基本概念熟悉紫外可见分光光度法相关基本概念u熟悉紫外可见分光光度法的基本原理熟悉紫外可见分光光度法的基本原理u掌握紫外可见分光光度计的仪器组成、分掌握紫外可见分光光度计的仪器组成、分析测试条件选择、分析方法及注意事项析测试条件选择、分析方法及注意事项一一分光光度方法分类分光光度方法分类二二紫外紫外- -可见分光光度原理及仪器构成可见分光光度原理及仪器构成三三紫外紫外- -可见分光光度法分析条件的选择可见分光光度法分析条件的选择四四紫外紫外- -可见分光光度法的应用

2、可见分光光度法的应用五五常见问题及注意事项常见问题及注意事项 光，或称电磁辐射，具有两重性质：光，或称电磁辐射，具有两重性质：（1 1）它是通过空间）它是通过空间传播传播的一种波的一种波, ,具有波动性。具有波动性。（2 2）它又是由粒子（光子）组成的，具有粒子性。）它又是由粒子（光子）组成的，具有粒子性。光子是非连续的（离散性的）光子是非连续的（离散性的）能束能束。 对包含大量数目的光子的行为，光的波动性对包含大量数目的光子的行为，光的波动性是主要的；当对个别原子产生辐射效应时，把光是主要的；当对个别原子产生辐射效应时，把光子作为能束是主要的。子作为能束是主要的。一一分光光度方法分类分光光度

3、方法分类光谱分区光谱分区(穿透穿透)能量能量 小小200nm400nm760nm 大大波波 长长光谱区域光谱区域紫外光区紫外光区可见光区可见光区红外红外50m分析方法分析方法 紫外分光光度法紫外分光光度法可见分光光度法可见分光光度法红外分光光度法红外分光光度法紫、蓝、青、绿、黄、橙、红紫、蓝、青、绿、黄、橙、红一一分光光度方法分类分光光度方法分类紫外分光光度法紫外分光光度法红外分光光度法红外分光光度法分分光光光光度度吸光光度法吸光光度法发光光度法发光光度法可见光分光光度法可见光分光光度法荧光分光光度法荧光分光光度法一一分光光度方法分类分光光度方法分类 荧光分光光度计荧光分光光度计既可用于定量既

4、可用于定量分析，也可用于测绘激发光谱分析，也可用于测绘激发光谱和荧光光谱。第一单色器选择和荧光光谱。第一单色器选择激发光波长（激发光波长（250nm250nm的紫外的紫外光），故称为激发单色器。第光），故称为激发单色器。第二单色器（荧光单色器）与激二单色器（荧光单色器）与激发光入射方向垂直，并选择荧发光入射方向垂直，并选择荧光波长，可提高方法的选择性光波长，可提高方法的选择性和准确度和准确度。一一分光光度方法分类分光光度方法分类荧光分光光度法荧光分光光度法灵敏度高灵敏度高 较紫外较紫外- -可见分光光度法高可见分光光度法高1-31-3个数量级。个数量级。选择性强选择性强 能吸收光的物质并不一定

5、能产生荧光，能吸收光的物质并不一定能产生荧光，且不同物质由于结构不同，虽吸收同一波长的光，且不同物质由于结构不同，虽吸收同一波长的光，但产生的荧光波长也不尽相同但产生的荧光波长也不尽相同 。用样量少、操作简便用样量少、操作简便 缺点缺点 : :许多物质本身不会发射荧光许多物质本身不会发射荧光 应用不够广泛应用不够广泛 受外界条件影响大铍：桑色素荧光分光光度铍：桑色素荧光分光光度 硒：二氨基萘荧光分光光度硒：二氨基萘荧光分光光度一一分光光度方法分类分光光度方法分类荧光分光光度法特点荧光分光光度法特点 物质吸收紫外和可见光区电磁波而产物质吸收紫外和可见光区电磁波而产生吸收光谱生吸收光谱紫外紫外-可

6、见吸收光谱。可见吸收光谱。波长（波长（200400）nm范围称为范围称为紫外紫外光区，光区，波长（波长（400760）nm称为称为可见可见光区。光区。 一一分光光度方法分类分光光度方法分类为什么可以为什么可以达到检测的达到检测的目的？目的？产生吸收光谱的原因产生吸收光谱的原因 分子具有不同的特征能级，当分子从外界分子具有不同的特征能级，当分子从外界吸收能量后，就会发生相应的能级跃迁。同原吸收能量后，就会发生相应的能级跃迁。同原子一样，分子吸收能量具有量子化特征，记录子一样，分子吸收能量具有量子化特征，记录分子对电磁辐射的吸收程度与波长的关系就可分子对电磁辐射的吸收程度与波长的关系就可以得到吸收

7、光谱。以得到吸收光谱。 一一分光光度方法分类分光光度方法分类 紫外紫外- -可见吸收光谱法是一种可见吸收光谱法是一种分子光谱分子光谱法。法。该法广泛运用于无机物质、有机物质定性和定量分析该法广泛运用于无机物质、有机物质定性和定量分析二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成分光光度法测量的理论依据：分光光度法测量的理论依据： 朗伯朗伯比尔（比尔（ Lambert -Beer）定律）定律 当溶液中的物质在光的照射和激发下，当溶液中的物质在光的照射和激发下，产生了对光吸收的效应。物质对光的吸收是有产生了对光吸收的效应。物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质都有其

