基因组序列比对分析及相关软件的使用

1、WWW.Ggene.CnA 生物基因组序列比对分析，分子进化生物基因组序列比对分析，分子进化A 兔肝兔肝DNA的提取与二苯胺显色法测定的提取与二苯胺显色法测定DNA含量含量A 目的基因目的基因SNP位点的鉴定及其意义位点的鉴定及其意义综合性设计性实验综合性设计性实验-5-5此实验共包括如下三个部分此实验共包括如下三个部分1.第一部分：生物基因组序列比对分析，分子进化第一部分：生物基因组序列比对分析，分子进化2.第二部分：兔肝第二部分：兔肝DNA的提取和测定的提取和测定3.第三部分：目的基因第三部分：目的基因SNP位点的鉴定及其意义位点的鉴定及其意义WWW.Ggene.Cn第一部分：生物基因组序

2、列比对分析、分子进化第一部分：生物基因组序列比对分析、分子进化全基因组序列数据的积累全基因组序列数据的积累,使得不同生物之间的进化关系可以从分子水平上进行研究。使得不同生物之间的进化关系可以从分子水平上进行研究。不同于以往单纯依赖于生物形态学特征不同于以往单纯依赖于生物形态学特征,这种分析更加深刻更加本质。利用分子序列这种分析更加深刻更加本质。利用分子序列使得我们可以研究使得我们可以研究,从单细胞生物到植物、动物甚至人的进化关系。从单细胞生物到植物、动物甚至人的进化关系。 比较基因组学比较基因组学(Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的是基于基因组图谱

3、和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。目前从模式生物基因组研究中得出一些规律：模式生物基因组一般比较小，但编码目前从模式生物基因组研究中得出一些规律：模式生物基因组一般比较小，但编码基

4、因的比例较高，重复顺序和非编码顺序较少；其基因的比例较高，重复顺序和非编码顺序较少；其GC%比较高；内含子和外显子比较高；内含子和外显子的结构组织比较保守，剪切位点在多种生物中一致。的结构组织比较保守，剪切位点在多种生物中一致。WWW.Ggene.Cn比较作图就是利用共同的遗传标记（主要是分子标记、基因的比较作图就是利用共同的遗传标记（主要是分子标记、基因的cDNA克隆以及基因组克隆以及基因组克隆）对相关物种进行物理或遗传作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布情克隆）对相关物种进行物理或遗传作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布情况，提示染色体或染色体片段上的同线性（况，提示染色体或染

5、色体片段上的同线性（synteny）或共线性（）或共线性（collinearity），从而），从而对不同物种的基因组结构及基因组进化历程进行精确分析。基因组比较作图的研究，对不同物种的基因组结构及基因组进化历程进行精确分析。基因组比较作图的研究，不仅提示了同属甚至同科物种基因组间的同源性和差异性，对不同物种在起源、演化不仅提示了同属甚至同科物种基因组间的同源性和差异性，对不同物种在起源、演化过程中的变化的研究具有巨大的启示作用过程中的变化的研究具有巨大的启示作用 。比较作图的研究意义在于：一、根据不同种的基因组基因及其排列顺序的高度保守特比较作图的研究意义在于：一、根据不同种的基因组基因及其排

6、列顺序的高度保守特点绘制而成的比较图，可以研究和探明它们的进化线索。广泛的比较作图可为多个种点绘制而成的比较图，可以研究和探明它们的进化线索。广泛的比较作图可为多个种所用，建立它们之间的联系框架或系统。所用，建立它们之间的联系框架或系统。WWW.Ggene.Cn基因组比对软件基因组比对软件 Mauve/vista/index.shtml VISTAWWW.Ggene.Cn一个最基本的假设是地球上所有物种都一个最基本的假设是地球上所有物种都有一个共同的祖先，从这个祖先开始以有一个共同的祖先，从这个祖先开始以数状形式发展，通常称为生命之树数状形式发展，通常称

