海洋生物技术整理

1、v 第一章 海洋生物技术概论v 本章思考题v 1 什么是生物技术？生物技术的重要性体现在哪些方面？v 2 什么是海洋生物技术？海洋生物技术的研究重点都有哪些？ v 本章重点提示：生物技术的概念、内容；生物技术的特点和重要性；海洋生物技术的定义及其研究内容1. 生物技术(Biotechnology, BT), 又称为生物工程（bioengineering), 现统一称: 生物技术。1) 生物技术定义 i. 传统定义：应用生物科学及工程学原理，依靠生物体系作为反应器，将物料进行加工改造，获得人类所需产品的技术。ii. 现代生物技术定义： 以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起

2、，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)的综合性科学技术。2) 要点: 对象是具遗传特性的生命类物质:包括病毒、细菌、植物、动物以及人类。 生物体系多个不同水平研究: 从大分子(DNA，RNA，蛋白质，酶)、亚细胞、细胞、组织、器官到整个机体。 应用工程学原理: 经人类思维, 设计方案、定向修饰、加工制作过程、经过体外环节。 有目的产品: 目的产品有三新特征: 新遗传功能、新遗传性状、新物种。要有合乎人类所需的工业、农业、医疗和食品产品。 高新技术起重要作用。3) 生物技术的发展（包括传统生物技术和现代生物技术）i. 传统生

3、物技术 l 传统生物技术的特点： 主要通过微生物初级发酵获得产品，局限在微生物发酵和化学工程领域。没有改变微生物的遗传物质，也没有产生新的遗传性状。生产过程简单，上游主要是微生物的发酵培养及产品转化，通过诱变选育良种；下游主要对产品进行纯化。生产周期长，费用高，产量低，效率差。ii. 现代生物技术 l 现代生物技术的四大支柱l 基因工程 （核心和关键、主导技术）、 细胞工程 （基础）、 酶工程 （条件）、 发酵工程 （产品获得手段）、生化工程 (分离、纯化、衍生 )4）生物技术的特点 (八高一低) a) 高水平：即学科具有先进性，是知识、技术密集型产业, 处分子水平、新技术前沿。b) 高综合：

4、跨学科专业, 位多学科发展的交叉点上，涉及的行业多、范围广。c) 高投入：与其他技术比较, 在资金、人员、设备、试剂及研发上投资大。d) 高竞争：各国、各行业、个单位之间，在技术、时效性、知识及人才上竞争激烈。e) 高风险：上述原因造成一定风险，加上技术风险带来高风险。f) 高效益, 应用性强, 有目的产品, 易商业化。 如干扰素的投入虽然高达数百万美元,但产值数年达30亿美元, 用于治病将产生巨大经济和社会效益。生物技术在解决人类面临众多难题上是没有任何产业可比的。 g）高智力： 具有创新性和突破性, 可按人类需要定向改变和创造生物的遗传特性，要求在人才、计划、设计、工艺和产品上都要与众不同

5、。从认识、利用、再造阶段上升到改造和创造阶段。 h) 高控性：采用工程学手段，易自动化、程控化及连续化生产 I ) 低污染：生物技术以生物资源为对象, 生物资源具有再生性, 是再生资源。具有不受限制、污染小、周期短的优点。 5）生物技术的内容医学生物技术；药学生物技术；动物生物技术；农业生物技术；海洋生物技术；微生物生物技术 v 生物技术的上、中、下游l 上游工程：实验室研究和开发阶段，包括基因、细胞、干细胞、转基因生物、组织工程等获得优良菌株、细胞系或固定化的菌体等。l 中游工程：中游加工以生物反应器为中心，优化和放大生产工艺。l 下游工程：从反应液中提取目的产物，加工精制成合格产品。v 生

6、物技术涉及的具体技术包括: 1. DNA 重组技术, 细胞培养及融合技术, 抗体制备技术,2. 干细胞培养及定向分化, 显微注射技术, 动物饲养技术,3. 转基因技术, 胚胎克隆, 细胞及酶的固定化技术,发酵技术,4. 生物反应器, 蛋白质分离纯化, 生物大分子合成及纯化,5. 生物大分子修饰, 生物物理、生物信息及其他相关领域技术。v 生物技术诸工程的内容及种类( 十大工程 ) (一) 基因工程 (Gene engineering)（见幻灯片P46）1.对象: 在核酸分子 (DNA或RNA) 或基因上操作。2. 定义: 在体外对DNA进行切割、拼接, 使遗传物质重新组合, 经载体转移到细胞中