8、各自的吸收选择性的，各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。光谱。 ：比例常数，与吸光物质的性质、入射光波长及温度等有关。比例常数，与吸光物质的性质、入射光波长及温度等有关。 A：吸光度，表征物质对光吸收程度的量。吸光度，表征物质对光吸收程度的量。C：溶液浓度溶液浓度 ； I0：入射光强；：入射光强； It ：透射光强；：透射光强； b：液层厚度；：液层厚度； T ：透光率或透光度透光率或透光度朗伯朗伯-比尔定律表达式比尔定律表达式二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成bcTTIIAtlg1lglg0当一束单色光穿过透明介质时，光强度的降当一束单色光穿过透明介质

9、时，光强度的降低同吸收介质的低同吸收介质的厚度（或厚度（或光径长度光径长度）、）、溶液溶液的浓度的浓度成正比。成正比。I0Itbl溶液的透光率愈大，表示它对光的吸收愈小溶液的透光率愈大，表示它对光的吸收愈小l溶液的透光率愈小，表示它对光的吸收愈大溶液的透光率愈小，表示它对光的吸收愈大 0IITt二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成摩尔吸光系数摩尔吸光系数它是吸光物质在它是吸光物质在特定波长特定波长下的一个特征常数。下的一个特征常数。在在数值上等于数值上等于1molL-1吸光物质在吸光物质在1cm光程中光程中的吸光度。其单位为的吸光度。其单位为L mol-1

10、 cm-1。由于。由于值值与入射光波长有关，故表示与入射光波长有关，故表示时，应注明所用时，应注明所用入射光波长。入射光波长。二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成朗伯朗伯-比尔定律比尔定律 A=-lgT=bc 适用于适用于单色光、稀溶液单色光、稀溶液回回顾顾在分析化学中，在分析化学中，值的大小反应了吸光物值的大小反应了吸光物质对某一特定波长光吸光能力大小。质对某一特定波长光吸光能力大小。值越值越大大，该吸光物质的吸光能力越，该吸光物质的吸光能力越强强。值是衡量光度分析方法灵敏度的重要指值是衡量光度分析方法灵敏度的重要指标，标，值越值越大大，方法的灵敏度越，

11、方法的灵敏度越高高 。二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成回回顾顾五五个单元组成个单元组成二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成吸收池吸收池讯号处讯号处理和显理和显示器示器1. 1. 光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。定性、较长的使用寿命。钨灯或卤钨灯钨灯或卤钨灯可见光源可见光源 （3501000）nm氢灯或氘氢灯或氘灯灯 紫外光源紫外光源 （200360）nm二、紫外二、紫外-

12、-可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成2 2. .单色器单色器是是将将光源发射的复合光分解成光源发射的复合光分解成单色光单色光并可从并可从中选出一任波长单色光的光学系统中选出一任波长单色光的光学系统。包括。包括5 5部部分。分。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器；入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光准光装置装置( (准直镜准直镜) )：透镜或返射镜使入射透镜或返射镜使入射光成为平行光束；光成为平行光束； 色散色散元件（元件（分光镜分光镜）：）：将复合光分解成单将复合光分解成单色光色光；过滤、过滤、棱镜棱镜或光栅或光栅； 聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光聚焦装置：透镜或凹面

13、反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；后所得单色光聚焦至出射狭缝； 出射出射狭缝：射出单色光。狭缝：射出单色光。二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成3. 3. 样品样品室室( (吸收池吸收池) ) 样品室放置各种类型的吸收池样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池般用玻璃池。玻璃玻璃能能吸收紫外光吸收紫外光

14、，仅适用于，仅适用于可见可见光区光区石英石英不能吸收紫外光，适用于不能吸收紫外光，适用于紫外和可见紫外和可见光区光区 二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成4 4. . 检测器检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电池、光电管或光光电倍增管、二极管阵列检测器电倍增管、二极管阵列检测器。5. 5. 信号处理及显示信号处理及显示记录系统记录系统 即：记录装置。检流计即：记录装置。检流计、数字显示、微机、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果进行仪器自动控制和结果

15、处理等。处理等。二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成分光光度计从入射光类型划分分光光度计从入射光类型划分分光光度计从入射光类型划分分光光度计从入射光类型划分分光光度计从入射光类型划分分光光度计从入射光类型划分单光束分光光度计单光束分光光度计 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成二、紫外二、紫外- -可见吸光

16、光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成双光束分光光度计双光束分光光度计 经单色器分光后经反射镜分解为经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光强度相等的两束光，一，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。双光束分光光度计一般吸光度并作为波长的函数记录下来。双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池

17、，还池和样品池，还能自动消除光源能自动消除光源不稳定、检测器灵敏度变化不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响等因素的影响，特别适合于，特别适合于结构分析结构分析。仪器复杂，价格较高。仪器复杂，价格较高。双波长分光光度计双波长分光光度计 将不同波长的两束单色光将不同波长的两束单色光( (1 1、2 2) ) 快束交替快束交替通过通过同一吸收池同一吸收池而后到达检而后到达检测器。产生交流信号。测器。产生交流信号。无需参比池无需参比池。 = =1 12 2nmnm。两波长同时扫描即可获得导两波长同时扫描即可获得导数光谱数光谱。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景对于多组分混合物

