肿瘤相关基因分类和技术研究路线

1、肿瘤相关基因分类和技术研究路线肿瘤相关基因癌基因抑癌基因肿瘤转移基因肿瘤转移相关基因肿瘤转移抑制基因癌基因（oncogene）病毒癌基因virus oncogene（v-onc）细胞癌基因cellular oncogene（c-onc）原癌基因 proto-onc病毒癌基因virus oncogene（v-onc）1968年 Duesberg 等首次发现 Rous 肉瘤病毒基因组 编码酪氨酸蛋白激酶 基因，证实它在细胞转化中起关键作用来自病毒，因而被命名为病毒癌基因细胞癌基因cellular oncogene（c-onc）1972年Bishop 核酸分子杂交法证实：几乎在所有高等动物细胞基因组

2、中，都有和v- onc相似的DNA序列这些序列是细胞基因组的成员之一，其编码的产物具有重要的功能细胞癌基因在正常情况下的表达有时间、空间限制，表达产物参与细胞分化、增殖原癌基因（proto-onc）未激活的细胞癌基因在人体正常细胞中存在是一种正常基因作用：调控细胞生长和分化广泛存在于生物界中，从酵母到人的细胞中都存在原癌基因的分类按原癌基因的结构、产物的功能、所在的位置分为下列四类： 1. 蛋白激酶类 2. 信息传递蛋白类 3. 生长因子及其受体类 4. 核内蛋白类细胞癌基因与致癌癌基因在生物进化中具高度保守性正常细胞中的癌基因和肿瘤细胞中的癌基因的核苷酸顺序十分相似，后者可使NIH 3T3

3、细胞恶性转化，前者需经激活后才具有转化能力说明：在正常情况下细胞癌基因不致癌，生理条件下内外环境中的某些刺激可激活癌基因，从而调节细胞的生长、分化和信息传递通常认为：癌基因并不是肿瘤所特有 是细胞的正常基因 能诱导正常细胞发生转化，并使正常细胞获得一个或多个新的生物特性的基因只有在被激活后发生异常表达时，才会导致细胞发生恶性转化细胞癌基因的生理功能主要表现为： 调节细胞生长 参与细胞分化和发育过程具有正常生理功能的同时又具有潜在致癌能力的原癌基因，其致癌潜能的发挥，首先需要被激活常见的激活因素：病毒 化学物质 辐射原癌基因的激活机理 1. DNA重排 2. 基因放大 3. 点突变 4. 其它调

4、控的异常DNA 重排插入具有高活性的启动子或增强子，使原癌基因持久、过量地表达负调控区的失活或丢失DNA 重排1 插入具有高活性的启动子或增强子，使原癌基因持久、过量地表达插入的启动子或增强子来自细胞外（外源性）如：鸡B淋巴细胞瘤由于ALV的LTR插入 c-myc 的旁侧（5或3端），使c-myc过量表达插入的启动子或增强子来自细胞内（内源性）如：内源性逆转录病毒的LTR染色体易位是原癌基因DNA重排的典型例子人B淋巴瘤中免疫球蛋白基因与c-myc的重排，使c-myc激活c-myc基因定位于8q24， Ig 、Ig 、Ig 链的基因位点分别定位在14q32、2p13和22q11c-myc易位到

5、Ig位点的高活性转录区，从而组成一个高转活性的重排基因，启动c-myc转录，使 c-myc表达增强，促进细胞恶变，最后导致肿瘤的发生DNA 重排1 插入具有高活性的启动子或增强子，使原癌基因持 久、过量地表达DNA 重排2 负调控区的失活或丢失小鼠c-myc，c-fos，c-mos等原癌基因在旁侧顺序具有抑制转录启动的负调控区人c-myc的负调控区在5端428-1188bp处，而在B淋巴瘤中，该区有多点突变或部分丢失Duesberg 提出：1号外显子被切断时，ras基因即被激活虽然这一结论还有待更多实验证实；但是，原癌基因上游或下游旁侧顺序存在负调控区（并不是个别现象），因而使原癌基因被激活的

6、可能性大为减少点突变在 ras 基因族，在人体肿瘤中已从膀胱、小细胞肺癌（Ha-ras，Kit-ras），胃（N-ras），乳腺（Ha-ras）等证明在12或61号编码子出现点突变所导致一个氨基酸的置换突变（一个氨基酸置换）可使其编码产物蛋白p21的 GTPase 活性明显下降，从而影响p21的生物学活性基因放大基因扩增，可导致基因过量表达基因放大一般被认为与恶性演进有关，未必是恶性早期的改变在人体肿瘤中，如：人肝癌中出现 N-ras 重排及其基因放大小细胞肺癌中 c-myc 及 L-myc 基因放大与癌转移可能有关神经母细胞瘤中 N-myc 基因放大明显与病程发展有关其它调控的异常反式（Tr

7、ans）调控系统转录后的调控异常反式（Trans）调控系统已证明某些基因产物可影响其它基因的转录，如：病毒HTLV-，中TAT（LOR）区SV40中的某些片段RSV的gag区原癌基因很可能会接受其它基因（包括病毒的基因产物）的控制或影响值得注意的是： v-myc 进入细胞后，可关闭细胞本身c-myc的表达，同时，c-myc激活后亦可使另一个正常表达的 c-myc 等位基因关闭，提示：myc 产物或由myc 诱导产生的物质对c-myc的转录发生Trans的负控制转录后的调控异常成纤维细胞经生长因子处理后，结果：c-myc 的mRNA量增高转录水平并不改变说明：mRNA转录后加工或稳定性的改变基因

