基因工程转基因植物PPT课件

1、第十章 转基因植物1 转基因植物 是指利用基因工程技术，在离体条件下，对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重载体转入受体中，并使其在体内表达的植物。 转基因植物通常具有高产优质、抗病虫、环境抗性、抗除草剂、耐储存、提高某些成分的含量等优良性状。作物转基因育种 就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经 DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势：1.拓宽可利用的基因资源；2.培育高

2、产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径；3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择；4. 可以大大提高选择效率，加快育种进程。此外，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。1.1 受体受体 是指用于接受外源DNA的转化材料。良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：1) 高效稳定的再生能力；2) 受体材料要有较高的遗传稳定性；3) 外植体来源方便，如胚和其它器官等；4) 对筛选剂敏感；5) 转化率高常用的受体材料有以下几大类型:1.1.1 原生质体 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞

3、，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统；缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。1.1 受体1.1.2 愈伤组织 外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。缺点：遗传稳定性差、嵌合体 因此需要连续的再生系统1.1 受体1.1.3 直接分化再生 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；缺点：材料局限，转化率低。1.1 受体1.1.4 胚状体 是指具有胚胎性质的个体。优点：个体数目巨大、同质性

4、好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。1.1 受体1.1.5 生殖细胞受体系统以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。1.1 受体1.2 转基因方法概括起来说主要有两类： 外源目的DNA的直接转化。以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。1.2.1 外源基因直接导入法（1）化学刺激法细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）等植物细胞的原生质体经过

5、聚乙二醇(PEG)、磷酸钙、氯化钙等化学药剂处理之后，便能够捕获外源的转化DNA。(2) 基因枪轰击法（微弹轰击技术micro-projectile bombardment) 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。(3) 微注射法细胞操作： 利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受

6、体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。子房注射法或花粉管通道法： 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。1.2.2 载体介导转移系统最常见的转基因方法,具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法等。将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcingplasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。 农杆菌介导法 1）农杆菌 农杆菌包括

7、根癌农杆菌（Ti质粒）和发根农杆菌（Ri质粒），质粒中含有一段可移动的DNA称为T-DNA，可作为外源DNA的载体。农杆菌: 广泛用于植物基因工程。包含Ti质粒:【肿瘤诱导质粒（细菌质粒）】； T-DNA: (Transferred-DNA), 可以转移进入植物基因组. Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95156106D, 约有200kb组成。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（agrocinopine）或称

8、琥珀碱型(succinamopine)（1）Ti质粒的遗传特性及类型Ti PlasmidT-DNA regionLeft borderRight bordervir genesori已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。auxin（2） Ti质粒的功能区域 T-DNA区（transferred-DNA regions）： 农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，

9、使农杆菌表现出毒性。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。 Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。 Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。2）根癌农杆菌转化植物细胞的过程 (1) 农杆菌对植物细胞表面特定部位的识别和附着；(2) 经敏感细胞的诱导作用，位于Ti质粒上控制T区的基因转移的Vir区基因活化并表

10、达；(3) T-DNA从Ti质粒上切割下来，通过细菌和植物细胞的壁，转移并整合到植物细胞的核基因组中。近年来研究表明，“乙酰丁香酮”等酚类化合物可以活化Vir区基因，提高转化效率。 (1)共培养法： 包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养。3）农杆菌转化的方法共培养法 （1）当受体为原生质体和悬浮细胞或愈伤组织时，仅适合用于对农杆菌敏感的双子叶植物； （2）应用共培养法可获得较高的转化率，但仅局限于原生质体植板率较高的材料，如烟草，而许多植物的原生质体经细菌感染后活力下降，分裂停止。所以，采用细胞团和愈伤组织进行共培养，但易产生嵌合体，需反复筛选； （3）用一定浓度的酚类化合物预处

11、理农杆菌可提高转化率； （4）细菌与植物材料的保温时间是影响转化频率的重要因素之一； （5）在选择培养基上得到的转化体需分开培养，单独编号，作为一个单独的转化体。应用共培养法应注意的问题：（2）活体接种法 是一种简单易行的方法，转基因的受体为生长健康，无病虫害的个体，选择生长旺盛、细胞分裂快的组织为接种部位，将一定量的对数生长期的农杆菌用针头注射或用锋利刀片切割后涂抹受体的敏感组织，转化组织可以保留在原个体上，也可以切下来离体培养，以获得较高的转化效率。活体接种法4）农杆菌转化法的特点 （1）受体类型广泛，可以是原生质、单细胞、细胞团、组 织、器官和植株水平； （2）简单易行、周期短、转化效率

12、较高 （3）转化体常出现“嵌合”现象，需在严格条件下加以筛选、淘汰未转化细胞； （4）影响转化效率的因素相对较少，受体再生系统、细菌株系是其中的两个重要因素。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 关键特征:主要适用于双子叶植物和祼子植物 实例: 农杆菌转化法示意图：1.2.3 花粉管通道法 *花粉管通道法是将外源DNA涂抹于植物柱头，通过植物授粉，经天然的花粉管通道将外源DNA经珠