7、扩增表达, 获得人类所需产品, 或组建新生物类型的技术。 文献上常见到DNA重组、分子克隆、基因克隆、 遗传工程等名词与基因工程混用, 事实上主要内容相似, 不同之处在于所突出的内容有异。(二)细胞工程 (cell engineering) 1.对象: 细胞, 在细胞水平上实现基因转移或改变生物学性状。2. 定义: (1)广义（细胞融合技术）：在特定的条件下 (环境、融合技术), 使不同的细胞融合, 获得具有来自双亲代基因的杂交细胞, 杂交细胞的遗传物质发生改变, 达到改造物种、创建新种的目的。 (2) 狭义（淋巴细胞杂交瘤技术）：骨髓瘤细胞淋巴细胞融合(制备单克隆抗体，McAb)。 (3)

8、现代概念: 将广义的概念延展, 指在体外条件对细胞进行培养、繁殖，按人们的意愿改变细胞某些生物学特性，获得有用的产品或达到改良生物品种的技术。 细胞工程包括： 细胞融合技术； 工程细胞移植, 即有目的地改造细胞遗传特性后, 植入机体； 细胞拆合； 染色体导入及细胞器导入技术； 胚胎细胞植入。3. 分类: 微生物细胞工程, 如原生质体融合, 试管菌。 植物细胞工程，如1978年培育出土豆西红柿新物种。 动物细胞工程, 单克隆抗体制备技术。 4. 应用: 单克隆抗体制备成绩突出, 诊断、治疗。幻灯片P51(三) 蛋白质工程 (Protein engineering)1.对象:基因序列DNA分子中改

9、造, 最终导致蛋白分子氨基酸序列改变。2. 定义: 在利用X衍射和晶体分析技术了解蛋白质三维空间结构和功能关系基础上, 借用计算机和分子设计辅助技术, 在DNA分子水平上操作更换或改变其序列, 达到改变蛋白质分子氨基酸序列, 从而改变蛋白质分子形状及功能, 使之具有新遗传学特性。 (四）抗体工程 （Antibody engineering ） 1.对象：免疫球蛋白（Ig） 基因 2.定义： 通过对抗体分子结构和功能关系的研究，有计划地对抗体基因序列进行改造，改善抗体的某些功能的技术。如基因工程抗体技术。 在80年代初，抗体基因结构和功能的研究成果与重组DNA技术相结合，产生了基因工程抗体技术。

10、v 基因工程抗体即将抗体的基因按不同需要进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表达的抗体分子。 3.抗体工程的内容v 完整抗体，及抗体的人源化 v 完整抗体与抗体片段的药代动力学比较 v 改造抗体片段的多种特异性 v 双功能抗体 v 抗体库的构建、展示和筛选 v 噬菌体展示技术 v mRNA-蛋白质复合物库 v 细胞表面库 v 转基因鼠 v 抗体的生产、稳定性和表达水平 v 亲和力成熟 v 骨架替换 临床应用 v 中和病原体及抗病毒治疗 v 细胞内抗体 v 肿瘤治疗与细胞补充疗法 v 疫苗应用 v 用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术 (五) 组织工程 (Tissue engi

11、neering) 1. 对象：干细胞、组织和器官。 2.定义：运用工程学和生命科学原理和方法， 在了解正常和病理学组织结构与功能关系和生长机理的基础上，研制生物学组织器官替代品，通过移植，达到重建、恢复、维持和改进组织功能学科。3.要点： 依据正常组织结构、功能设计方案； 选择种子细胞培养； 选择细胞外基质、生物支架材料； 体外构建三维结构替代品； 植入机体，替代病理组织。4.应用： 组织器官移植。(六)干细胞工程 (stem cell engineering)u 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。u 根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干