8、的转录后调控：当前了解甚少，原癌基因的转录后调控的异常了解的更少抑癌基因 tumor suppressor gene肿瘤抑制基因（抗癌基因）最早由A.Knudson Jr.提出细胞内一类抑制肿瘤发生、生长的基因，最近又发展为指能对抗癌基因作用的基因在生物体内与癌基因功能相抵抗，共同保持生物体内正负信号相互作用的相对稳定肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活都是癌化过程的一部分抗癌基因主要功能(1) 诱导终末分化(2) 维持基因稳定 (3) 触发衰老，诱导细胞程序性死亡 (4) 调节细胞生长 (5) 抑制蛋白激酶活性 (6) 改变DNA甲基化酶活性 (7) 调节组织蛋白酶活性 (8) 调节血管形成 (

9、9) 促进细胞间联系肿瘤细胞转移基因与转移抑制基因肿瘤细胞转移基因的激活和/或转移抑制基因失活均可诱发肿瘤细胞转移表型而导致转移的发生原发部位肿瘤组织中具有转移潜性的细胞群是肿瘤转移的细胞生物学基础目前发现：癌基因 有100多个抗癌基因 有7个转移基因（metastasis gene）有一些?直接促进转移发生的关键基因，其存在或表达增强会引起侵袭转移的发生转移相关基因（ metastasis-asscciated gene ） 有一些?只涉及转移的某个阶段，并非参与整个转移过程目前发现：转移抑制基因（metastasis suppressor gene）有一些？Soble认为：凡是能抑制肿瘤转

10、移的基因均可命名为转移抑制基因抑制肿瘤细胞的转移表型研究表明，肿瘤的转移与转移基因激活或转移抑制基因失活有关，是多种转移相关基因及转移抑制相关基因综合作用的结果肿瘤相关基因的发现和深入研究的意义： 提高了人们的认识细胞增殖与分化的调控机制恶性肿瘤的发生，发展规律肿瘤浸润转移机制 为肿瘤的诊断提供了崭新的途径 肿瘤的发生、转移与某些特定的癌基因密切相关，对这些癌基因及其产物的检测，为肿瘤的临床诊断提供了一条崭新的途径，必将受到临床实验室技术人员和肿瘤工作者的重视ras 癌基因 参与人类肿瘤的发生发展最初在急性转化性逆转录病毒实验中，从Harvey、Kirsten两株大鼠肉瘤病毒中克隆出的转化基因

11、自82年 Weinberg 等人发现人膀胱癌细胞系中有活化的H-ras基因后，对ras在人类肿瘤发生发展中所起的作用引起了极大关注目前研究认为：ras癌基因 参与细胞生长和分化的调控 参与多种肿瘤的形成与发展ras 基因家族家族中与人类肿瘤相关的特征性基因有： H-ras 定位于11号染色体 是大鼠肉瘤病毒的转化基因 K-ras 定位于12号染色体 是大鼠肉瘤病毒的转化基因 N-ras 定位于 1号染色体 人神经母细胞瘤中分离得到ras 基因家族ras家族的基因所共有的特征为： 1. 基因组中有5个外显子：4个编码的外显子和1个5端非编码外显子 2. 外显子所编码的蛋白为188-189 个氨基

12、酸残基，分子量为21kD（p21蛋白），此蛋白具有高度特异性和同源性，尤其在氨基酸序列的前80个氨基酸残基中，几乎无种属间差别，具有高度保守性正常ras蛋白具有以下特点：p21（ras蛋白）位于细胞膜的内侧面，以软脂酸共价键形式固定于脂质双层膜的内表面对GTP和GDP具有高度亲和力，并具有同源性GTP酶的活性 ras 蛋白ras蛋白的生化性质与G蛋白非常类似G蛋白具有从膜结合受体到腺苷酸环化过程的信号传导作用，提示：ras蛋白可能也具有信号传导通路的作用目前，尚未发现ras蛋白作用的特异受体和靶细胞G蛋白G蛋白ras 蛋白有人推测：在哺乳动物细胞中 ras蛋白作用的靶分子：很可能是磷脂酶C磷脂

13、酶C 信号传递途径的一个重要成份被激活后的磷脂酶CPIP2 IP3 + DGIP3和DG是促进细胞增殖的第二信使现已证实，在ras癌基因转化的细胞中IP3 ，DG和PIP2的含量均明显多于未转化的细胞ras基因激活机制：原癌基因的激活过程称为活化活化后的ras基因能使NIH 3T3细胞系转化为肿瘤细胞ras基因活化的主要方式有：(1) 编码区内的突变(2) 插入激活突变激活 ras 基因家族的主要激活方式在实体瘤中占1015%目前较公认：ras基因突变点位于三种 ras 基因的第12、13、59或61位氨基酸密码子Seeburg等采用定点突变技术，对H-ras基因第12位密码子甘氨酸的所有置换

14、氨基酸的可能性进行了分析，结果表明，此位点上，除置换氨基酸为脯氨酸外，其余的置换氨基酸均具有转化潜能，但有程度差异到目前为止，在肿瘤中尚未发现二个或三个位点同时突变插入激活ras 基因附近插入一个强启动子（promoter）或增强子（enhaner）可使 ras 基因表达增强基因扩增，碱基缺失正常基因的扩增或非编码外显子的缺失也能使 ras 基因呈高表达但这两种方式在 ras 基因激活中较少见ras蛋白目前认为：两种形式活化非活化通常情况下，细胞内的ras蛋白分子处于非活化状态非活化状态下的ras蛋白特征:具有GTP酶活性能够与GDP结合当ras蛋白受到信号传递通道上游某一外界因子的刺激时，使