7、为生命之树（tree of life）。）。分子进化研究的目的：通过序列同源性分子进化研究的目的：通过序列同源性的比较，分析序列间的变化进而了解基的比较，分析序列间的变化进而了解基因的进化以及生物系统发生的内在规律。因的进化以及生物系统发生的内在规律。分子进化有两个主要研究对象，以全基分子进化有两个主要研究对象，以全基因组序列为研究对象分析物种进化；以因组序列为研究对象分析物种进化；以某基因在多个物种的同源序列为研究对某基因在多个物种的同源序列为研究对象分析基因的进化象分析基因的进化分子进化分子进化WWW.Ggene.Cn末端末端物种物种中间枝条中间枝条根根末端分支末端分支节点节点理论上，一个

8、理论上，一个DNA序列在物种形成或基因复制序列在物种形成或基因复制时，分裂成两个子序列，因此系统发育树一般时，分裂成两个子序列，因此系统发育树一般是二歧的；是二歧的；如果是一棵有根树，则树根代表在进化历史上如果是一棵有根树，则树根代表在进化历史上是最早的、并且与其它所有分类单元都有联系是最早的、并且与其它所有分类单元都有联系的分类单元，反映时间顺序；的分类单元，反映时间顺序；如果找不到可以作为树根的单元，则系统发生如果找不到可以作为树根的单元，则系统发生树是无根树，反映距离；树是无根树，反映距离；从根节点出发到任何一个节点的路径指明进化从根节点出发到任何一个节点的路径指明进化时间或者进化距离。

9、时间或者进化距离。系统发生树性质：系统发生树性质：WWW.Ggene.Cn基因分子进化分析步骤基因分子进化分析步骤（1）以目的基因为种子序列，搜索其在其它物种中的同源序列）以目的基因为种子序列，搜索其在其它物种中的同源序列WWW.Ggene.Cn（2 2）将上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比对，）将上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比对，Clustal XWWW.Ggene.Cn（3）构建系统发生树：）构建系统发生树：MEGA，PHYLIP，PAUPhttp:/ WWW.Ggene.Cn（4 4）评价所建立的树，分析其生物学意义）评价所建立的树，分析其生物学意义实验目的实验目的学习从动物组织

10、中提取学习从动物组织中提取DNA及其含量、纯度测定的原理和方法及其含量、纯度测定的原理和方法 掌握离心机及岛津掌握离心机及岛津UV-120的使用方法的使用方法第二部分：兔肝脱氧核糖核酸（第二部分：兔肝脱氧核糖核酸（DNA）的提取和测定）的提取和测定利用脱氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在电解质中不同的溶解度使二者分离，在利用脱氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在电解质中不同的溶解度使二者分离，在0.15M的氯化钠溶液中脱氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在的氯化钠溶液中脱氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在0.15M氯化钠中溶解，因此可利用不同浓度的氯化钠溶液将核酸核蛋白、脱氧核氯化钠中

11、溶解，因此可利用不同浓度的氯化钠溶液将核酸核蛋白、脱氧核糖核酸蛋白解离出来，而蛋白质变性沉淀，再用氯仿异丙醇抽提，将蛋白质沉糖核酸蛋白解离出来，而蛋白质变性沉淀，再用氯仿异丙醇抽提，将蛋白质沉淀除去，而淀除去，而DNA则溶解。则溶解。实验原理实验原理实验操作实验操作1. 弃上清留沉淀弃上清留沉淀兔肝兔肝称取称取4 g 加加8ml 1X SSC1X SSC洗洗两次两次取取8ml匀浆液匀浆液离离 心心匀浆、过滤匀浆、过滤2.弃上清留弃上清留沉沉淀淀加至加至8ml 1X SSC离离 心心加至加至 8ml 0.15MNaCl-0.1MNa2EDTA离离 心心3.弃上清留沉淀弃上清留沉淀（脱氧核糖核蛋白

