植物组织和器官培养（1）

1、第四章 植物组织与细胞培养1 植物组织与器官培养2 植物细胞培养3 植物原生质体培养1 植物组织与器官培养1.1 概述1.2 植物组织培养的根本步骤1.3 愈伤组织培养1.4 植物器官培养1.5 植物组织培养的应用1.6 人工种子1.7 植物组织与器官的生物反响器培养1.8 植物组织与器官培养存在问题1.1.1 植物组织培养植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞体细胞、生殖细胞等、胚胎、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术。 也被称为植物离体培养或试管培养，由此培育的植物也可称之为“试管植物。1

2、.1 概述试管玫瑰、手指玫瑰组织培养与细胞培养的区别：组织培养是指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养使之生存或生长成组织。主要指用于植物快繁的组培技术。 细胞培养是指植物细胞在体外条件下的存活或生产，此时细胞不再形成组织。主要是以生产次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术。组织培养分类：根据外植体的不同，组织培养可分为植株培养、器官培养如植物的根、茎、叶、花药、子房、胚珠、胚等、组织培养含愈伤组织等。根据培养的操作方式不同，组织培养又可分为固体培养和液体培养。液体培养又可分为振荡培养、旋转培养和静止培养等。全能细胞是能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体

3、内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同的生物体。外植体是指植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。1.1.2 几个重要概念愈伤组织愈伤组织是由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。细胞大小、形状、液泡化程度、胞质含量、细胞壁特性等具有很大的差异。愈伤组织细胞是分化的，但还没有形成组织上的结构，因此愈伤组织培养过程中没有明显的组织或器官上的分化。愈伤组织可以长期保存，也可以迅速增殖用作无性系；也可以用作原生质体培养时原生质体的来源。继代培养是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时

4、需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。细胞分化和形态建成 植物通过细胞或组织培养到达再生目的要经过以下两个步骤： 培养的植物细胞或组织的脱分化，形成愈伤组织。 由新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团，随后由其分化成不同的器官原基。1.2 植物组织培养的根本过程1 培养材料的采集从理论上讲，植物具有全能性的细胞有三类：受精卵；发育中的分生组织细胞；雌雄配子及单倍体细胞；快繁中，最常用的培养材料是茎尖，通常左右。无病毒苗茎尖以下。2 培养材料的消毒自来水蒸馏水无菌纱布或吸水纸消毒刀片切成小块。无菌环境，70洒精中浸泡30-60s。漂白粉饱和液或升汞(HgCI2 )水中消毒

5、l0min。取出后用无菌水冲洗3-4次。3 制备外植体在无菌的环境下，将已消毒的材料用无菌刀、剪、镊等，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳叶片那么不需剥皮。然后切成厚的小片。严禁用手触摸材料。4 接种和培养接种：将切好的外植体立即接种在培养基上，4-10个/瓶。封口：瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带。温度：25左右，因花卉种类及材料部位的不同区别对待。增殖：在新梢等形成后需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖1个月左右后，可视情况继代。5根的诱导继代培养形成的不定芽和侧芽一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根。培养1个月后即可获得健壮根系。6 组培苗的练苗移栽培养容器

6、翻开，室内3天，取出小苗，用自来水冲洗根系上的营养基，栽入基质。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度。1.3.1 愈伤组织培养的根本过程1.3.2 愈伤组织培养的应用举例1.3 愈伤组织培养1愈伤组织的形成启动期或诱导期：主要是指细胞或原生质体准备分裂的时期。诱导剂如NAA,IAA,2,4一D等或细胞分裂素。分裂期：即开始分裂并不断增生子细胞的过程。分化期：细胞内部开始发生一系列形态和生理上的变化，分化出形态和功能不同的细胞。1.3.1 愈伤组织培养的根本过程2愈伤组织的生长3愈伤组织的分化和形态的发生自身条件如遗传性状、来源部位、年龄等等、培养基如是固体还是液体、生长素、冲动素