15、GDP磷酸化变成GTP，随后ras蛋白发生构象改变，成为活化状态活化的ras蛋白与效应分子相互作用，实现生长信号的传递，而且这种作用发生，活化的ras蛋白会迅速失活，转变为与GDP结合的非活化形式此过程主要是ras蛋白自身的GTP酶作用，它能催化GTP水解，使活化ras蛋白能立即转变成为非活化状态的ras蛋白活化的ras蛋白的生化性质ras基因的任何突变使正常的ras蛋白转变为能够使NIH 3T3 细胞转化的蛋白，从生化角度上讲，这种突变激活可分为二种(1)突变失去内在的GTP酶活性(2)突变改变了对GDP和GTP的亲和力ras 蛋白功能取决于编码蛋白的基因序列和与之密切相关的结构域突变激活的

16、常见位点多集中在GTP、GDP结合的domain附近结构的改变导致了ras蛋白的功能异常ras 基因的突变ras基因的突变：扰乱正常状态下活化与非活化ras蛋白的这种平衡机制，使正常非活化的ras蛋白转变成活化形式实际上，ras基因的12、13、61位密码子的活化突变，并不影响p21蛋白与GDP和GTP的结合，但却降低了p21蛋白自身GTP酶活性，使其水解GTP的速效大为降低，从而使ras蛋白维持于活化状态，不断激活靶分子，引起信号传导的持续效应，导致细胞大量增殖，而发生恶性转化理论上ras 蛋白维持于活化状态有三种可能机制(1)ras蛋白自身GTP酶活性降低，使GTP水解减少(2)GDP与G

17、TP间的交换增加(3)诱导了不需与鸟苷酸结合的ras蛋白的活化构象有人推测：ras蛋白的调节机制可能与其本身所具有的一种“开放”、“关闭”构型有关，构型处于“开放”时，能活跃地传导特定的生长信号；而“关闭”时则不能传导。如关键位点（12、13或61位密码子）发生了点突变，则使这种构型的开关不能再回转到闭合状态，使活化的 ras 蛋白持续传导一种不适当的生长信号ras 基因与人类肿瘤82年以来，在膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、及造血系肿统瘤中，均检出了ras癌基因的异常Pulciani等人研究表明，被检肿瘤DNA中所含活化ras基因仅占1020%（似乎ras癌基因在人类

18、肿瘤发生发展中并非起主要作用）事实上，ras癌基因参与多种肿瘤的发生发展，只不过突变率相差很大ras 基因与人类肿瘤不同肿瘤类型，ras基因的突变率相差明显，如：最高的是在胰腺癌中（90%） ，其次是甲状腺癌（53%）和结肠癌（47%）突变ras基因的种类与某些肿病类型密切相关，即有优势激活现象。如胰腺癌、结肠癌、肺癌等以K-ras突变为主，造血系统肿瘤多发现N-ras的突变，泌尿系肿瘤则以H-ras突变为主ras 基因与人类肿瘤目前的资料表明H-ras和K-ras的表达不仅与膀胱癌、肾盂癌、肺癌、结肠癌有密切的关系，而且也与胆囊癌、胰腺癌、肾母细胞癌、慢性淋巴细胞白血病、黑色素瘤形成密切相关

19、N-ras 表达水平上升主要发生在造血系统的恶性肿瘤中，如APL、AML、BL，但在神经母细胞瘤、纤维肉瘤，横纹肌肉瘤中的表达也有一定的上升，并认为是这些肿瘤形成的主要原因检测ras突变对了解肿瘤的发生发展，以及监测恶性肿瘤的治疗效果具有重大意义c-myc 癌基因c-myc基因是myc基因家族的重要成员之一c-myc基因是一种可易位基因是一种多种物质调节的可调节基因是一种可使细胞无限增殖，促进细胞分裂的基因myc基因参与细胞凋亡，c-myc基因与多种肿瘤发生发展有关人c-myc基因：定位于8q24Ig、Ig、Ig链的基因位点分别定位在14q32、2p13和22q11c-myc易位到Ig位点的高

20、活性转录区，从而组成一个高转活性的重排基因，启动c-myc转录，使 c-myc表达增强，促进细胞恶变，最后导致肿瘤的发生c-myc 癌基因结构c-myc与禽类髓细胞病毒（AMN）MC-29的v-myc同源c-myc基因由3个外显子及2个内含子组成第一个外显子不编码，只起调节作用只有外显子2和3与v-myc相对应，编码一个439个氨基酸的蛋白质c-myc 癌基因结构c-myc基因由启动子P1或P2起始转录，并在第一内含子中有一个潜在启动子P，当第一个内含子发生断裂时，P可被激活而成为一个异常转录起始点，但蛋白合成起始位点不变，并与正常c-myc基因产物相同不同的动物中，c-myc基因的第2、3外

21、显子具有高度保守性，而第1外显子则有较大的差异小鼠和人的外显子1 有70%的同源性c-myc 癌基因的表达c-myc基因的表达与细胞的生长状态有关：生长因子刺激成纤维细胞，c-myc表达增强相反，在细胞分化时c-myc表达降低在细胞培养过程中，用c-myc表达结构或反义寡脱氧核酸进行研究，发现c-myc在细胞G0期到S期的过程中也起作用表明c-myc表达的变化与细胞的增殖及分化状态有关，其表达产物在调节细胞生长、分化或恶性转化中发挥作用c-myc 基因表达产物的结构与功能c-myc基因的产物为磷酸化蛋白p62分子量为：62kD由c-myc基因的外显子2和3共同编码由439个氨基酸组成的蛋白质c

22、-myc基因属核蛋白基因，定位细胞核内，产物为核蛋白c-myc 基因表达产物的结构与功能具有转化细胞的能力具有与染色体DNA结合的特性在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用c-myc蛋白在结构上可分为：转录激活区，非特异DNA结合区，核靶序列，碱性区，螺旋-环-螺旋（HLH）及亮氨酸拉链区螺旋-环-螺旋（HLH）亮氨酸拉链（leu zipper）c-myc 基因表达产物的结构与功能在 c-myc 蛋白中，螺旋-环-螺旋紧随着碱性区，揭示其以特异性序列方式和DNA相互作用在以原核生物为实验对象的研究表明：碱性区以一个自由环存在，当以特殊方式结合到DNA上时，则变成螺旋，该区是c-myc蛋白与D