12、细胞。u 根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。 干细胞的主要特征：v 未分化的早期细胞；v 具有分化成各种特定细胞的能力；v 可无限地分裂增值，产生大量后裔;v 其子细胞有两种命运，保持为干细胞或分化为特定细胞。v 克隆技术见幻灯片P65 (七) 转基因动物(亦称: 胚胎工程 Transgenetic animal） 1.对象: 胚胎早期细胞上实现基因转移。 2. 定义: 把新的遗传信息 (DNA序列) 用特定技术导入胚胎早期受精卵, 经发育后, 外源遗传信息分布到所有体细胞生殖细胞中去, 这种使动物带有新遗传信息的基因转移技术称胚胎工程。所得动物称转基因动物。3

13、. 过程: 提取人所需要蛋白质基因、cDNA； 基因重组 (cDNA控制基因载体)； 分离、培养人工受精的卵细胞(如牛)； 把重组体转入到受精的卵细胞； 植入子宫 ,使之发育为个体(每一个体细胞均含有新的基因)； 活化植入新基因,使之表达 (如在乳腺中表达)； 提取目的基因表达产物,进行验证(定性、定量)； 进行安全性及临床试验。4. 要点: 必须有外源新基因转移； 在早期生殖细胞整合； 发育成新个体中有外源基因正常表达； 可遗传后代。(八) 生物医学工程 ( Biomedical engineering) 1 对象: 人体 2 定义: 从工程学角度研究人体结构、功能及生命现象, 为防治疾病提

14、供新技术、 新方法、新仪器和新材料的科学。 3 内容: 生物材料( 人造器官、起搏器的材料)、康复工程、医学成像( 超声、CT、 核磁)、生物传感、监护系统等。(九) 生物制药化学制药工程 (Biochemical pharmaceutical engineering) 1生产对象: 药物( 活性多肽、酶、抗生素等)2定义 利用现代生物技术, 以生物反应器（微生物、动物细胞、植物及动物个体）， 大规模地制备高纯度的药物。 如基因工程药物、同份异构体的拆分（利用抗体酶特异结合、特异地进行酶消化来完成）等。(十) 酶工程 (Enzyme engineering)1.对象: 酶分子修饰、生产应用和酶

15、的固定化2. 定义: 在给定的生产工艺和生物反应器中, 利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造提高酶的转化率, 把对应的原料高效地转化成所需有用的物质。3. 要点: 固定化酶、酶分子修饰和酶反应器的设计是当前酶工程的重点。 近年把酶电极生物传感器也归到酶工程范围内。如: 底物固定化酶化学信号电信号人视觉控制反应。 (十一) 发酵工程 (Fermentation engineering)1.对象: 微生物。在常规发酵工艺上发展而成。有时也称微生物工程。2. 定义: 利用微生物的特点（生长快、培养简单和代谢过程特殊等）, 通过现代化工程技术, 快速、连续生产人类所需物质的技术

16、。3. 要点: 核心是提高产率。 过程包括: 菌种选育、生产、代谢产物的利用。 所用技术包括大规模悬浮培养,细胞固定化, 产物分离提取。 4应用: 药物生产( 活性多肽、抗生素)、单细胞蛋白生产、环境保护、微生物冶金技术。 (十二) 生化工程 (Biochemistry engineering) 1 对象: 生化反应器(反应环境与装置)， 产品的分离提纯技术 2.定义: 为活细胞和酶提供适宜反应环境, 能大规模自动化生产、分离、精制出所需产品的技术。 3.内容包括:生物反应器的设计、传感器的制造、电泳、离心、层折、免疫层析等。这是下游工程的关键一环。注：1.十二大工程相互联系, 相辅相成。6）

17、生物技术的重要性v 有助于解决全球的重大难题：资源（能源）、人口、粮食、生态环境、健康与疾病和战争与灾害；v 促进传统产业的技术改造和新产业的形成，对人类社会生活产生深远的革命性影响；v 生物技术正迅速走向老百姓日常生活各个方面, 将对人类的发展做出贡献。2. 海洋生物技术1）. 定义：海洋生物技术是运用海洋生物学与工程学的原理和方法，利用海洋生物或生物代谢过程生产有用的生物制品或定向改良海洋生物遗传特性的综合性科学技术。 2）. 海洋生物技术的研究内容：主要以海洋生物为对象，综合应用基因工程、细胞操作技术和细胞培养技术等手段，对海洋生物资源进行研究、开发利用和保护。 开发、生产和改造海洋生物