7、、其他营养等培养条件如温度、光质与光照强度、光周期、通气量芦荟组织培养快速繁殖1材料和培养基：芦荟幼苗，10-15cm高；愈伤诱导培养基：MS+(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L) NAA；分化培养基：MS+(2-4mg/L)BA(0.1-0.5mg/L)NAA；生根培养基：MS(0.1-0.5mg/L)IBA十2-5mg/LPP333。1.3.2 愈伤组织培养的应用举例2愈伤组织培养：清水冲洗，取茎尖局部，再冲洗1-2次，淋干。超净台上，75的乙醇浸泡30-60s，升汞浸5-10min，无菌水冲洗数次。用解剖刀取出包括茎尖生长点的组织切块，接种到愈伤组织诱导培养基上。培养条件：

8、每天光照10-12h，光照度为100020001x,温度25士2。15-25天后，试管中外植体膨大，形成愈伤组织。1周后将愈伤组织转管进行继代培养或分化培养。3继代培养：取出愈伤组织，剔除附着在愈伤块上的培养基，无菌水反复清洗数次愈伤块上无残留培养基。用解剖刀将愈伤块切成数个小块，再接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，在与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天后，三角瓶中的小愈伤块即可逐渐长大。4分化培养：将愈伤组织取出，用无菌水洗净，切成小接种块接种到装有分化培养基的三角瓶中，环境条件同愈伤组织培养。30-50天后，愈伤组织分化出芽并继续长出小叶片。5生根培养：当三角瓶中的幼苗叶片长

9、到3cm左右时，将幼苗取出，放入装有生根培养基的三角瓶中培养。半个月后，幼苗生根。6炼苗： 幼苗根长到一定长度，形体已显健壮时，取出并在清水中洗除附着在根上的培养基。 将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，在15250C,湿度6080的条件下炼苗24h，也可视情况缩短为12h。7移栽：炼苗后，将幼苗移栽人由蛭石组成的驯化苗圃中驯化，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15一20天后视幼苗长势即可移栽到苗圃中。本卷须知精确称取试剂。蔗糖-白糖。121,30min。对接种室进行甲醛熏蒸和紫外线灭菌。培养过程中出现杂菌污染，应立即将该污染试管或三角瓶中的培养物倒掉并将试管或三角瓶洗净，烘干备用。炼苗后也

10、可先将试管苗浸泡在有生根粉清水中1一2h，再移栽到驯化苗圃中。驯化过程中，除要注意环境湿度、温度和光照外，还要注意防止各种病虫害的发生。红蜘蛛和蚜虫，可喷施40的氧化乐果乳油1200倍液。黑斑病，喷施50多菌灵可湿性粉剂1000倍液。 海带愈伤组织培养海藻是一类生长于海洋的低等植物。多含有人类需要的生理活性物质，因此大多具有重要的经济价值。传统的海藻养殖多采用天然水域的人工养殖或人工捕捞手段，但是易受季节、气候、污染、地域等条件限制。因此，开展相关海藻人工组织培养具有重要意义。海藻组织培养最早可以追溯到20世纪50年代。我国在20世纪80年代开始藻体离体培养的研究，到了20世纪90年代，海带、

11、紫菜、石花菜、裙带菜等一些海藻的组织培养已获得了实际应用。藻体为褐色，带状，有光泽，长达23米，基部有固着用的假根。海带产于太平洋沿岸，我国辽宁、山东沿海都有分布。藻体可供食用或药用，是制碘工业的原料。 1选择适宜的培养用外植体：海带的藻体分为叶片、柄、假根三局部，叶状体下部细胞分裂旺盛，具有较高的形成愈伤组织的能力，因此一般选用这局部切块后作为组织培养用的外植体。2无菌处理：将切割获得的外植体洗干净后用酒精消毒处理。3愈伤组织诱导培养：前面步骤获得的外植体放人培养器中培养。培养愈伤组织和保存无性系固体培养基，扩培和使愈伤组织分化液体培养基。海藻培养用培养基主要成分海水。激素。1.4.1 概念