23、NA特异序列的结合部位c-myc 基因表达产物的结构与功能c-myc中：还存在着与抑制细胞分化、自身抑制有关的区域肿瘤转化所必需的区域Smith等研究了c-myc的亮氨酸拉链区，该区介导各种转录因子的二聚作用在亮氨酸重复部位的突变能显著降低c-myc抑制鼠红白血病（MEL）细胞分化能力此区的插入突变能消除c-myc的转化活性认为：正是这些c-myc结构成分的表达阻止了细胞进入细胞周期，从而抑制许多细胞系的分化c-myc 基因表达产物的结构与功能Cronch等对c-myc亮氨酸拉链区的亮氨酸进行致突变研究发现：突变导致失去自身抑制说明：亮氨酸拉链区在自身抑制中具有重要作用c-myc 基因表达产物

24、的结构与功能Stone等研究认为：c-myc 分子的中间1/3以及N-端，C-端是肿瘤转化所必需的，是c-myc基因与肿瘤转化有关的区段（功能区域） c-myc功能区域，促使 c-myc在胞浆内合成后，与其它蛋白形成寡聚体，再转移到核内，并结合到特异性的DNA序列上，从而激活和抑制许多靶基因的转录，引起细胞生长和分化的改变，发挥其生理调节功能及恶性转化作用myc 蛋白参与诱导细胞凋亡细胞凋亡（Programmed Cell death，PCD）研究的深入，发现myc蛋白参与诱导细胞凋亡c-myc基因表达的失调是多种细胞凋亡的主要诱因细胞发生凋亡的速度及其对诱导因素的敏感性均依赖于c-myc蛋白

25、的含量尚未成熟胸腺细胞中：myc基因的高表达是胚胎胸腺细胞凋亡的诱因，而且在凋亡细胞的死亡阶段，也观察到c-myc基因的高水平表达，如果用反义寡核苷酸阻断c-myc基因的表达，则细胞凋亡受到严重干扰myc 蛋白参与诱导细胞凋亡Evan发现，c-myc表达的失调也会启动去除生长因子后培养细胞的成熟前凋亡观察了小鼠IL-3依赖性髓样细胞株32D，发现在洗去IL-3后，可立即观察到c-myc基因表达下调，结果使培养细胞停止于G1期将携带c-myc基因载体转染32D细胞，获得稳定表达c-myc基因的32D细胞克隆，结果这种细胞去除IL-3后，不停止于G1期，而是启动以凋亡为特征的程序性细胞死亡结果揭示

26、细胞凋亡是清除固定突变及细胞周期调控失衡的细胞的重要机制，一旦细胞发生障碍，c-myc基因会启动凋亡程序，相反，则导致肿瘤形成myc 癌基因与人类肿瘤myc基因定位于染色体8q24Ig 、Ig、Ig链的基因位点分别在14q32、2p13和22q11在BL中：c-myc基因位点与Ig基因位点之间的易位，即c-myc易位到Ig位点的高活性转录区，从而组成一个高转活性的重排基因，启动c-myc转录，使 c-myc表达增强，促进细胞恶变，最后导致肿瘤的发生myc 癌基因与人类肿瘤在不同的人体肿瘤细胞系中，已发现c-myc或c-myc相关序列的扩增粒细胞性白血病细胞系视网膜母细胞瘤细胞系某些神经母细胞瘤

27、细胞系乳腺癌细胞系某些肺癌细胞系肠癌细胞系成骨肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤myc 癌基因与人类肿瘤c-myc过量表达与肿瘤的早期复发有关在致瘤中，已发现ras与myc、sis与myc、myc与fos偶联激活，协同致瘤等许多资料表明c-myc位点在所有受检的B细胞肿瘤中有重排myc 癌基因与人类肿瘤Casares等：发现定位在8号染色体上的c-myc与定位在14号染色体上的Ig重链基因有同样的的EcoR酶切片段，因而认为发生了814易位814易位可能是何杰氏淋巴瘤的一个标志N-myc在人神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和小细胞肺癌中有扩增，扩增的程度与肿瘤的发病进程有关Schwab等

28、报告20%的神经母细胞瘤有N-myc扩增，其中大多数是侵袭性肿瘤myc 癌基因与人类肿瘤Seeger等报告，myc基因拷贝数的多少预示疾病的进程c-myc与小细胞肺癌30%的病例c-myc扩增，复发病人中myc扩增者的生存期短于没有扩增的病例接受化疗的肿瘤病人易引起myc扩增myc基因扩增与其它肿瘤的关系也有许多报道目前认为胃癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、何杰金氏病及头部肿瘤等都有myc基因的扩增或过度表达nm23 基因nm23基因是肿瘤转移抑制基因nm23编码的产物具有抑制肿瘤转移的功能nm23在分化良好的肿瘤中呈高水平表达，且nm23基因表达与淋巴结转移呈负相关，与无病生存期，整个生存期呈正

29、相关检测nm23基因的表达高低，可以作为判断肿瘤有无转移的一个重要指标nm23 基因及表达nm23基因：Steeg（美国国立癌症研究所，1988）等，从7个转移潜力不同的K-1735鼠黑色素瘤细胞株中用消减杂交分离克隆获得nm23基因：在低转移细胞株中的表达强度是高转移细胞株内的10倍，表明nm23基因在高转移肿瘤中表达降低人基因组中存在着两个nm23基因，即nm23-H1，和nm23-H2，定位于、3nm23 基因及表达nm23-H1 mRNA 、nm23-H2 mRNA：由两个完全不同的基因转录nm23-H1、nm23-H2：受两个独立的调控系统调节nm23-H1的mRNA的水平与癌细胞转