12、）（脱氧核糖核蛋白）加约加约2倍倍体积体积95% 乙醇乙醇沉淀沉淀加加 0.15MNaCl-0.1MNa2EDTA至至4ml搅拌搅拌10min逐滴加入逐滴加入0.5ml 15% SDS加加1ml5M NaCl去塞！离心去塞！离心加塞反复加塞反复倒置抽提倒置抽提10min吸取上清液吸取上清液勿吸到中间层！勿吸到中间层！等体积氯仿等体积氯仿-异异丙醇混合液丙醇混合液DNA析出析出用玻棒挑出用玻棒挑出挑取挑取DNA至一离至一离心管心管(小烧杯小烧杯)用用10ml 0.01N NaOH溶解溶解重复重复一次一次轻搅轻搅10min注意事项注意事项尽可能避免尽可能避免DNADNA的断裂的断裂 1. 1. 匀

13、浆时应保持低温，且匀浆时间应短；匀浆时应保持低温，且匀浆时间应短； 2. 2. 实验中使用的吸取实验中使用的吸取DNADNA水溶液的滴管口应粗短并成钝口。水溶液的滴管口应粗短并成钝口。保持保持DNADNA活性，避免酸碱或其他变性因素使活性，避免酸碱或其他变性因素使DNADNA变性。变性。搅动不要太大，以免使搅动不要太大，以免使DNADNA断裂。断裂。整个实验过程应在低温条件下进行。整个实验过程应在低温条件下进行。搅拌时动作要轻，反复倒置抽提，不可激烈振荡。搅拌时动作要轻，反复倒置抽提，不可激烈振荡。加入加入15% SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。时要慢，边搅边滴加（两人配合）。SDS的温

14、度不能太低，易凝固。吸过的温度不能太低，易凝固。吸过SDS的吸管要及时清洗。的吸管要及时清洗。加入加入CHCl3/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相液离心后，分为三层，由上到下为：无机相-蛋白相蛋白相-有机相。有机相。DNA溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要吸到蛋白相。溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要吸到蛋白相。CHCl3/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必须冲洗干净。会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必须冲洗干净。离心机的使用离心机的使用打开电源开关；打开电源开关；平衡放置离心管；盖上盖子。平衡放置离心管；盖上盖子。调节时间旋钮至调

15、节时间旋钮至10min；缓慢调节速度旋钮至缓慢调节速度旋钮至9档，每档，每5-10s上升上升1档；档；离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。离心管必须平衡后，才能启动离心机；离心管必须平衡后，才能启动离心机；离心机的盖子必须盖紧；离心机的盖子必须盖紧；离心过程中不要用重物撞击离心机；离心过程中不要用重物撞击离心机；要等离心机完全停止转动后再打开盖子。要等离心机完全停止转动后再打开盖子。二苯胺显色法测定二苯胺显色法测定DNA含量含量DNA的的-脱氧核糖在酸性条件下转变成脱氧核糖在酸性条件下转变成-羟基羟基-r酮基戊醛，

16、与二苯胺共热后酮基戊醛，与二苯胺共热后形成蓝色化合物，该化合物在形成蓝色化合物，该化合物在595nm处最大吸收。处最大吸收。每每ml含含20400g范围内光密度与范围内光密度与DNA的浓度成正比。反应液中加入少量乙的浓度成正比。反应液中加入少量乙醛，可提高反应的灵敏度。醛，可提高反应的灵敏度。实验原理实验原理取取8支试管，按实验指导的表格加入试剂。支试管，按实验指导的表格加入试剂。加毕置沸水浴加毕置沸水浴10分钟，取出冷却；以分钟，取出冷却；以0号管（空白管）调零点，于号管（空白管）调零点，于595nm波长比色。波长比色。以光密度为纵坐标，以光密度为纵坐标，DNA含量（含量（g/ml）为横坐标

17、，绘制标准曲线）为横坐标，绘制标准曲线.将实验中所得到的兔肝将实验中所得到的兔肝DNA溶液作为待测样品，取两只试管，分别标溶液作为待测样品，取两只试管，分别标“U”和和“B”，按，按表加入试剂。表加入试剂。混匀，置沸水中混匀，置沸水中10min, 取出冷却。取出冷却。在在595nm处，以处，以B管调零，测得待测液的光密度值，从标准曲线上查出相当于该光密度管调零，测得待测液的光密度值，从标准曲线上查出相当于该光密度值值DNA的含量。的含量。实验操作实验操作核酸在核酸在220-320nm处呈特征性吸收，在处呈特征性吸收，在260nm处有最大吸收，测处有最大吸收，测A260/A280可可得知核酸的大