12、1.4.2 植物器官培养的应用举例1.4 植物器官培养植物器官培养是指将植株上的各种器官从母体上别离出来，放在无菌的人工环境中让其进一步发育，最终长成幼苗的过程。器官培养不仅是研究器官生长、营养代谢、生理生化、组织分化和形态形成等的很好方法在生产实际中也具有重要的应用价值。快速建立试管苗，实现名、特、优等珍贵品种快速繁殖；利用茎尖培养可以得到脱毒植株，解决马铃薯、甘蔗、大蒜、草萄、康乃馨等品种的退化问题；将植物器官做诱变处理，得到突变株，进行突变育种等。1.4.1 概念以马铃薯茎尖脱毒培养为例，简单介绍植物器官培养的应用。1.4.2 植物器官培养的应用举例图1-1 脱无毒试管苗生产程序试管苗繁

13、殖 试管苗切断到试管薯繁殖过程试管薯和微型薯比较(Atlantic 和Favorita不同光周期下形成的试管薯克新1号0，8，12，16h荷兰无花0，8，12，16h图4-2 不同浓度IAA与GAA、GA+BAPB互作对试管苗生长及试管薯形成的影响Fig. 4-2 Details of the interaction of various IAA concentrations with GA3 A and GA3 + BAP B on the growth and microtuberization of potato explants. 不同浓度茉莉酸对试管苗生长影响Favorita0，2，

14、20，50 mg/L 荷兰无花0，2，20，50mg/L茉莉酸通气条件和硝酸银对试管苗的影响从左向右：密封，密封硝酸银，通气，通气+硝酸银Favorita； 兰芽硝酸银盐胁迫下试管苗的生长0 20 40 60 80 mM0 20 40 60 80 mM1.5.1 无性系快速繁殖技术1.5.2 获得无病毒植株1.5.3 新品种选育1.5.4 在遗传、生理生化和病理等研究上的应用1.5.5 种质资源的保存1.5.6 产业化生产前景1.5 植物组织培养的应用由于试管繁殖周期短、繁殖系数高、不受季节限制，便于工厂化生产，20世纪80年代初，在世界范围内，植物组织、细胞培养形成了一个新兴的产业，如美国的

15、兰花试管苗，荷兰的花卉试管苗等。我国20世纪80年代初，投资完成了第一个甘蔗试管苗工厂。近年来，两广在试管繁殖香蕉方面也实现产业化，并出口国外，获得较好经济效益。1.5.1 无性系快速繁殖技术农作物如马铃薯、甘草、草莓,大蒜等。花卉，如康乃馨、菊花、郁金香、水仙、百合等不能通过种子途径去除病毒。对于花卉而言会影响花卉的欣赏效果，对于经济作物也会影响产量。如：病毒常使马铃薯减产50%左右；苹果减产1445 %，而且品质恶化、口感变差、不易储藏。1.5.2 获得无病毒植株突变育种利用培养的细胞诱发和筛选突变体有很多优点：首先，通过植物组织或细胞培养可以获得大量的可供选择的各种变异的群体，这些群体的

16、生长容易控制。在很短时间内完成突变体的筛选。在培养的细胞中选择突变体有利于在分子水平上研究突变机制。1.5.3 新品种选育缺乏之处是：在细胞水平上筛选的突变不一定都能在植株水平上表达。染色体不太稳定，再生能力容易丧失。除原生质体外，很难获得完全单细胞的材料。与微生物相比，植物细胞群体增殖时间较长，细胞易积聚在一起。原生质体融合和细胞杂交利用原生质体培养系统别离和鉴定各种突变体使通过单细胞的诱变和筛选突变体成为可能。悬浮培养的原生质体是比较均一的，可以在十分一致的条件下用诱变剂处理。并且还能以单细胞单位进行别离。可以克服远源有性杂交中的不亲和性，提供新的核质组合，从而获得新物种。缺乏之处是：在细