30、移关系更密切 nm23 基因及表达nm23-H2基因与myc基因之间功能性连接nm23蛋白：转录因子Postel等研究：多肽PUF ，是myc转录的重要调节物， PUF可与c-myc启动子特异区域相结合Postel等，从Hela细胞克隆了PUF cDNA，发现它的核苷酸序列实际上与人nm23-H2序列一致一系列的生化及免疫学研究证明：PUF与nm23-H2蛋白的一致性，该蛋白通过与启动子序列特异地结合使myc DNA序列在体外转录nm23 基因及表达目前认为，nm23 虽然不一定是myc的转录刺激物，但至少是myc的一个重要调节基因细胞死亡时，nm23可以诱导myc的表达nm23-H1丧失，有

31、助于细胞永生化nm23 表达产物及功能nm23-H1和nm23-H2基因：编码由152个氨基酸所组成的17kD蛋白，nm23-H1和nm23-H2的氨基酸序列同源性达88%其氨基酸序列在疏水性和电荷性上高度保守，有94%的氨基酸组成是相同的nm23蛋白（p17）与核苷二磷酸激酶（NDPK）的氨基酸序列高度同源nm23-H1蛋白 与NDPK的同源性达89%nm23-H2蛋白 与NDPK的同源性达97%NDPK是一类广泛存在的酶将5NTP的一个磷酸基团转移到5NDP上，使蛋白变为活性状态功能：在肿瘤的发生和发育上，至少参与两个重要作用NDPK 功能之一：微管的聚合一方面可能使微管聚合异常而引起减数

32、分裂时纺缍体的异常，从而导致癌细胞染色体非整倍体的形成，进而促进肿瘤的发展另一方面它可能通过影响细胞骨架而引起细胞运动，从而参与浸润转移过程和发育过程NDPK 功能之二： G蛋白介导的信号传导在信号转导过程中，使GDP还原为GTP，从而使G蛋白激活Nm23蛋白以这种方式能调节大量的G蛋白介导的细胞信号传导反应，进而参与发育和肿瘤的发展nm23基因与肿瘤转移Steeg PS，等 nm23基因表达与乳原癌转移和预后的关系17份肿瘤标本，原位杂交技术检测nm 23 mRNA含量结果：瘤细胞（来自有淋巴结转移的病人）：均含有低水平的nm23 mRNA瘤细胞（来自无淋巴结转移的病人）：含有较高水平的nm

33、23 mRNAnm23基因与肿瘤转移进一步，对71例原发性乳腺癌患者进行研究 （nm23基因的表达）方法Northern blot 免疫细胞化学的方法结果表明：nm23在分化良好的肿瘤呈高水平表达，nm23表达与淋巴转移呈负相关，与无病生存期，整个生存期呈正相关目前认为nm23基因产物，在抑制表型中起重要作用nm23基因与肿瘤转移nm23低表达与人胃癌的转移密切相关到目前为止，nm23已在胃癌、骨肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、肠癌等具有转移潜能的肿瘤细胞中呈低表达在大肠癌中nm23在低表达与肿瘤状态和远距离转移紧密相关检测nm23表达程度可以判断肿瘤有无转移，对临床治疗具有普遍意义，国外已在91年开展

34、这项常见检查。国内？mdm2 癌基因1992年，从一个含有双微体（murine double mimut，DM）的自发转化的BALB 3T3DM细胞中克隆出来的一个高度扩增的基因位于小鼠的第10号染色体的C1-C3区已在多种肿瘤中发现其突变与扩增，而且mdm2突变与p53突变不共存mdm2扩增与肿瘤转移密切相关目前研究表明，mdm2参与细胞基本生理过程。因此，mdm2癌基因的变化对阐明肿瘤发病机理以及转移机理具有重大意义，对临床也具有指导意义mdm2 癌基因mdm2基因在进化上比较保守，在许多动物细胞的染色体上都有同源序列核苷酸序列己测定，由2372个碱基组成，在3 端和5端各有数百个碱基组成

35、的非编码区起始密码AUG 从第311个碱基处开始，编码区全长 1473个碱基，编码一个长度为491个氨基酸的蛋白质 mdm2 基因1992年，Momand等人，首次分离和证明了大鼠的mdm2基因产物是一种分子为90 kD的蛋白质同年Baraby等人测定的分子量约95kD该蛋白质的分子量是90kD或95kD，故称为p90或p95p90是一种高度酸性的蛋白质，等电点非常低p90结构：一级结构己根据 mdm2 基因的核苷酸序列推测出来，高级结构的研究目前尚未见报道氨基酸序列分析发现：具有1个核定位信号和2个锌指蛋白，提示着它是一种DNA结合蛋白，可能具有转录调节作用人 mdm2 基因Oliner等人

36、，对人mdm2基因进行了克隆，并定位于12q13-4正常情况下，人体许多器官都有mdm2 mRNA （）的表达，以骨胳肌最高在小鼠的许多器官组织中也有mdm2 mRNA的表达，以睾丸、胸腺和脑中最高mdm2在哺乳动物中有如此广泛的表达，说明它在细胞的基本生理过程中有一定作用，根据对mdm2癌基因产物分析也提示： mdm2 癌基因在控制细胞生长上有一定作用mdm2 癌基因的成瘤性研究mdm2 癌基因在自发转化的 BALB/3T3DM细胞系有高度扩增，其扩增程度是正常的50倍以上，而且这些转化的细胞在软琼脂上可以生长，并在裸鼠皮下可以成瘤，成瘤速度非常快，在 1-2 周内就可以出现一个快速生长的肿