18、、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。的灵敏度和选择性。二、紫外二、紫外- -可见吸光光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成紫外紫外与与可见分光光度计的不同可见分光光度计的不同首先光源不同，紫外用首先光源不同，紫外用氢灯或氘灯氢灯或氘灯，而可见用，而可见用钨钨灯，灯，因为二者发出的光的波长范围不同因为二者发出的光的波长范围不同 从单色器来说，如果用棱镜做单色器，则紫外必须从单色器来说，如果用棱镜做单色器，则紫外必须使用石英棱镜，可

19、见则石英棱镜或玻璃棱镜均可使使用石英棱镜，可见则石英棱镜或玻璃棱镜均可使用，而光栅则二者均可使用，这主要是由于玻璃能用，而光栅则二者均可使用，这主要是由于玻璃能吸收紫外光的缘故。吸收紫外光的缘故。从吸收池来看，紫外只能使用从吸收池来看，紫外只能使用石英石英吸收池，而可见吸收池，而可见则则玻璃、石英玻璃、石英均可使用。均可使用。 从检测器来看，可见区一般使用氧化铯光电管，它从检测器来看，可见区一般使用氧化铯光电管，它适用的波长范围为（适用的波长范围为（625-1000）nm，紫外用锑铯光，紫外用锑铯光电管，其波长范围为（电管，其波长范围为（200-625）nm. 二、紫外二、紫外- -可见吸光光

20、度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成n紫外可见分光光度计主要部件包括光源、单紫外可见分光光度计主要部件包括光源、单色器、吸收池、检测器、讯号处理和显示器。色器、吸收池、检测器、讯号处理和显示器。n紫外可见分光光度计光源、比色皿不同紫外可见分光光度计光源、比色皿不同n双光束分光光度计可消除光源不稳定、检测双光束分光光度计可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。分析。 n单色器通过使用单色器通过使用“滤光片、棱镜、光栅、准滤光片、棱镜、光栅、准直镜等将复合光分成单色光。直镜等将复合光分成单色光。二、紫外二、紫外- -可见吸光

21、光度原理及仪器构成可见吸光光度原理及仪器构成回回顾顾GBZ/T 210.4-2008职业卫生标准制定指南职业卫生标准制定指南 第第4部分部分:工作场所空气中化学物质测定方法工作场所空气中化学物质测定方法三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择1. 入射光波长的选择入射光波长的选择2. 吸光度读数范围的选择吸光度读数范围的选择3. 参比溶液参比溶液(空白溶液空白溶液)的选择的选择4. 显色反应条件的选择显色反应条件的选择5. 狭缝宽度的选择狭缝宽度的选择6.6. 溶液的酸度溶液的酸度7. 比色时间比色时间8. 显色温度显色温度9. 对标准曲线的要求对标准曲线的要求10.对检出限的

22、要求对检出限的要求1、入射光波长的选择、入射光波长的选择maxAmax此处：灵敏度此处：灵敏度高高吸收曲线吸收曲线：吸光度随波长变化的曲线。：吸光度随波长变化的曲线。不同的物质因其不同的物质因其分子结构分子结构不同而具有不同不同而具有不同的吸的吸收曲线；收曲线；同一物质同一物质，浓度不同，其吸收曲线的形状和，浓度不同，其吸收曲线的形状和max的位置的位置不变不变，但在同一波长下吸光度随浓，但在同一波长下吸光度随浓度的增大而增大度的增大而增大。三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择 KMnO4溶液的吸收溶液的吸收曲线曲线 吸收曲线吸收曲线 以入射光波长以入射光波长作横坐标，用分

23、光光作横坐标，用分光光度计测量每一波长下度计测量每一波长下物质对光的吸光度作物质对光的吸光度作纵坐标所绘制的曲线纵坐标所绘制的曲线，称为，称为吸收曲线吸收曲线。其。其作用是：选择入射光作用是：选择入射光波长，在此波长下测波长，在此波长下测量吸光度，则分析的量吸光度，则分析的灵敏度最高。因此，灵敏度最高。因此，吸收曲线是吸光光度吸收曲线是吸光光度法中选择测定波长的法中选择测定波长的重要依据。重要依据。 三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择2、吸光度、吸光度读数范围的选择读数范围的选择A=0.20.8最适宜，误差小最适宜，误差小暗噪音暗噪音与检测器与检测器和放大电路不确切性和放

24、大电路不确切性有关，与光讯号无关有关，与光讯号无关讯号噪音讯号噪音与与光讯号有关光讯号有关仪器噪音仪器噪音(暗噪音、暗噪音、讯号噪音讯号噪音)三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择控制吸光度在合理范围的方法控制吸光度在合理范围的方法包括包括 ：控制溶液的浓度，如改变试样的称量，或改控制溶液的浓度，如改变试样的称量，或改变溶液的稀释度等；变溶液的稀释度等；选择不同厚度的比色皿，以改变光程的长度；选择不同厚度的比色皿，以改变光程的长度；采用示差法。采用示差法。三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择3、参比溶