18、天然产物，以便用作药物、食品、新材料； 定向改良海洋动物、植物遗传特性，为海水养殖业提供具有生长快、品质高和抗病害的优良品种； 培养具有特殊用途的“超级细菌”，用来清除海洋环境的污染，或者生产具有特定生物治理的物质。 主攻方向：利用生物技术，改良具有重要经济价值的海水养殖生物遗传特性 。3海洋生物技术研究的新发展 探索有价值的海洋生物种群； 利用生物技术开发新的海洋动植物优良品种，用于水产养殖业； 利用海洋生物技术从天然生物中提取加工各种化工产品； 从基因工程理论上阐明生物的特殊功能，并在可能的范围内加以利用； 用基因工程理论阐明海洋生态系统存在与发展的规律，并对其进行人为的控制； 建立海洋生

19、物利用系统，包括海水养殖新技术和海洋生物生产系统v 第 二 章海洋动物细胞工程思考题v 1 名词解释：细胞工程、原代培养、传代培养、细胞株、细胞系、细胞融合、连续细胞系、组织工程、无限细胞系、有限细胞系v 2 简述tPA的制备过程。v 3 简述动物细胞培养方式和操作方式。v 4 动物细胞生物反应器必须具备哪些要求？有哪些类型？特点是什么？一、1. 细胞工程的概念应用细胞生物学、遗传学、发育生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计和需要，通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植，以及组织、细胞培养等方法，在细胞整体水平或细胞器水平改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品，甚至培养出新物种的一门综

20、合性生物工程技术科学。2. 细胞融合技术：细胞融合，又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的现象。v 体外用人工方法使两种细胞融合，制成一种新品系的杂交细胞，筛选出的杂交细胞有很强的生命力，增殖也很旺盛。常用的细胞融合诱导物是仙台病毒和聚乙烯丙醇（PEG）。l 思考讨论：为什么使用的病毒需要灭活？不灭活不行吗？答：因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。3、原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。4、传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出

21、，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。5、细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。6细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。 7、转化细胞系（连续细胞系）： 通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的或人工的，从肿瘤组织中分离。

22、8、原代培养物经首次传代成功后即为细胞系， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限， 可称为有限细胞系， 如可以连续培养， 则称为连续细胞系(无限细胞系)， 培养50代以上并无限培养下去。二、1、组织纤溶酶原激活剂（tPA）生产工艺： 组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，与纤维蛋白结合后形成的复合物可使纤溶酶原活化为纤溶酶。 纤溶酶可水解纤维蛋白，导致血栓溶解，故对血栓性疾病有较好疗效。 人黑色素瘤细胞株培养后可产生大量的tPA，其培养液中tPA浓度可达到1毫克/升。1）工艺流程 细胞单层 、细胞悬液、 细胞培养物、 培养液、提取液、 层析液、 浓缩液、

23、层析液、 tPA成品2）工艺过程A 培养基配制；B tPA抗体制备；C 抗tPA亲和吸附剂制备；D 细胞培养；E tPA的分离；F 精制。 （1）t-PA抗体的制备 v 取人t-PA、或者猪心t-PA按每只家兔200-300ug的计量，t-PA采用福氏完全佐剂充分乳化，注射入家兔皮下。每隔2周再用t-PA100ug进行加强免疫，共加强2次取家兔血清用50%硫酸铵盐析沉淀物于0下，用生理盐水透析经过Sephadex 75柱层析得到抗t-PA的免疫球蛋白IgG备用 （2）抗t-PA的亲和吸附剂的制备 A、Sepharose 4B的活化B、抗t-PA的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes

24、-4B亲和吸附剂）的制备v A、Sepharose 4B的活化 v Sepharose 4B用10倍体积的蒸馏水（V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽滤取20克Sepharose 4B湿凝胶放入500ml的三颈烧瓶中，加蒸馏水30ml，搅均匀后，用2mol/L的NaOH溶液调节PH=11，降温至18在通风橱中，另取溴化氰1.5g于乳钵中，加入30-40ml蒸馏水分多次研磨溶解将溴化氰溶液倒入三颈烧瓶中，升温至20-22，同时滴加2mol/L的NaOH溶液调节PH=11-12等反应液PH值不变时，继续反应5分钟，取出烧瓶，向其中投入小冰块降温，用3号垂熔漏斗抽滤用300ml、4、0.1mol/L的NaH