17、胞水平上筛选的突变不一定都能在植株水平上表达。染色体不太稳定，再生能力容易丧失。除原生质体外，很难获得完全单细胞的材料。与微生物相比，植物细胞群体增殖时间较长，细胞易积聚在一起。花药、花粉培养与单倍体植株组成花药的细胞有两种：一是体细胞，包括花药壁和隔组织的细胞；另一种是雄性性细胞，即小孢子。花粉是由花药内的花粉母细胞发育而来的，壁内含有雄配子。由于花粉的染色体只有体细胞的一半，因此通过花药培养的植株是单倍性的。单倍体植物没有显性基因的掩盖作用，易于选择，并能在很短时间内获得纯合二倍体植株，因此在育种实践中具有独特的优越性，花药培养也成为染色体工程遗传育种的一个有效途径。组织培养由于能快速、大

18、量地获得性状一致的实验材料，从而大大地推动了植物遗传、生理生化和病理等领域的研究进程。如植物组织培养有助于了解植物营养问题、进行光合作用理论研究、研究植物的抗病性、观察染色体的变异等。通过组织培养，可缩短育种年限和世代，也有利于基因突变中隐性突变的别离。1.5.4 在遗传、生理生化等研究上的应用利用植物组培和细胞低温保存等方法保存种质，可大大节省人力、物力，大大延长保存期。同时也便于种质资源的交换和转移，防止病害。例如：胡萝卜和烟草等植物细胞胞培养悬浮物可在20196的低温保存数月，而且还能恢复生长，再生成为植株。1.5.5 种质资源的保存花卉种苗产业化生产在花卉生产方面，种苗质量在栽培效果中

19、的重要性占50%以上。蔬菜、水果种苗脱毒马铃薯、食用百合、大蒜等蔬菜品种组培脱毒技术就可迅速恢复品种种性，提高生产力。瓜果组培苗产业化生产草莓易感染各种病毒病，感病果实畸形，品质差，一般减产3080%。对草酶进行热处理分生组织培养脱毒，去病毒苗品质好。1.5.6 产业化生产前景1.6.1 概念1.6.2 优势1.6.3 制作流程1.6.4 包埋介质条件及包埋方法1.6 人工种子人工种子就是最外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。由人工种皮、人工胚乳和繁殖体组成。外层胶囊状的固定化膜保护胚状体中的水分并能防止外部力量冲击，中间含有培养物所需的营养成分和某些植物激素，最内那么是被包裹的胚状体或芽。1.

20、6.1 概念采用人工种子进行快速繁殖便于运输和储藏。人工胚乳中可参加植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分等，优于天然种子，生产效率更高。固定杂种优势，加速良种繁育。作为植物基因工程和遗传工程的桥梁。保存珍贵品种。1.6.2 采用人工种子的优势1.6.3 人工种子的制作流程选取目标植物从外植体诱导愈伤组织愈伤转移到液体培养基愈伤在液体培养基中扩增愈伤转移到无激素培养基体细胞胚包裹人工种皮温室播种获得目标植物对于人工胚乳，理想的包埋介质应该满足：对所要包埋的材料无伤害。有足够柔软性，可保护繁殖体，并允许其发育。具有一定硬度，防止运输、操作过程中的伤害。具有穿透性，传递细胞生长所需的营养；并能容纳其

21、他附加成分，如防腐剂、杀虫剂等。利于用现有的温室或农机机械进行播种。1.6.4 人工种子的包埋海藻酸盐作为人工种子的包埋剂优点：它具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性极低、本钱低廉等优点。缺点：水性营养成分易流失、外表易结团等。人工种子的包埋方法主要有以下四种复合凝聚：指两种带相反电荷的电解质在水中相互作用形成多聚体包被溶液。界面聚合：在两相界面处因溶解度低而成膜。离子交换凝胶：经过离子交换而形成络合物成为凝胶。代表物质为海藻酸盐包埋。变温凝胶：高温下为液体，低温下为固体凝胶。因此可用各种模具塑造不同形状的胶块。1.7.1 特点分析1.7.2 生物反响器1.7 植物组织与器官的 生物反响器培养1.7.1 特点分析毛状根培养由于毛状根呈现多分支状态，易结团，因此会对反响器的混合和传质产生影响。毛状根对反响器的剪切力也比较敏感，过大的剪切力会造成毛状根生长点的坏死和培养物的断