18、致纯度。得知核酸的大致纯度。 A260/A280 1.8 表示表示DNA纯纯 1.8 RNA含量高含量高 1.8 蛋白含量高蛋白含量高核酸紫外吸收光谱的测定核酸紫外吸收光谱的测定双波长分光光度计，该种机采用两个光源，可在可见光和紫外区对物质进行双波长分光光度计，该种机采用两个光源，可在可见光和紫外区对物质进行分析，钨丝灯发出光的适宜范围在分析，钨丝灯发出光的适宜范围在3601000nm，氘灯发出光的适宜范围在，氘灯发出光的适宜范围在150400nm。 通过两种光源的切换，可以在两种波长范围内使用。通过两种光源的切换，可以在两种波长范围内使用。使用石英杯作为比色杯。使用石英杯作为比色杯。岛津岛津

19、UV-120分光光度计分光光度计打开电源，指示灯亮，调至打开电源，指示灯亮，调至UV，打开样品室盖，打开样品室盖打开氘灯（向下按至打开氘灯（向下按至Heat几秒后扳至几秒后扳至ON）预热预热10min调节波长、灵敏度调节波长、灵敏度旋扭调至旋扭调至“0-100%T”，放入空白管与样品，调，放入空白管与样品，调0% T盖上盖子，旋扭调至盖上盖子，旋扭调至“ABS 0-2”，调，调0% A 拉出样品，读数。开盖，记录。拉出样品，读数。开盖，记录。岛津岛津UV-120使用方法使用方法以以0.01N NaOH 为空白管，在为空白管，在260nm和和280nm波长处测定样品液的吸光度，求出样波长处测定样

20、品液的吸光度，求出样品液的品液的A260/A280比值和比值和DNA浓度。浓度。实验操作实验操作WWW.Ggene.Cn第三部分：目的基因第三部分：目的基因SNP位点的鉴定及其意义位点的鉴定及其意义SNP(single nucleotide polymophism) 即单核苷酸多态，是指群体中变异频率大于即单核苷酸多态，是指群体中变异频率大于1 %的单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态，包括置换、颠换、缺失和插入。的单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态，包括置换、颠换、缺失和插入。一般来说，一个一般来说，一个 SNP 位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基

21、因。SNP在人基在人基因组中的发生频率比较高，大约平均每因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。个碱基中就有一个多态位点。WWW.Ggene.CnSNP对基因功能影响对基因功能影响根据在基因中的位置，根据在基因中的位置，SNP 可分为基因编码区可分为基因编码区SNP(coding SNP, cSNP)、基因内含子区、基因内含子区SNP和基因调控区和基因调控区SNP(regulatory SNP, rSNP)。其中。其中cSNP根据是否改变编码的氨基酸又根据是否改变编码的氨基酸又可分为同义可分为同义cSNP (synonymous cSNP)和非同义和非同义cSNP

22、(non-synonymous cSNP)。非同义非同义cSNP：，蛋白激酶：，蛋白激酶PRKCH基因内的一个非同义基因内的一个非同义cSNP(1425G/A)，等位位点从，等位位点从G到到A 的改变可导致激酶的活力增强，进而激活其信号通路，使患脑梗塞的风险增加。的改变可导致激酶的活力增强，进而激活其信号通路，使患脑梗塞的风险增加。同义同义cSNP：多向性耐药基因：多向性耐药基因1(MDR1)第第3435 位的一个同义位的一个同义SNP(3435C/T)可改变可改变MDR1 基因产物的功能。这种机制不是通过改变基因产物的功能。这种机制不是通过改变mRNA 及蛋白的产量水平，而是通过改变及蛋白的产量水平，而是通过改变mRNA 的构象、蛋白的折叠及细胞定位，进而影响基因功能的发挥。的构象、蛋白的折叠及细胞定位，进而影响基因功能的发挥。内含子区内含子区SN