25、CO3溶液洗涤。然后用300ml、PH=10.2、0.025mol/L的硼酸缓冲液分3-4次抽滤洗涤最后转移至250ml的烧瓶中，加入50-60ml的硼酸缓冲液，即得活化的Sepharose 4B，备用 v B、抗t-PA的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备 v 取步骤-2中的抗t-PA的免疫球蛋白IgG，70-80mg溶于20ml硼酸缓冲液中、过滤。滤液加入到已经活化的Sepharose 4B中，10下搅拌反应16-18小时第二天装柱，用10倍柱床体积（V/V）、PH=10.2的硼酸缓冲液，以5-6ml/min的流速洗涤柱床。收集流出液，测定其A280用

26、5倍柱床体积（V/V）的、PH=10.0、0.1mol/L乙醇胺溶液洗涤柱床用5倍柱床体积（V/V）的、PH=8.0、0.1mol/L硼酸缓冲液洗涤柱床用5倍柱床体积（V/V）的、PH=7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤平衡。直到流出液的A280小于0.01，所得到的固定化抗t-PA的免疫球蛋白IgG，就是待提取的t-PA的亲和吸附剂。将其转移至含0.01%NaN3的、PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液中，于4下贮存，备用。 （3）细胞培养 v 取5L玻璃转瓶，按每平方米表面积2.5L的比例加入细胞培养液。 将人黑色素瘤细胞按常规方法消化分散、洗涤、计数、稀释成细胞悬液。 将细胞悬

27、浮液接种到转瓶之中，接种浓度为1033×103个/ml 置于CO2培养箱中，37下培养、通入含5%CO2的无菌空气 等到长成致密单层之后，弃去培养液，用PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤细胞单层23次。 换入无血清Eagle培养液继续培养 每隔3 4天收获一次培养液，用于制备t-PA。同时向转瓶中加入新鲜培养液继续培养 如此反复，可获得大量t-PA。（4）t-PA的分离 v 步骤-4中所收集到的培养液中，加入蛋白酶抑制剂aprotinin至5万单位/ml。加吐温-80至于0.01%、过滤、除去沉淀.滤液稀释3倍 稀释液上柱，以5ml/min的流速进入t-PA-IgG-Se

28、pharoes-4B亲和柱（直径4cm*长度40cm）。 用含0.01%的吐温-80 + 2.5万单位/ml的蛋白酶抑制剂aprotinin +0.25mol/L的KSCN的PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液以同样的流速洗涤亲和柱，以除去杂蛋白 最后用3mol/L的KSCN溶液洗脱亲和柱，以每管10-15ml的体积进行分区收集合并t-PA的洗脱峰， 装入透析袋内，埋入到PEG20000中浓缩至原体积的1/10-1/5。 各t-PA粗提物 （5）t-PA的精制 v t-PA粗提物进Sephadex-G-150柱（直径2cm*长度100cm）用含0.01%的吐温-80的1mol/L的NH4

29、HCO3溶液以2-3ml/min的流速进行洗脱以每管10-15ml的体积进行分区收集合并t-PA的洗脱峰，于冻干机中进行冻干得t-PA精品 2、动物细胞的大规模培养方法（细胞培养方式） 按照实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。1）、悬浮培养v 优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。v 缺点：体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气升式。2）、贴壁培养v 优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。v 缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。3）、贴壁-悬浮培养(固

30、定化培养)v （1）微载体培养，优点：可创造相当大的贴附面积，载体体积较小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，发挥悬浮培养的特长。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当（1.0301.045g/ml）、粒径均一，在60250 mm之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分。v （2）包埋和微囊培养，包埋或包裹在凝胶载体和微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；通过控制微囊膜的孔径可使产品浓缩在微囊内有利于下游处理；可采用多种生物反应器进行大规模培养。v （3）结团培养，利用细胞本身作为基

