乙型肝炎病原学诊断和治疗

1、乙型肝炎病原学诊断和治疗一、实验目的1、熟悉乙肝病毒DNA提取方法2、掌握乙肝病毒DNAPCR检测方法2二、实验原理聚合酶链反应（PCR）技术是在体外模拟体内DNA复制，利用两段特异的寡核酸引物，由DNA聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。3PCR技术基本原理4目的基因扩增循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数)122438416532664201,048,576301,073,741,824(10亿)1 循环= 2 扩增子2 循环 = 4 扩增子3 循环 = 8 扩增子4 循环 = 16 扩增子5 循环 = 32 扩增子6 循环 = 64 扩增子7 循环 = 128 扩增子5三、实验准备（一）试剂

2、1、DNA提取液2、PCR反应液3、石蜡油、双蒸水4、电泳缓冲液（TAE）5、2琼酯糖6、溴化乙锭（EB）7、Taq聚合酶10XPCR缓冲液dNTP引物6三、实验准备（一）器材和仪器1、离心机2、水浴锅3、PCR扩增仪4、电泳槽、电泳仪5、紫外灯6、移液器7移液器加样枪头8高速离心机旋涡振荡器9PCR扩增仪10荧光定量PCR扩增仪11电泳仪电泳槽12暗室中紫外灯观察结果13（一）乙肝病毒DNA提取（热裂解法）1、分离血清2、50ul血清加入50 ul裂解液混匀。3、沸水浴煮10分钟。4、15000转离心15分钟。5、取上清到另一离心管中备用。三、实验步骤14分离血清15加入裂解液提取DNA16

3、热 裂 解17高 速 离 心18三、实验步骤（二）HBVDNA扩增1、配制反应液（15ul10TAE，1ulTaq酶，13ul双蒸水，1ul模板）,振荡混匀.2、扩增仪中：9430秒，5530秒，72 1分钟，共30循环。3、72 延伸5分钟。19配制PCR反应液20三、实验步骤（三）扩增产物检测1、配制2琼酯糖的凝胶2、取扩增产物10ul加入凝胶小孔中3、电泳30分钟4、紫外灯下观察结果。21扩增产物分析221分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为样品处理区，PCR扩增区，产物分析区。2、试验前实验室应使用紫外消毒至少30分钟，实验器械应用70乙醇擦拭。3操作时戴一

4、次性手套，加样头要求及时更换，吸液时避免飞溅。四、注意事项234每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。5、EP管在开盖前应离心片刻。6、所有试剂试验前充分融化，避免反复冻融。7、每次PCR反应均应设立阴阳性对照。四、注意事项24试验实设置与管理25PCR室的管理与防污染PCR室建立严格规章制度PCR室严格分区PCR室各区器械专区使用PCR室各区单向流动PCR检测前后要用1次氯酸钠液或75乙醇擦拭PCR反应液中使用dUTP防污染2627试剂准备室管理制度 实验室人员进入该室须穿专用白色工作服，实验中应需戴手套。 每天实验开始前，清

5、洁台面并应打开紫外灯消毒30分钟。 取出当天试验需配置和使用试剂，其余试剂要立即收好，并放回冰箱内。 实验中使用的离心管、吸头等应经过灭活无菌处理（应在消毒的有效期内）。 PCR其他室的用品不得带入本室。 每次实验记录，应使用本室专用的、带有本室标志的记录本、纸和笔。 实验开始后，当天不得再返回本室。2829样品制备室管理制度实验人员进入该室须穿专用兰色工作服，实验中应需戴手套，手套须常更换。 样品的接受、登记、保存和提取按试剂盒要求进行。 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 实验记录使用本室专用记录本和笔。使用过的离心管、吸头须置于1次氯酸钠溶液中浸泡，消毒后方可丢弃。 患者样

6、品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。 PCR扩增后区的物品不得带入本室。 实验完毕后要打开紫外灯消毒。30产物分析区管理制度 实验人员进入该室须穿专用红色工作服，实验中应需戴手套，手套须常更换。 使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。 实验记录使用本室专用记录本和笔。 使用过的离心管、吸头须置于1次氯酸钠溶液中浸泡，消毒后方可丢弃。PCR产物分析区的物品不得带出本室，严防污染携带至前区。 实验完毕后要打开紫外灯消毒，最好通夜消毒。31定量PCR概念以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量的定量32常规PCR与定量PCR的比较33实时荧

7、光定量PCR原理指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold=10SD cycle0-1534Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。35荧光定量的标

8、准曲线 标准曲线未知标本Crossing Point (Cycles)log (copy number)nlog (F2/F1)nlog (F2/F1)Target3836除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5端标记一个荧光基团，3标记另一个荧光基团。此时5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3端荧光淬灭基团（发生FRET），因此正常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号。Taqman探针原理37但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换；Taqm

9、an探针原理38Taqman探针原理Taq酶的53外切酶活性将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光，切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。39实时荧光定量PCR无需内标Ct值的重现性:同一模板Ct值恒定.Ct值与起始模板的线性关系决定.内标对实时荧光定量PCR有影响:加入内标后PCR反应变成双重PCR,存在竞争。无法加入合适的起始拷贝的内标。40定量PCR在临床诊断治疗上的意义对致病微生物核酸含量进行定量检测弥补免疫检测的缺陷（如HCV）缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV）对治疗过程进行药物疗效监测指导用药加快疾病的诊断，病情判断预后对染色体突变导致的遗传病进行检测41定量PCR在乙肝检测中意义1. 判断疾病的严重程度和传染性2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量4.