25、液、参比溶液(空白溶液空白溶液)的选择：的选择：目的：目的： 采用采用空白对比消除因溶剂和容器空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射的吸收、光的散射和界面和界面反射等反射等因素对透光率的干扰因素对透光率的干扰 （1）若）若仅仅待测物（待测物（M）与显色剂（）与显色剂（R）的反应产物（）的反应产物（MR）有吸收，可用）有吸收，可用蒸馏水蒸馏水作参比溶液。作参比溶液。 （2）若待测物（）若待测物（M）无吸收）无吸收 ，而显色剂（，而显色剂（R）或其）或其它试剂（它试剂（R）有吸收）有吸收 ，则用不加试样的，则用不加试样的空白溶液空白溶液作参比作参比溶液。溶液。 （3）若试样中的其它组分有吸收（待

26、测物）若试样中的其它组分有吸收（待测物M之外的之外的组分，如组分，如N），但不与显色剂反应：），但不与显色剂反应： 当显色剂无吸收时，可用当显色剂无吸收时，可用试样溶液试样溶液作参比溶液；作参比溶液； 当显色剂有吸收时，可在试液中加入适当当显色剂有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂掩蔽剂将将待测组分掩蔽后再加显色剂，以此溶液作参比溶液。待测组分掩蔽后再加显色剂，以此溶液作参比溶液。 总之，总之，选择参比溶液的原则是：应使测得的试液的选择参比溶液的原则是：应使测得的试液的吸光度能真正反映吸光度能真正反映待测物待测物的浓度的浓度。 三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择参比溶液的选

27、择方法参比溶液的选择方法参比溶液的使用方法参比溶液的使用方法样参调节光路光学性质和厚度相同样品池样品溶液，参比池空白溶液样品池参比池配制样品的溶剂空白溶液ATA %1000三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择 显色反应显色反应：将被测组分转变成有色化合物的化学反应：将被测组分转变成有色化合物的化学反应被测组分被测组分中间生成物中间生成物显色剂显色剂有色化合物有色化合物+试剂试剂显色剂显色剂有色化合物有色化合物+显色剂：显色剂：能与被测组分能与被测组分反应生成反应生成有色化合物的试剂有色化合物的试剂 4、显、显色色反应条件的选择反应条件的选择三、分光光度法分析条件的选择三、分

28、光光度法分析条件的选择Fe2+NOl 反应生成物反应生成物须在紫外须在紫外-可见光区有较强吸光能可见光区有较强吸光能力，即摩尔吸光系数较力，即摩尔吸光系数较大大。l反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别。如差别。如显色剂显色剂（R）在测定波长处无吸收）在测定波长处无吸收 ，即即尽可能尽可能小小。l反应产物应足够稳定，反应产物组成反应产物应足够稳定，反应产物组成恒定恒定，以，以保证测量过程中溶液的吸光度保证测量过程中溶液的吸光度不变不变。显色显色反应必须满足的条件反应必须

29、满足的条件三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择5、狭缝宽度的选择、狭缝宽度的选择 以减少狭缝宽度时样品的吸光以减少狭缝宽度时样品的吸光度不再增加为准，一般来说，狭度不再增加为准，一般来说，狭缝宽度是样品吸收峰半宽度的十缝宽度是样品吸收峰半宽度的十分之一分之一。三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择 溶液的酸度对被测组分存在状态的影响溶液的酸度对被测组分存在状态的影响 （大多数被测金属离子易水解，当溶液 pH 增大时，可能生成各种类型的氢氧基配合物，甚至生成氢氧化物沉淀，使显色反应不能进行完全。）6 6、溶液、溶液的酸度的酸度对显色剂的平衡浓度和颜色的对显色

30、剂的平衡浓度和颜色的影响影响（影响显色反应的完全程度）溶液酸度对有色化合物组成的影响溶液酸度对有色化合物组成的影响： （在不同 pH 的溶液中，显色剂与待测离子形成的有色化合物的组成往往不同，其颜色也不同）三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择显色反应速率显色反应速率快：立即比色快：立即比色慢：溶液颜色稳定后慢：溶液颜色稳定后（盐酸反应（盐酸反应20分钟）分钟）7、比、比色时间色时间样品或有色化样品或有色化合物稳定性合物稳定性稳定稳定（SO2）不稳定不稳定（氮氧化物、（氮氧化物、氨等）氨等）三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择有色化合物的有色化合物的稳定稳

31、定（高温分解）高温分解）对光吸收的对光吸收的影响影响（标样和试样的显色温度一致）标样和试样的显色温度一致）显色反应需要一定的温度（显色反应需要一定的温度（P2S5）显色反应的进行显色反应的进行8、显、显色温度色温度三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择标准曲线：标准曲线：在在 （特定波长特定波长）、b固定的情况下，测定固定的情况下，测定一系列不同浓度一系列不同浓度的标准的标准溶液的吸光度，作溶液的吸光度，作Ac图，在相同条件下测定图，在相同条件下测定样品溶液的吸光度，从样品溶液的吸光度，从曲线上可查出被测样品曲线上可查出被测样品的浓度。的浓度。9、对标准曲线的要求、对标准曲线