31、质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养。优点是操作简单、节省微载体用量。3、动物细胞培养的操作方式v 分批式、流加式、半连续、连续式、灌注式、细胞工厂培养，见发酵工程相关内容。4、动物细胞生物反应器必须具备哪些要求？有哪些类型？特点是什么？v 必须具备的基本要求：材料是无毒性的；结构性能良好；密封性能良好；理化参数能自动检测；能长期运作；容器无死角；维修方便；设备成本低。 v 反应器类型及特点： 1)搅拌罐式生物反应器：主要用于是悬浮细胞培养，微载体培养，微囊和巨载体培养以及结团培养 2)气升式生物反应器：气体通过装在罐底的喷管进入 反应器的导流管，致使

32、该部液体的密度小于导流管外部的液体形成循环流。3)中空纤维式生物反应器：占地空间小，产品产量、质量高，生产成本低，不能重复使用，不能耐高压蒸汽灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌，难以取样检测。4)透析袋或膜式生物反应器：可使细胞达到高密度 ，又可随意组合进行操作，对产品进行浓缩纯化。5)固定床或流化床生物反应器：结构简单，装填材料易得。第三章抗体工程v 复习题 v 1名词解释：抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体v 2 什么是单克隆抗体？其特性和局限性如何？与多克隆抗体有何异同？v 3 杂交瘤细胞的克隆方法有哪些？v 4 大量制备单克隆抗体的方法有哪些，各有哪些优缺点？v 5单

33、克隆抗体的性质鉴定的方法有哪些？v 6 简述单克隆抗体的制备流程和应用。v 7 什么是免疫球蛋白？与抗体的区别是什么？一、1. 抗体：是指机体受抗原刺激后产生的能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。v 抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。B淋巴细胞与抗体的关系： Ø B淋巴细胞受抗原刺激后，可产生抗体。Ø 动物体内的B淋巴细胞可产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。Ø 每一个B淋巴细胞只能分泌一种特异性抗体。2. 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，所以常规抗体是多个不同

34、抗原决定簇抗体的混合物。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。3. 单克隆抗体（Monoclonal Antibody，McAb）即单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。4. 克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。这种群体细胞的生物学特性和功能完全相同。5. 基因工程抗体(Genetic engineering antibody) ：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或

35、修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体等。二、1. 什么是单克隆抗体？其特性和局限性如何？与多克隆抗体有何异同？答： 单克隆抗体（Monoclonal Antibody，McAb）即单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。 l 优点 ：a) 在体外“永久”地存活并传代；b) 用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体；c) 适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法；d) 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。l

36、局限性 ：a) 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围；b) 反应强度不如多克隆抗体；c) 制备技术复杂、费时费工、价格较高。l 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。2. 杂交瘤细胞的克隆方法有哪些？答：有限稀释法和软琼脂培养法（1）有限稀释法材料：a、96孔细胞培养板等；b、HT培养基；c、活力强的杂交瘤细胞；d、小鼠腹腔细胞。方法：a、制备小鼠腹腔细胞。同“细胞融合”一节中的方法。b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞三种不同的稀释度。c、按每毫升加入5×104-1×105细

37、胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。e、37、7.5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。g、本法中（b）、（c）、（d）也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。（2）、软琼脂培养法材料：a、HT培养基（双倍浓度）。b、用0.15mol/L NaCl配

38、制的2.0%琼脂糖：称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4保存。c、小鼠腹腔细胞。d、灭菌平皿。e、45水浴。f、活力很好的杂交瘤细胞。方法：a、在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。b、临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45水浴中温育。c、吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。d、取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层。e、37、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆

39、，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。f、吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。3. 大量制备单克隆抗体的方法有哪些，各有哪些优缺点？答：目前制备的方法主要有两种：动物体内诱生法和体外培养法。（1） 体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。优点：该法操作简便、经济。缺点：腹水中常混有小鼠的各种杂种蛋白质，因此很多情况下要提纯后才能使用，而且有污染动物病毒的危险。（2）

40、体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。优点：抗体单一，比较纯缺点：制备单抗量极为有限，不适用于单抗的大规模生产，要想体外大量生产就必须进行杂交瘤细胞的大量培养。单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗浓度就越高，产量就越大。4. 单克隆抗体的性质鉴定的方法有哪些？答：1. 杂交瘤细胞鉴定：染色体分析、抗体稳定性分析、外原因子检查。2.单抗进行Ig的类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。3.亲和力鉴定 常用