37、瘤mdm2 癌基因的成瘤性研究用mdm2基因，转染NIH3T3细胞和大鼠的Rat细胞，可以使转染细胞的mdm2 mRNA水平增高10-15倍过度表达的程度与mdm2在这些细胞内的扩增程度有直接关系将转染的细胞接种到16只裸鼠皮下，裸鼠均发生了肿瘤，但出现肿瘤的时间要晚于3T3DM细胞，这可能与3T3DM细胞的mdm2的表达程度较高有关动物实验说明：mdm2癌基因，可以使细胞转化和具有成瘤性，并可以促进移植瘤的快速出现mdm2癌基因在人类肿瘤的扩增和表达1992年Oliner等首次报道mdm2癌基因在人体的软组织和骨的肉瘤中有扩增47例肉瘤中有17例扩增（7例脂肪肉瘤、7例恶性纤组织细胞瘤、3例

38、骨肉瘤）扩增程度从5-50倍不等，在有高度扩增的肉瘤细胞中有高水平的mdm2癌基因产物p90的表达mdm2癌基因在人类肿瘤的扩增和表达Ladanyi等人，研究了28例骨肉瘤（16例原发、11例转移、1例局部复发）的mdm2癌基因的扩增情况，结果：4例（3例转移和1例复发）有mdm2 癌基因扩增在原发性骨肉瘤中未见有mdm2癌基因的扩增Ladanyi认为mdm2 癌基因的扩增可能与骨肉瘤的发展和转移有关mdm2癌基因在人类肿瘤的扩增和表达Reifenferger等，最近发现：mdm2癌基因在人脑肿瘤中有扩增对157例人脑肿瘤检测发现：8-10%的胶质母细胞瘤和变型星型细胞瘤有 mdm2 癌基因扩

39、增扩增程度从8-70倍不等mdm2癌基因在人类肿瘤的扩增和表达Sheikh等发现：在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系中，mdm2 mRNA表达水平是雌激素受体阴性细胞系的30倍在良性软组织肿瘤（脂肪瘤）和结肠、直肠、肾、宫颈癌中未发现有mdm2癌基因的扩增mdm2 癌基因研究的展望mdm2癌基因的研究才刚刚起步，初步的研究结果己显出来，在胶质瘤、骨肉瘤和软组织肉瘤中有一定关系在骨肉瘤中检测mdm2的扩增有可能成为一个估计预后的指标mdm2在乳腺癌细胞系中的扩增，但在胃肠道和宫颈癌中未发现有扩增在其它肿瘤的表达情况及与临床病理学特征的关系有待进一步探讨mdm2 癌基因研究的展望mdm2癌基因表达产物

40、在人类为p90p90可以与p53蛋白形成复合物（p90-p53），使p53失活mdm2的精确功能尚不清楚，因此它的过度表达是否可以通过其它机理，而不是通过灭活p53而促进肿瘤生长?对其表达产物的氨基酸序列分析发现，具有与DNA结合特定模序mdm2 癌基因研究的展望mdm2 基因位于12q，在这个区域还有其它两个基因sas和gil，这两个基因在一些恶肿瘤中也有扩增在胶质瘤、软组织和骨肉瘤中位于染色体同一区域的mdm2、sas和gil会不会同时扩增，扩增程度等仍是值得探讨的问题p16 基因1994年（美国冷泉实验室 Kamb等）新发现的抗癌基因又叫MTS（multiple tumor suppre

41、ssor 1）基因是一种细胞周期中的基本基因，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂在人类50%肿瘤细胞株中发现有纯合子缺失，突变，认为p16是比p53更重要的一种新型抗癌基因有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生p16 基因在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中发现：p16基因纯合子缺失，无义、错义移码突变，表明p16基因以缺失，突变方式广泛参与肿瘤形成检测p16基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义p16基因结构及表达p16基因定位于人染色体9p21，由2个内含子

42、及3个外显子组成第1外显子由126bp组成第2外显子由307bp组成第3外显子由 bp组成p16基因是细胞周期中的一种基本基因，其表达产物直接参与细胞增殖的负调节p16基因如何调整起始转录？其相关调节因子有哪些？如何调节？尚不清楚p16基因的表达产物及功能p16基因编码产物是p16蛋白，定位于细胞核内David Beach等证明：p16蛋白是作用于细胞分裂周期（cell division cycle，cdc）的关键酶之一是CDK（cyclin-dependent kinase）的抑制因子p16基因的表达产物及功能cdc基因编码产物是蛋白激酶，参与调控G1-S，G2-M的关键点转换控制细胞分化的

43、机制涉及到多种组成成分，最重要的是细胞周期素（cyclin）Cyclin：周期性累积与分解对细胞周期时程的调控作用CDK与cyclin复合体分别在细胞周期的不同时相发挥作用，启动DNA复制及诱发有丝分裂CDK可能是调控细胞周期装置的核心，通过对一系列关键底物磷酸化作用来调节细胞周期Cell cyclep16基因的表达产物及功能CDK与cyclin复合体参与G1-S转换的调控p16蛋白抑制CDK活性，最终阻止细胞进入S期p16基因（因缺失，突变等原因）功能缺失，则不能抑制CDK，最终导致细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生p16基因的表达产物及功能CDK-cyclin可作用于多种癌基因产物，如：pp6