32、的要求浓度（浓度（c c）A5 5个个浓度点浓度点线性范围，线性范围，相关系数相关系数三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择0.5倍倍2倍倍容许浓度容许浓度浓度浓度 c c 正偏离正偏离负偏离负偏离吸光度吸光度曲线偏离的情况曲线偏离的情况 依据依据BeerBeer定律，定律，A A与与C C关系关系应为经过原点的直线应为经过原点的直线 偏离偏离BeerBeer定律的主要因素定律的主要因素表现为表现为 （一）（一）光学因素光学因素 （二）（二）化学因素化学因素 三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择 非单色光的影响：非单色光的影响： Beer定律应用的重要前提

33、定律应用的重要前提入射光为入射光为单色光单色光 三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择 Beer定律适用的另一个前提：定律适用的另一个前提：稀溶液稀溶液 浓度浓度过高和化学变化会过高和化学变化会使使C与与A关系偏离关系偏离定律定律三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择溶液浓度溶液浓度过高引起的偏离过高引起的偏离 若吸光物质溶液的浓度较高时，吸光粒子之间的相互作用较强，改变了吸光粒子对光的吸收能力，使溶液的吸光度与溶液浓度之间的线性关系发生了偏离。化学变化所引起的偏离化学变化所引起的偏离( (溶质和溶剂的作用溶质和溶剂的作用) ) 溶液中吸光物质常因解离、缔合

34、、形成新的化合物或在光照射下发生互变异构等，从而破坏了平衡浓度与分析浓度之间的正比关系，也就破坏了吸光度A与分析浓度之间的线性关系。产生对朗伯-比尔定律的偏离。三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择介质不均匀性介质不均匀性如果被测试液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液，则入射光通过溶液后，除了一部分被试液吸收，还会有反射、散射使光损失，导致透光率减小，使透射比减小，使实际测量吸光度增大，使标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲，造成对朗伯-比尔定律的偏离。（加入适量的表面活性剂等来改善溶质的均匀度）三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择10、对检出限的要求、对检出限

35、的要求重复多次重复多次(至少至少6次次)测定的试剂空白吸光度测定的试剂空白吸光度的的3倍倍标准差处对应的待测物浓度或标准差处对应的待测物浓度或含量。含量。吸光度吸光度0.02处对应的待测物浓度或处对应的待测物浓度或含量。含量。1)(12nxxsniiS:S:标准差标准差 x xi i: :测定测定值值 n:n:测定值测定值个数个数在相同条件下多次检测结果之间的接近程度，称为重复性在相同条件下多次检测结果之间的接近程度，称为重复性氯气三、分光光度法分析条件的选择三、分光光度法分析条件的选择1. 入射光波长的选择入射光波长的选择2. 吸光度读数范围的选择吸光度读数范围的选择3. 参比溶液参比溶液(

36、空白溶液空白溶液)的选择的选择4. 显色反应条件的选择显色反应条件的选择5. 狭缝宽度的选择狭缝宽度的选择6.6. 溶液的酸度溶液的酸度7. 比色时间比色时间8. 显色温度显色温度9. 对标准曲线的要求对标准曲线的要求10.对检出限的要求对检出限的要求回回顾顾灵敏度较高灵敏度较高：试样中：试样中1%-0.001%微量成分微量成分准确度较高：相对误差准确度较高：相对误差2%-5%适用于几乎适用于几乎所有的无机所有的无机离子和许多离子和许多有机化有机化合物合物操作简便、快速、仪器价格适中、用途操作简便、快速、仪器价格适中、用途广广分光光度法特点分光光度法特点四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应

37、用可见分光光度法的应用 除主要可用于物质的定量分析外，还可以除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。 1.定性分析定性分析 每一种化合物都有自己的特征光谱。测出每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作未知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一出定性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困难。定的困难。四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用2.纯度的鉴定纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。用紫外吸收光谱确定

38、试样的纯度是比较方便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的的比值，鉴定其纯度。比值，鉴定其纯度。 3.结构分析结构分析 紫外紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。无共轭结构和芳香结构。四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用目视比色法目

39、视比色法标准系列标准系列待测样品待测样品操作简单方便操作简单方便主观误差较大主观误差较大不能排除其它有色物质干扰不能排除其它有色物质干扰视线视线四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用消除轻度色盲、眼睛疲劳消除轻度色盲、眼睛疲劳等造成的主观误差，提高分等造成的主观误差，提高分析结果的准确度析结果的准确度通过选择滤光片和参比溶通过选择滤光片和参比溶液消除共存的其它有色物质液消除共存的其它有色物质使用标准曲线，分析大批使用标准曲线，分析大批试样时，简化手续，加快分试样时，简化手续，加快分析速度析速度与目视比色法相比与目视比色法相比测标测标ccAA标标测测CcAA四、紫外四、紫

40、外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用标标bcA测测bcA有有毒毒物物质质金属金属元素单元素单质及化合物质及化合物非金属非金属元素单元素单质及化合物质及化合物有机有机化合物化合物（联苯、苯酚等（联苯、苯酚等20多种物质）多种物质）（碱金属、碱土金属（碱金属、碱土金属镉铋锑镍铊钴铜等元素镉铋锑镍铊钴铜等元素除外，大约一半左右）除外，大约一半左右）（碳碲氟等元素除外）（碳碲氟等元素除外）吸收液吸收液 分分光光度光光度滤膜滤膜原子原子吸收吸收吸附剂吸附剂管管色色谱谱四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用无机无机化合物化合物（N、S、P） 可见分光光度计四、紫外四、紫