13、心进入胚囊，以达到遗传转化的目的。 *特点：是方便易行，不需专门仪器和昂贵药品；直接得到转化的种子；受季节限制。*周光宇（1978，1979，1983，1988）提出. Luo(1988), 首次将含报告基因的质粒DNA导入水稻获得分子证据; 成卓敏（1993），田苗英（1999）将目的基因导入小麦.1.3 转基因植物的鉴定 无论使用哪种转基因方法，转化细胞与非转化细胞相比都只占少数。为获得真正的转基因植株，进行基因转化后的第一步工作是筛选转化细胞。在含有选择压力的培养基上诱导转化细胞分化，形成转化芽，再诱导芽生长、生根，形成转化植株。第二步是对转化植株进行分子生物学鉴定。第三步则是进行性状鉴

14、定及外源基因的表达调控研究。 1.3.1 选择性培养检测（抗性基因检测） 一般用抗性基因来富集转化细胞。抗性基因应满足以下几点：A. 抗性基因应是显性基因。B. 在选择压力下，转化细胞能继续生长，而非转化细胞受到抑制，从而使转化子得到富集。C. 抗性基因产物本身不能对转化细胞的生长或发育有抑制作用。D. 选择物价廉易得。1) 抗生素抗性基因（1）npt 新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、巴龙霉素、新霉素具有抗性。（2） aphIV 潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素具有抗性。（3）spt 链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具有抗性。（4）cat 氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧失抗生素活性。等等。 2

15、）抗除草剂基因除草剂抗性基因在植物遗传转化中可同时用作选择标记和培养抗除草剂的作物。抗除草剂基因主要有抗PPT的bar和pat基因以及抗草甘膦的epsps基因。1.3.2 遗传标记检测 （1）GUS酶活性检测 GUS基因存在于某些细菌体内，编码-葡萄糖苷酶（-glucuronidase， GUS），该酶是一种水解酶，能催化许多-葡萄糖苷酯类物质的水解。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此GUS基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应用。此外，GUS基因3端与其他结构形式的融合基因也能够正常表达，所产生的融合蛋白仍具有GUS活性，这对研究外源

16、基因表达的具体细胞部位提供了方便条件，也是它相对于其他报告基因的一个优点。 主要有一下三种检测方法： 该法以5-溴-4-氯-3-吲哚-D葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）为底物，通过显色反应可直接观察到组织器官中gus基因的活性。该方法不用将酶从组织中提取出来，而是使底物进入被测的植物组织、细胞或原生质体之中。将被测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温，若组织、细胞、原生质体发生了gus基因转化，表达出GUS，在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质，初始产物并不带颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成5,5-二溴-4,4-二氯靛蓝染料，此靛蓝染料使具有Gus活性的部位或位点呈现蓝色，可

17、用肉眼或在显微镜下观察到。A. 组织化学染色定位法报告基因（1）检测报告基因: GUS（编码葡萄糖苷酶）报告基因检测（GUS染色）GUS染色原理5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷，无色兰色 该法以4-甲基伞形酮酰-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）为底物，Gus催化其水解为4-甲基伞形酮（4-MU）及-D葡萄糖醛酸。4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。 具体测定时有两种做法: 仅在一个时间上测定溶液的总荧光量，测定时要设对照，以消除内源荧光强度； 测定酶反应不同时间溶液荧光量（荧光法十分灵敏，微小的增加量也可以测定出来），在酶反应初始阶段，酶

18、作用生成的荧光物质在反应体系中处于积累阶段，荧光产物与时间有线性关系，而内源性荧光物质的荧光量与时间无此种关系，因而可通过测定酶反应初始阶段几个时间的荧光量，得到的线性关系即可作为酶活力的依据。B. 荧光法测定Gus活性 对硝基苯-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）是该法的最好底物，Gus将其水解，生成对硝基苯酚，在pH7.15时离子化的发色团吸收400420的光，溶液呈黄色，酶反应在pH7.0条件下进行，随反应进行，产物生成，逐渐碱化，显色增强。以对硝基苯酚为标准样品，分别在反应开始后不同时间取样，终止反应后于415nm测吸收值。这种方法简单，无需复杂仪器，但其灵敏度不高，可通过延长反应时间来增强

19、显色。C. 分光光度法测定Gus活性(2) 荧光素酶活性检测 萤火虫萤光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类，在镁离子、三磷酸腺苷及氧作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化萤光素，其发射光子后转变成常态的氧化萤光素，反应中化学能转变成光能。检测的方法有两种：活体内萤光素酶活性测出，体外萤光素酶活性的检测。(3) 绿色荧光蛋白检测 绿色荧光蛋白（green-fluorescent protein，Gfp）是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白，它是能够接收光辐射能并最终发射荧光的物质。 生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。 Gfp在异源细胞中的表达表明，Gfp于其他原核或真核细胞中，在蓝光激发下都能发出绿光，即发射团的形成无物种特异性，也不需要特异的辅助因子。因此gfp基因作为新型标记或报告基因在各种生物中广泛使用。1.3.3 分子生物学检测方法1）酶联免疫吸附检测 酶联免疫吸附检测是指利用外源基因表达蛋白的抗体与抗原的特异性，通过结合在抗体上的酶作用于特定的底物后发生显色反应，借助比色鉴定转基因植物。可经免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布