44、0c-syc，c-abl产物，对其进行磷酸化修饰调节， CDK-cyclin亦可作用于某些抗癌基因产物，如：Rb蛋白磷酸化后则生长抑制功能丧失，在G1/S交界处，CDK-G1 cyclin，使Rb磷酸化而失活，细胞从静止态进入增殖态可见，p16基因是一种非常重要的抗癌基因， p16基因失活，则会引起细胞恶性增殖p16 基因与肿瘤Gianic等：定量PCR检测了32例恶性神经胶质瘤的p16外显子2发现：59%恶性神经胶质瘤中，p16基因的量有改变，根据光密度扫描，24% 的病人是因p16基因纯合子缺失所致p16 基因与肿瘤JenJ，等：PCR技术检测 57例脑肿瘤p16基因发现26例出现纯合子缺

45、失p16 基因与肿瘤Kamb等从肺癌、乳腺癌、囊肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、淋巴瘤等中检测出50%以上的p16基因纯合子缺失在黑色素瘤中，还检出无义错义，移码突变研究表明：p16基因参与了各种组织的肿瘤形成检测p16基因的突变与缺失，是判断肿瘤的性质及预后的一项重要指标p16 基因与肿瘤p16基因体积小，只有p53的1/10p16基因用于基因诊疗、更易操作，对临床肿瘤治疗更具有现实意义研究p16基因正是目前及今后一段时期的热点抗肿瘤基因的实验证据 1遗传性肿瘤中某些基因的丢失早在70年代已经证明：某些遗传性肿瘤中染色体的某些位点可发生专一的丢失视网膜母细胞瘤的40属先天性这些遗

46、传性病例（大多为双侧性）的患儿，约5可见13q14的一个等位基因位点的缺失，而且肿瘤发生时，肿瘤细胞中另一个等位基因也发生了缺失，成为纯合体提示：第一次的缺陷属先天性，第二次属体细胞突变（ ，提出了“两次突变”学说）只有两个等位基因同时缺失时才发生视网膜母细胞瘤，因此这种抗视网膜母细胞瘤的原癌基因（Rb基因）具有显著性的意义根据酯酶D的测定和与染色体13有关的限制性内切片段长并多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）证明：至少50的视网膜母细胞瘤细胞中存在纯合体的13q14、20缺失经治疗后痊愈的儿童，以后易患肉瘤，而这种瘤细胞中也发

47、现了13号染色体标志位点的缺失另一个相似的例子是肾母细胞瘤（Wilm瘤），在肿瘤细胞中出现纯合子的11q13的缺失11p标记位点的缺少还与肝母细胞瘤，小儿横纹肌肉瘤、肾上腺皮须癌有关 抗肿瘤基因的实验证据 2. 正常和恶性细胞杂交中正常染色体对恶性行为的抑制应用体细胞杂交技术，正常细胞与恶性细胞杂交后所形成的杂体细胞，其恶性程度降低，但随着正常染色体被逐排斥，恶性度又恢复正常小鼠成纤维细胞和恶性转化细胞杂交后，抑制恶性生长的基因位于小鼠染色体4正常人成纤维细胞与中国仓鼠或金仓鼠恶性转化细胞杂交时，抑制恶性行为的基因分别位于染色体2或1正常人成纤维细胞和人HeLa细胞杂交时，这种“阻抑基因”位于

48、染色体11及14不同种属，不同种类恶性细胞的抗肿瘤基因的种类不相同抗肿瘤基因的性质和生物学意义由于对抗肿瘤基因编码的产物尚不了解，所以目前仍难以说明抗肿瘤基因的性质和确切的生物学功能推测：抗肿瘤基因的产物包括不少抑制细胞生长的物质，其中有抑素（chalone）生长抑制因子（GIF）细胞MHC-1 抗原（有助于机体免疫系统的有效识别）抗肿瘤基因可能包括：1编码抑制细胞生长的一些物质2基因表达的调节控制序列，包括trans调 节或cis调节的负控制区3调控基因组稳定性的某些基因 以上仅仅是根据现有材料的一些推测，将有待于实验的证实最近，有三方面的实验室结果，比较直接提供存在抗瘤基因的证据Rb基因的

49、分离：美国哈佛大学麻省理工学院加州大学分别分离出Rb基因的cDNA及其DNA序列分析证据Friend.S.H.等人用一个定位于13q14、11，以前用于Rb基因限制性内切酶长度多态性研究的DNA片段H3-8为探针，从人胎盘cDNA文库中筛选出一个的cDNA片段，并同时分离出相应的基因片段的克隆，用上述cDNA为探针，可在正常人的组织DNA中看到杂交信号，而在部分的视网膜母细胞瘤的DNA中则可看到信号的缺失证据如果用Nouthern吸印杂交的技术来检测正常人某些组织及视网膜母细胞瘤的mRNA，可发现在前才有的信号，而在后者则此mRNA缺失目前该cDNA的全部DNA序列已经测出证据李文华（）等人，

50、利用酯酶D的基因，通过染色体移步（chromosomal walking）应用cDNA和单一顺序DNA片段向两侧延伸，终于分离到Rb基因的cDNA及基因片段此cDNA长，涉及到的基因大于100kb，由27个外显子组成。从cDNA序列分析，预计可翻译出816个氨基酸组成的多肽在视网膜母细胞瘤中，不仅可见基因的部分丢失，而且可看到mRNA转录物的缺失或异常另一方面，对Wilm瘤的研究也有所突破：Stambridge等人，应用微细胞杂交技术，首次证明了将11号染色体短臂片段导入Wilm瘤细胞，可使细胞丧失在软琼脂中生长的能力和在裸鼠体内的成瘤能力。但对瘤细胞的形态、c-myc、N-myc及c-sis