41、外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用 紫外-可见分光光度计四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用NO2NONO+NO2NO2采样泵采样泵采样泵采样泵采样方法1采样方法2一氧化氮和二氧化氮的盐酸萘乙二胺分光光度法一氧化氮和二氧化氮的盐酸萘乙二胺分光光度法GBZ/T160.29-2004四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用采样器流采样器流量量程的量量程的选择选择式式中：中：C 空气中氧化氮的浓度，空气中氧化氮的浓度，mg/m3； m 测得样品溶液中氧化氮的含量，测得样品溶液中氧化氮的含量，g； 1.32 由气态氧化氮换算成液态氧化氮的系

42、数；由气态氧化氮换算成液态氧化氮的系数； Vo 标准采样体积，标准采样体积，L。四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用32. 10VmC 吸收液应避光保存，吸收管在采样、运送吸收液应避光保存，吸收管在采样、运送和存放过程中，都应采取避光措施。和存放过程中，都应采取避光措施。 消除臭氧二氧化硫等的干扰消除臭氧二氧化硫等的干扰 应及时更换氧化管应及时更换氧化管 计算问题计算问题四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用 采样后应尽快测量样品的吸光度，若不采样后应尽快测量样品的吸光度，若不能及时分析，应将样品于低温暗处存放能及时分析，应将样品于低温暗处存放

43、 样品于样品于30暗处存放，可稳定暗处存放，可稳定8h； 20暗处存放，可稳定暗处存放，可稳定24h； 于于04冷藏，至少可稳定冷藏，至少可稳定3d。 气温超过气温超过25时，长时间运输及存放样品时，长时间运输及存放样品应采取降温措施。应采取降温措施。 四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用 三氧化铬三氧化铬-石英砂氧化管适合在空气相石英砂氧化管适合在空气相对湿度对湿度30%70时使用，空气相对湿时使用，空气相对湿度大于度大于70%时，应勤换氧化管，以免氧时，应勤换氧化管，以免氧化管因吸湿引起板结；当空气相对湿度化管因吸湿引起板结；当空气相对湿度小于小于30%时，氧化效

44、率降低，使用前应时，氧化效率降低，使用前应将氧化管放在水面上方的潮湿空气中平将氧化管放在水面上方的潮湿空气中平衡衡1h；当氧化管变为绿色时，应及时更；当氧化管变为绿色时，应及时更换。换。四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用 氨的纳氏试剂比色法氨的纳氏试剂比色法GB/T160.29-2004GB/T160.29-2004 主要问题：在样品和标准系列中易出现红棕色或者主要问题：在样品和标准系列中易出现红棕色或者黄色沉淀黄色沉淀 标准物质：标准物质：NH3与与NH4+ 加入酒石酸钾钠溶液或加入酒石酸钾钠溶液或EDTAEDTA掩蔽掩蔽 CaCa2+2+，MgMg2+2+，Fe

45、Fe3+ 3+ 等等 溶液显色的溶液显色的pH pH 适宜范围为适宜范围为11.8-12.411.8-12.4 错误更正：错误更正：GBZ/T160.29-2004GBZ/T160.29-2004中，中，“将将26.6mL26.6mL硫酸硫酸缓缓加入到缓缓加入到1000mL1000mL水中水中”应为应为“2.66mL2.66mL. . ” ”四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用 氰化氢和氰化物的菸酸钠氰化氢和氰化物的菸酸钠巴比妥酸钠分光光度法巴比妥酸钠分光光度法GBZ/T160.29-2004GBZ/T160.29-2004 错误更正：错误更正：“吸收液：氢氧化钠溶液

46、吸收液：氢氧化钠溶液(40g/L)(40g/L)”应为应为“4.0g/L4.0g/L ” ”，也有报道用，也有报道用5.0g/L5.0g/L。四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用磷酸的钼酸铵分光光度法磷酸的钼酸铵分光光度法GBZ/T160.30-2004 标准系列没有梯度变化，标准系列和样品的吸光度均标准系列没有梯度变化，标准系列和样品的吸光度均大于大于1; 空白不稳定空白不稳定; 溶液有时显蓝色，有时显黄色。溶液有时显蓝色，有时显黄色。 改进：还原剂，酸度，试剂浓度，吸收波长改进：还原剂，酸度，试剂浓度，吸收波长错误更正：错误更正： “14.4mL硫酸慢慢注入水中硫

47、酸慢慢注入水中”， 应为应为“55.6mL”.四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用三氯化磷的钼酸铵分光光度法三氯化磷的钼酸铵分光光度法GBZ/T160.30-2004 三氯化磷用吸收液采集，生成的磷酸与三氯化磷用吸收液采集，生成的磷酸与钼酸铵和氯化亚锡反应生成磷钼蓝，在钼酸铵和氯化亚锡反应生成磷钼蓝，在680nm 波长下测量吸光度，进行定量。波长下测量吸光度，进行定量。 共存的三价磷不干扰五氧化二磷的测定共存的三价磷不干扰五氧化二磷的测定，但五价磷则有干扰。在测定三氯化磷，但五价磷则有干扰。在测定三氯化磷时，采用氧化与不氧化，可以消除正磷时，采用氧化与不氧化，可以消除