41、方法：相对亲和力测定和亲和常数测定4.纯度含量测定 纯度一般用SDS-PAGE 或层析法测定5.活性测定 测效价6.识别抗原位点测定 7.特异性、交叉反应性测定5. 简述单克隆抗体的制备流程和应用。答：（1）、流程：动物免疫细胞融合杂交瘤细胞的筛选单抗的检测杂交瘤细胞的克隆化、冻存单抗的鉴定（2）、应用：用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记 单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定；用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。作为体制备导向药物。但是要解决以下两个问题：鼠源性单克隆抗体的免疫原性；完整的

42、抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。基因工程技术为解决这两个问题提供了可能。6. 什么是免疫球蛋白？与抗体的区别是什么？答：20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现与抗体结构类似的球蛋白， 统称为免疫球蛋（immunoglobulin，Ig）。区别：1964年，世界卫生组织举行专门会议，将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白(Ig)。因而免疫球蛋白是结构及化学的概念，而抗体是生物学及功能的概念。可以说，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗体。第四章海洋藻类细胞工程复习题v 1.名词解释：细胞的全能性

43、、外植体、愈伤组织、二步培养法 v 2. 植物细胞培养基组成成分都有哪些？v 3. 简述植物组织培养过程。v 4. 简述植物细胞杂交的过程。v 5. 影响植物次级代谢产物累积的因素都有哪些？一、1、植物细胞工程：以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种、创造新物种、加速繁殖植物个体或获得有用物质的过程。2、植物细胞的全能：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。即植物体活细胞在一定条件下具有发育成完整植株的能力。3、外植体v 用于植物组织（细胞）培养的器官或组织

44、（的切段）。v 植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。4、愈伤组织：指从植物受伤部位或组织培养物产生的由分化和未分化细胞组成的一类薄壁组织。多为淡黄色或白色，易于再生芽。 在离体培养条件下，外植体中的活细胞经诱导脱分化，恢复其全能性，转变为分生细胞，继而分化为薄壁组织而形成愈伤组织。 5、二步培养法：使用生长培养基使细胞大量增殖，达到了一定的细胞密度，然后再改用适合细胞产物积累的培养基，促进细胞启动 次级代谢途径并提高产物的产量。6、植物细胞工程以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精

45、细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种、创造新物种、加速繁殖植物个体或获得有用物质的过程。7、植物组织和细胞培养v 植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。8、细胞分化细胞分化是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。9、细胞分化细胞分化是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。它包括：时间上的分化、空间上的分化。10、脱分化已经分化的细胞、组织、器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞和

46、组织的过程。11、再分化通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化称为胚状体或直接分化出器官。12、细胞培养v 利用单个细胞（愈伤组织）进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。v 目的是得到大量单细胞无性繁殖系。v 通过调节培养基的营养组成，愈伤组织在传代培养后，产生能适应悬浮培养的细胞群，从而建立稳定的悬浮培养植物细胞系。13、分生组织培养v 又称生长锥培养，在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。14、器官形成指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。15、无性繁殖v 即克隆，指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。12、突变体v

47、 细胞自身发生遗传变异或通过诱变发生的遗传变异产生的新细胞。13、继代培养v 由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”，连续多代的培养就称为继代培养。14、次级代谢和次级代谢产物v 定义：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。v 次级代谢产物的特征：有明显的分类学区域界限；其合成需在特定的条件下才能发生；缺乏明确的生理功能；是生命的多余成分。二、1、植物细胞培养基组成成分都有哪些？答：植物组织和细胞培养所用培养基主要含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。1、无机盐v 基本培养基是由

48、各种浓度的无机盐溶液组成的，这些无机盐又有“大量元素”和“微量元素”之分。v 大量元素是指使用浓度大于30mg/L时的无机元素，包括N、S、P、K、Mg、Ca、Cl和钠，v 微量元素是指浓度低于30mg/L的无机元素，如Fe、B、Mn、I和Mo，以及极微量的Cu和Zn。某些情况下，还可加入Ni、Co和Al。这些微量元素作为辅因子或对酶合成而言，都是必须的。2、碳源v 植物为异养细胞。通常使用碳水化合物、肌醇作为碳源，有时也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。v 有些培养物可通过同化二氧化碳获得所需的能量，即光自养培养物。v 在某些情况下，培养基固化剂也可作为补充能量和碳源之用。v 某些天然提取物对愈

