基因工程的下游技术　重组蛋白的表达、纯化和分析ppt课件

1、基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 重组蛋白的表达表达体系： 表达载体 原核 受体细胞 真核选择表达载体常用的关键元件：启动子和调理序列表达强弱、细胞或组织特异性、表达调理等，如本实验的乳糖支配子。交融基因纯化、标签，或加强蛋白可溶性等。如多聚His标签6His，便于镍柱亲和层析纯化。GST交融蛋白用GST柱亲和层析分泌信号挑选标志其它6His 重组蛋白的纯化亲和层析离子交换层析凝胶过滤层析 本单元实验流程：细菌pEF-GFPuv 亲和层析IPTG诱导细菌总蛋白重组蛋白交融蛋白乳糖支配子的特性SDS初步分析实验十 重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达实验目的实验原理资料与试剂实验仪器操

2、作步骤本卷须知实验安排思索与讨论实验目的了解和掌握IPTG诱导表达的原理。了解降解物阻遏的景象及其机理。实验原理支配子是基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的构造基因以及一些调理序列如启动子序列、支配序列等组成。乳糖支配子由三个构造基因Z、Y、A和支配序列、启动子、CAP结合位点等调理序列组成。 乳糖支配子的诱导表达当没有乳糖存在时，调理基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与支配序列lacO结合，妨碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前挪动，使构造基因不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖支配子处于妨碍形状。 乳糖支配子的诱导表达续当有乳糖存

3、在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改动，而不能结合到支配序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3端挪动，于是，构造基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖支配子被诱导。 乳糖支配子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的构造类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是耐久的。 乳糖支配子的诱导表达续本实验所运用的表达载体上含有乳糖支配子的调理序列，目的基由于绿色荧光蛋白基因。在IPTG的诱导下，目的基因表达可加强105倍。然而，诱导表达经常遭到温度和诱导物的影响。乳糖支配子的降解物阻遏当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培育基中生长时，

4、通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只需当葡萄糖耗尽后，细菌才干充分利用乳糖，这种景象称葡萄糖效应，其本质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏catabolic repression。乳糖支配子的降解物阻遏续降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白Catabolite gene Activation Protein，CAP，又称cAMP受体蛋白cAMP Receptor Protein，CRP属于激活蛋白的一种，对乳糖支配子进展正调理。 CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合到CAP结合位点上，促进转录。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性

5、，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制转录。 阻遏蛋白负调理与CAP正调理的协调 当阻遏蛋白封锁转录时，CAP对该系统不能发扬作用；而没有CAP存在时，即使没有阻遏蛋白与支配序列结合，支配子仍无转录活性。只需在CAP存在且没有阻遏蛋白与支配序列结合时，或者说只需高乳糖低葡萄糖时，支配子发扬最大转录活性。 这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。The structure of lac operon调理序列构造基因Repressor and negative regulation异乳糖异丙基硫代半乳糖苷异乳糖CAP and positive regulation 低乳糖时 高乳糖时

6、在协调调理下，lac operon的强诱导作用发生在高乳糖、低葡萄糖的形状。资料与试剂资料 含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌。试剂LB 液体培育基 ： 蛋白胨tryptone10g、酵母粉yeast extract5g、NaCl 10g，加800mL双蒸水溶解，用10M NaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。 分装，高压灭菌，4保管。氨苄青霉素溶液： 无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20保管，运用终浓度为50g/mL或100g/mL。IPTG溶液： 将238.3mg IPTG溶解于10mL双蒸水，0.22m细菌滤器过滤除菌，分装，-20保管备用，储存浓度为

7、100 mM。20%葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至100mL，121，15min 灭菌，4保管。实验仪器 超净任务台、 恒温摇床、离心机等。操作步骤挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉终浓度为100g/mL，以下同)的5mL的LB培育基中，于37、250rpm过夜培育12h-14h至对数生长期。取3支已灭菌的大试管，分别参与5mL含有氨苄青霉素的LB培育液，编号为1#，2#，3#，另取一个250mL的灭菌三角瓶，编号为6#，参与50mL含氨苄青霉素的LB培育液。1#：接50L空载工程菌含pUC18过夜培育物，25-28培育10 h

8、-12h； 2#：接50L重组菌含pGFPuv过夜培育物，25-28培育10 h-12h； 3#：接50L重组菌含pGFPuv 过夜培育物，37培育至O.D600约为0.5约3h-4h)，然后参与20%葡萄糖50L至终浓度为0.2%，及100mM IPTG 5L至终浓度为0.1mM，25-28培育8h-10h或过夜； 6#：接500L重组菌含pGFPuv过夜培育物，37培育至O.D600约为0.5约3h-4h)，然后只参与100mM IPTG 50L至终浓度为0.1 mM，25-28培育8h-10h或过夜。4. 搜集菌体。分别将1#-3#全部培育物搜集到三个7mL离心管中，编上相应编号，离心弃

9、上清；三角瓶培育的50mL菌液混匀后取5mL于7mL离心管中编号为4#，离心，上清搜集到另一个指管，编号为5#，其他的培育液用 50mL离心管于5000rpm，4，离心10min，弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破碎细胞或保管于20备用见实验十二。 5. 于紫外灯下察看1# -5#管搜集的菌体或上清液，察看哪支管有荧光，记录察看到的景象。留意：把1#和2#管置4保管。分别标Sample1和Sample2。 1236pUC18pGFPuv挑取单菌落，接种于5mLLBA培育基中。37过夜培育。按1:100接种对照IPTG+GlcIPTG12361234525 -28培育过夜5000rpm离心