48、正磷酸、正磷酸盐和五氯化磷水解生成的磷酸、正磷酸盐和五氯化磷水解生成的磷酸的干扰。酸的干扰。 四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用钼酸蓝氧化后氧化后五价磷五价磷氧化管氧化管三氯化磷三氯化磷五价磷五价磷溴水溴水五价磷五价磷显色剂显色剂不氧化管不氧化管三氯化磷三氯化磷五价磷五价磷显色剂显色剂钼酸蓝钼酸蓝三氯化磷三氯化磷样样 品品四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用 C =2 mVo1.4 C空气中三氯化磷的浓度，空气中三氯化磷的浓度，mg/ m3； 1.4 由磷酸换算为三氯化磷的系数；由磷酸换算为三氯化磷的系数； m测得样品溶液中磷酸（减去不氧测

49、得样品溶液中磷酸（减去不氧化化 管管后后）的）的含量，含量，g； Vo标准采样体积，标准采样体积，L。四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用 乙酸铅棉花晾干装入玻璃导管时注意个人防护，乙酸铅棉花晾干装入玻璃导管时注意个人防护，乙酸铅棉花适量，棉花变黑色说明硫化氢气体存乙酸铅棉花适量，棉花变黑色说明硫化氢气体存在，应及时更换乙酸铅棉花。在，应及时更换乙酸铅棉花。 还原剂碘化钾溶液和氯化亚锡溶液要密闭保存，还原剂碘化钾溶液和氯化亚锡溶液要密闭保存，防止被空气中氧气氧化。可现用现制，加入碘化防止被空气中氧气氧化。可现用现制，加入碘化钾溶液后溶液颜色变黄钾溶液后溶液颜色变黄,再

50、加入氯化亚锡溶液后溶再加入氯化亚锡溶液后溶液应变无色，若溶液仍显黄色，说明砷元素没有液应变无色，若溶液仍显黄色，说明砷元素没有被还原完全，应加大还原剂用量。被还原完全，应加大还原剂用量。砷化合物的二乙氨基二硫代甲酸银分光光度法砷化合物的二乙氨基二硫代甲酸银分光光度法GBZ/T160.31-2004 四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用 样品处理：取样品处理：取4.0ml于具塞比色管中，加于具塞比色管中，加入入6ml吸收液，混匀，供测定。吸收液，混匀，供测定。 计算公式计算公式中的系数中的系数:乘以乘以2.5。二氧化硫的甲醛缓冲液盐酸副玫瑰苯胺二氧化硫的甲醛缓冲液盐酸副

51、玫瑰苯胺分光光度法分光光度法GBZ/T160.33-2004 四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用 主要问题：氯化氢空白值偏高，标准系列及样品主要问题：氯化氢空白值偏高，标准系列及样品吸光度偏低。吸光度偏低。 样品应在样品应在48h 内测定内测定。 在测定过程中在测定过程中,显色剂的加入量必须十分准确。显色剂的加入量必须十分准确。 溴化物、碘化物、硫化氢和氰化氢的干扰也可使溴化物、碘化物、硫化氢和氰化氢的干扰也可使空白值偏高。空白值偏高。 比色皿可使用比色皿可使用20mm。氯化氢和盐酸的硫氰酸汞分光光度法氯化氢和盐酸的硫氰酸汞分光光度法GBZ/T160.37-2004

52、 四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用按苯可溶物计的项目按苯可溶物计的项目 焦炉逸散物焦炉逸散物 煤焦油沥青挥发物煤焦油沥青挥发物 石油沥青烟石油沥青烟四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用焦炉逸散物焦炉逸散物GB 170541997车间空气中焦炉逸散物车间空气中焦炉逸散物(苯溶物苯溶物)测定方法测定方法 各种化学成分的气体和颗粒物。各种化学成分的气体和颗粒物。 包括煤焦油沥青挥发物（苯包括煤焦油沥青挥发物（苯,蒽，苯并蒽，苯并芘芘,菲菲,芘芘, -萘胺萘胺）,痕量金属痕量金属(铍铬镉铅镍铍铬镉铅镍等等)和气体和气体(如氮氧化物和二氧化硫等如氮

53、氧化物和二氧化硫等)。主要成分是多环芳烃化合物，主要致癌主要成分是多环芳烃化合物，主要致癌成分为苯并成分为苯并a芘（芘（GBZ/T160.44-2004 ）。四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用煤焦油沥青挥发物煤焦油沥青挥发物(焦炭工业分析测定方法，称取小于焦炭工业分析测定方法，称取小于0.2mm样品样品1g于坩埚于坩埚中，在中，在90010下连续加热下连续加热7min后取出冷却至室温后取出冷却至室温称量称量) 从煤、石油从煤、石油(石油沥青外石油沥青外)、木材和其他有、木材和其他有机物的蒸馏残渣中挥发出来的稠合多环机物的蒸馏残渣中挥发出来的稠合多环芳烃。芳烃。 包括