51、的表达均无影响用其它染色体片段如13号染色体对Wilm瘤的成瘤能力并无作用实验结果表明，11号染色体上的抗瘤基因产物与肿瘤形成后期存在某种联系对癌基因与抗癌基因的评论如果说癌基因是一个涵义混乱不确切的命名，抗癌基因是同样的模糊不清所谓癌基因与抗癌基因都是一大类控制细胞生长和分化的基因，对其单个基因来说，它的产物所具有的功能因细胞种类甚至细胞发育阶段而异1癌基因与抗癌基因的相对意义同一种癌基因及其产物，在不同细胞中可起完全相反的作用最典型的例子是ras基因及其产物p21。在成纤维细胞中已有充分证据说明，微量注入p21蛋白能使细胞迅速进入S期和开始分裂。人ras基因可使成纤维细胞和某些上皮细胞恶变

52、。但对点突变的嗜铬细胞瘤pc12细胞，将ras基因引入或微量注射p21使恶性细胞停止分裂并开始分化。src基因对鸡成纤维细胞中的致癌作用是确定无疑的，但在胚胎发育过程中，src基因的表达神经系统的分化密切相关，估计这样的例子可能不尽是个别的从生物学意义上来说，ras基因对成纤维细胞来说是癌基因，对交感神经切来源的pc12来说是抗癌基因。同一基因的产物，是促进生长或抑制生长，是抗癌还是致癌，似乎不取决于该基因的本身，而决定于细胞类别的差异。同时提示不同细胞中以ras 基因产物的效应系统不同，因此最后的生物学功能也不同。2. 促进和抑制生长物质的双重性顾名思义，应将生长因子列入癌基因的范畴，而生长

53、抑制因子则应属抗癌基因之列。事实上，生长因子对不同细胞的作用差别很大，除了受体的因素外，生长因子既可促进细胞生长，也可抑制细胞生长。同样，生长抑制因子既可抑制细胞生长，也可促进细胞生长。因此，不区别细胞的种类即判断哪些基因是促进或抑制生长，显然是不合理的3肿瘤是一种异常生长早在上一世纪，Virchow已提出肿瘤是一种异常生长的疾病。癌细胞是一种以自主的，带有分化缺陷的持续生长的细胞癌基因与抗癌基因的研究，尤其是前者，从基因水平揭开了控制细胞生长和分化的物质基础，应该既不受癌基因或抗癌基因的概念所束缚，同时也充分利用上述研究的大量材料，来揭示肿瘤发生评论：癌基因研究的战略及具体技术目前癌基因的研

54、究，极需在概念和技术上有所突破概念问题现从战略角度来讨论目前癌基因研究技术路线的得与失，并提出当前需要发展的技术路线及其可行性问题传统的研究技术路线1各实验室用于分离癌基因的技术路线大体上有以下几个方面： 1癌细胞的基因组DNA，通过DNA转染后导入某些受体细胞。发生恶性转化后，组建转化细胞株的基因文库，从中分离出癌基因的克隆具体分以下几个环节：传统的研究技术路线1环节之一：癌细胞的材料来源，文献报道，多数直接癌的体外细胞株作为材料，其优点是材料易得而且单纯，易于提取到较完整的高分子DNA。缺点是体外培养过程中，癌细胞的某些原癌基因可发生突变，新的原癌基因也可被激活，因此与体内原发性肿瘤的癌基

55、因谱不一定相同。所以，对某种特定的癌来说，材料来源奕以原发性肿瘤为主，可以癌细胞株的研究提供相互验证。但原发性肿瘤的材料不均一，常伴有坏死，提取高分DNA有时会遇到一定困难，因此在提取DNA时应注意防止DNA的降解传统的研究技术路线1环节之二：高分子DNA的提取用于DNA转染的DNA，要求并不高。在转染前，还将用针筒吸抽或其它机械方法将DNA分子撕裂至60kb左右，以利于导入细胞。由于这样的处理，使用DNA转染技术获得的转化基因一般在50kb以下。这是DNA转染在技术上的限制传统的研究技术路线1环节之三：受体细胞的选择基因转移的常用的受体细胞为小鼠NIH3T3细胞，大鼠RAT-1细胞，仓鼠CH

56、EF细胞。上述细胞都属成纤维细胞。少数实验已开始用小鼠肾上皮细胞。上述细胞中，NIH3T3对接受外源转化基因而发生恶性极为敏感，但自发生转化率高。过去不少作者提出责难：NIH3T3细胞为一种“非整倍体”细胞，已属非正常细胞，所以应用NIH3T3作为受体细胞大多获得的转化基因仍多属ras族。因此认为，为什么获得上述结果，另有原因。这是由于DNA转染技术本身的局限性传统的研究技术路线1环节之四：DNA转染目前最常用的基因转移方法是DNA转染，即将DNA直接放入培液，通过一定方式，使它进入受体细胞DNA导入的技术有1：磷酸钙沉淀法原理：利用磷酸钙形成细颗粒，DNA吸附于颗粒而被导入细胞优点：方法简便

57、、易于重复缺点：转移导入的效率低，均在10-6-10-7之间DNA导入的技术有2：电穿孔技术原理：利用高压电场，对细胞进行脉冲式处理，使细胞表面通透性改变，有利于DNA分子进入细胞其效率一般比磷酸钙方法提高二个数量级或更多DNA导入的技术有3： 抗药基因的共转染由于DNA导入的效率很低（最高仅10-3），因此如果共同导入抗药基因，可通过药物去除大量未被转染的细胞，在具有抗药性的细胞中选择出恶性转化细胞，而且会显著降低自发转化灶的背景数常用的抗药基因为pSV2-neo。用G418进行筛选的缺点是G418价格昂贵传统的研究技术路线1环节之五： 转化细胞的筛选经典的方法是通过G418筛选后，在转染后21在左右，收集转化细胞灶，分别扩增。然后将转化细胞通过软琼脂生长，推测其生长能力。若获得细胞集落，将其收集后，再度扩增。达到一定细胞数后，按106-107细胞鼠