49、伤组织的诱导和培养也有重要意义。3、植物生长调节剂v 植物生长调节剂包括人工合成的具有生理活性的化合物，也包括一些天然的化合物以及植物激素。 v 植物激素是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（<1mM）时能调节植物的发育过程，并能从合成部位转运到作用部位发挥作用。v 目前已发现植物组织中可以形成5种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。4、有机氮源v 主要是蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）或各种氨基酸。v 有机氮源对细胞的早期生长有利，氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源的供应。v 但应注意的是苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸可通过灭活位于叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮

50、的利用，而精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。5、维生素v 植物细胞属维生素自养型，但在大多数情况下，其自身合成的量不能满足需要。v 在培养基除了必需加入B族维生素（如B1、B6和泛酸）外，还需加入一定量的生物素和肌醇，后者是构成磷酸肌醇（细胞膜脂质部分含磷酸肌醇2%8%）极性端的部分。）2. 简述植物组织培养过程。答：切取形成层无菌接种诱导愈伤组织的形成试管苗的形成移栽（1）植物材料的准备、清洗、消毒v 用于植物组织培养的外植体必须无菌。 准备试验材料，即一般为植物器官的外植体； 清除材料内部的微生物； 不能损害试验材料。v 常用表面灭菌试剂的特点是灭菌后易于除去或容易分解的试剂。v 常用灭

51、菌试剂有次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。v 次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶液，适用于草本植物和柔软组织的灭菌处理，时间为5-30分。氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间不易过长，以免杀死植物细胞。不同外植体的灭菌步骤u 种子的消毒 灭菌前处理：纯酒精中浸泡10分钟，再用无菌水漂洗； 灭菌：100g/L次氯酸钙浸泡20-30min，再用10g/L溴水浸泡5min； 灭菌后处理：无菌水洗3次，然后在无菌水中发芽。u 果实和茎切段的消毒 灭菌前处理：纯酒精漂洗； 灭菌：20g/L次氯酸钠浸泡10min； 灭菌后处理：无菌水反复冲洗3次，然后再剖开内部种子。u 储藏器官和叶片的消毒 灭菌前处理：自来水洗

52、净； 灭菌：20g/L次氯酸钠浸泡20-30min； 灭菌后处理：无菌水反复冲洗3次、滤纸吸干。 （2）培养基配制 植物细胞培养基通常含无机营养物质(大量元素和微量元素)、碳源(1%-4%蔗糖)、有机氮源、生长调节素(2,4-D或NAA、KT或6-BA)以及维生素等几类物质组成。（3）接种 在无菌条件下操作，把材料放进培养基（4）愈伤组织的培养和诱导 在生长素（高浓度）和细胞分裂素（低浓度）作用下，外植体经诱导生成愈伤组织。 （5）诱导产生器官或体细胞胚 器官产生：愈伤组织形成细胞团器官原基形成器官（先芽后根）（6）移栽3. 简述植物细胞杂交的过程。答：植细胞A和植物细胞B用酶解法（纤维素酶、

53、果胶酶）去除细胞壁，得到原生质体A和原生质体B；然后再用人工诱导法（物理方法：离心、震动、电刺激；化学方法：聚乙二醇）进行原生质体融合；融合后的原生质体再生出细胞壁（植物细胞融合完成的标志）得到杂种细胞；再脱分化得到愈伤组织；最后经再分化得到杂种植物。4. 影响植物次级代谢产物累积的因素都有哪些？答：在植物组织和细胞培养过程中，影响植物次级代谢产物产生和累积的因素主要有：v 生物条件：外植体、季节、休眠、分化等；v 物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（O2）、pH和渗透压等；v 化学条件：无机盐（N、P、K等）、碳源、植物生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、前体等

54、；v 工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方法等。第五章 海洋动物基因工程v 思考题v 1. 基因工程诞生的理论基础是什么？有哪些技术促进了基因工程的发展？v 2. 外源DNA转入动物基因组的方法都有哪些？各有什么优缺点？v 3. 转基因技术在海洋动物中的应用存在和需要解决的问题都有哪些？v 4. 基因工程操作的主要流程是什么？一、1、转化 transformation指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。 2、转导 transduction 指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。转染 transfection 指病毒或以它为