54、蒽，苯并包括蒽，苯并芘芘,菲菲,芘等芘等四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用石油沥青烟石油沥青烟(GB 18553-2001车间空气中石油沥青（烟）职业接触限值车间空气中石油沥青（烟）职业接触限值) 成份复杂成份复杂,不同的沥青成份之间变化很大。不同的沥青成份之间变化很大。因而沥青烟的成份也相当复杂因而沥青烟的成份也相当复杂,总体上讲沥总体上讲沥青烟的组分与沥青近似青烟的组分与沥青近似,主要是多环芳烃及主要是多环芳烃及少量的氧、氮、硫的杂环化合物。少量的氧、氮、硫的杂环化合物。 苯可溶物与苯并苯可溶物与苯并芘的识别及检测芘的识别及检测四、紫外四、紫外- -可见分光光度

55、法的应用可见分光光度法的应用有毒有毒物质物质金属、非金属金属、非金属元素元素单质单质及化合物及化合物无机无机化合物化合物有机有机化合物化合物回回顾顾四、紫外四、紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用大幅度改变测试波长时，需等数分钟后才能大幅度改变测试波长时，需等数分钟后才能正常工作（光电管响应较慢）正常工作（光电管响应较慢）灵敏度调至灵敏度调至1 1（放大倍率最小），仪器稳定（放大倍率最小），仪器稳定灵敏度改变后要重新调节灵敏度改变后要重新调节A A为为0 0或或T T为为100100接通电源接通电源前检查仪器安全性，电源接线牢固，前检查仪器安全性，电源接线牢固，接地线通地良好，旋

56、钮起始位置正确接地线通地良好，旋钮起始位置正确接通电源后预热接通电源后预热20-3020-30分钟分钟五、常见问题及注意事项五、常见问题及注意事项1 1、分光光度计的保养与维护、分光光度计的保养与维护安置在干燥、无污染的地方；安置在干燥、无污染的地方；仪器内的防潮硅胶应定期更换或再生；仪器内的防潮硅胶应定期更换或再生；仪器停止工作时，必须切断电源，应按开关机仪器停止工作时，必须切断电源，应按开关机顺序关闭主机和稳流稳压电源开关；顺序关闭主机和稳流稳压电源开关；比色皿使用完毕后，立即用蒸馏水或有机溶剂比色皿使用完毕后，立即用蒸馏水或有机溶剂冲洗干净，并用柔软清洁的纱布把水渍擦净；冲洗干净，并用柔

57、软清洁的纱布把水渍擦净；仪器经过搬动，应及时检查并纠正仪器经过搬动，应及时检查并纠正波长波长;期间核查期间核查：核查的指标、要求、核查步骤、数核查的指标、要求、核查步骤、数据处理方法、结果如何判断等。据处理方法、结果如何判断等。五、常见问题及注意事项五、常见问题及注意事项2、比色皿的配套性问题、比色皿的配套性问题 比色皿必须配套使用，否则将使测量结果失去意义，比色皿必须配套使用，否则将使测量结果失去意义， 在进行每次测试前均应进行比较。在进行每次测试前均应进行比较。 比色皿内注入同样的液体比色皿内注入同样的液体 石英比色皿：石英比色皿：220nm、700nm装蒸馏水装蒸馏水 玻璃比色皿：玻璃比

58、色皿：700nm装蒸馏水，装蒸馏水， 将其中一池的透射比调至将其中一池的透射比调至100%，测量其他各池，测量其他各池 记录其示值之差及通光方向记录其示值之差及通光方向 如透射比之差在如透射比之差在0.5%的范围内则可以配套使用，的范围内则可以配套使用， 若超出此范围应考虑其对测试结果的影响。若超出此范围应考虑其对测试结果的影响。五、常见问题及注意事项五、常见问题及注意事项 3、采样误差的来源：、采样误差的来源： 收集器选择不合适；收集器选择不合适； 采样时机不当；采样时机不当； 采样点选择不当；采样点选择不当； 采样高度选择不当；采样高度选择不当； 采样对象选择不当；采样对象选择不当； 个体

59、采样器佩戴不当；个体采样器佩戴不当； 采样时间不合要求。采样时间不合要求。正常生产状态下，正常生产状态下，非正常（意外事非正常（意外事故、防护设施失故、防护设施失效、人为影响因效、人为影响因素等）时不能采素等）时不能采样样五、常见问题及注意事项五、常见问题及注意事项 采样装置漏气；采样装置漏气； 采样过程污染；采样过程污染； 采样吸收液损失；采样吸收液损失； 采样量超过收集器的吸收容量或吸附采样量超过收集器的吸收容量或吸附容量；容量； 使用了错误的采样流量。使用了错误的采样流量。挥发性大的吸收挥发性大的吸收液采样要补充吸液采样要补充吸收液至原来体积收液至原来体积五、常见问题及注意事项五、常见问

60、题及注意事项 气象因素带来的误差气象因素带来的误差 在高温（在高温（40以上）或低温（以上）或低温（10 以下）以下）条件采样，要事先测试采样效率；条件采样，要事先测试采样效率； 在高温（在高温（35以上）或低温（以上）或低温（5 以下）以下）条件采样，要进行体积换算条件采样，要进行体积换算； 湿度的影响；湿度的影响； 风向的影响风向的影响; 气压影响，气压低于气压影响，气压低于96.8kPa或高于或高于103.4kPa要进行体积换算要进行体积换算。五、常见问题及注意事项五、常见问题及注意事项 空气收集器的类型、性能与规格；空气收集器的类型、性能与规格； 采样前检查采样系统的采样前检查采样系统