10、，收菌体取5mL离心其他离心收菌体，提取蛋白本卷须知本实验的目的是比较该重组DNA在大肠杆菌中表达时受IPTG和葡萄糖存在的影响。在转管培育及收菌时要留意各管编号要相应对好，不能混乱。 1#、2#管不加IPTG和葡萄糖。3#管除加IPTG外还参与葡萄糖浓度要大于0.2%以上。 6#瓶仅加IPTG 。不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往遭到IPTG浓度和培育温度的影响。在科研中普通都采用不同温度或不同浓度的IPTG来诱导，以获得最大的蛋白表达量。本实验所表达的绿色荧光蛋白基因，其产物在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后搜集的菌体在紫外线的照射下可见黄绿色荧光，所以把1#、2#、3#、4#

11、沉淀菌体放在紫外灯下察看其能否有荧光以及荧光的强弱，就可判别其能否有表达及其所表达的强度。实验安排 第一天： 上午配试剂，灭菌； 下午开场接种，约3 h-4h后开场诱导。步骤2、3 第二天： 收菌、紫外察看结果和拍照； 破碎细菌，分别上清，待过柱。思索与讨论对紫外灯下察看到的结果作出解释。为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD600浓度约为0.5时参与IPTG？大肠杆菌的诱导表达常受哪些要素的影响？实验十二 金属鳌合亲和层析分别目的蛋白质 实验目的实验原理资料与试剂实验仪器操作步骤本卷须知实验安排思索与讨论一实验目的学习亲和层析的原理。掌握亲和层析法分别蛋白质的技术与操作。实验原理以普通凝胶作载体

12、，衔接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分别纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的实际根据。知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子构成比较稳定的络合物，因此，衔接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。过渡金属元素镍在较低pH范围时pH 6-8，有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子外表咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基能够也很重要。用IPTG诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金

13、属亲和层析法进展分别，且操作简单，快速，纯化效率高。资料与试剂资料 含pUC18质粒工程菌及含重组pGFPuv质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白。试剂0.05mol/L EDTA-0.5mol/L NaCl溶液 50mL2mol/L NaCl 溶液 50mL1mol/L NaOH溶液 50mL0.2mol/L NiSO4溶液 30mL起始缓冲液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 500mLChelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL大肠杆菌细胞裂解蛋白样品 10-20mL洗涤液：50mmol/L咪唑；50mmol/L

14、Tris-HCl； 0.5mol/L NaCl，pH 7.0洗脱液：300mmol/L咪唑；50mmol/L Tris-HCl；0.5mol/L NaCl，pH7.0 实验仪器 1.5cm X 50cm层析柱、自动分部搜集器、紫外分光光度计、紫外检测仪及记录仪等。操作步骤样品的制备: 细胞的培育及荧光蛋白表达见实验十，细胞的破碎及蛋白的搜集如下： 搜集在25培育的细胞培育液，5000r/min，离心10min，去上清液，菌体用起始缓冲液洗涤一次，离心搜集菌体，用三分之一细胞培育液体积15mL的起始缓冲液充分悬浮，冰浴下进展超声波处置，功率为400W，任务4秒，间隙4 秒，为一次，99次为一周期

15、。共处置六周期。然后8000r/min,离心30min，取上清液。放冰箱备用。亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端出口封锁。参与少量的无离子水，排去下端的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶4mL到烧杯中，参与少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，翻开下端的排水口，让亲和凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为4-5mL。亲和凝胶的再生处置：用10 倍柱体积的再生溶液0.05mol/L EDTA、 0.5mol/L NaCl过柱，流速3mL/min。1drops/2s!用5倍柱体积的2 mol/L NaCl 溶液洗亲和层析柱除去多余的EDTA。流速3mL/mi

16、n。用5倍柱体积的1 mol/L NaOH溶液洗涤层析柱，流速2mL/min。用10倍柱体积的无离子水洗至pH8-9，流速3mL/min。用2倍柱体积的0.2mol/L的硫酸镍溶液过层析柱，使凝胶金属镍离子结合, 流速2mL/min。过完后放置5 分钟。用10倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多余的镍离子。流速3mL/min。用5 倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，备用。 上样： 先从15mL裂解上清液中取出50L预备用于电泳，作为亲和层析分别前上清液中的总蛋区带对照图谱Sample3。然后以每分钟1mL的流速上层析柱，分部搜集流出液，每管3mL，测得的OD280值曲线为穿流峰，取最高的一管样品

17、液用作电泳，标Sample4。再用10mL起始缓冲液过层析柱，操作同前。 洗涤： 用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液25mL洗脱，分部搜集洗脱液，每管5mL，取中间管样品电泳Sample5 。 洗脱： 用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液10mL洗脱，用Ep管分部搜集洗脱液。每管收0.5mL。测得的OD280值曲线峰为目的蛋白峰GFP，标Sample6 。 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：进展12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分别纯化的结果。Sample1-6，外加Marker见实验十一。 本卷须知不论是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱

18、平面。否那么，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果。样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分别效果才好。亲和层析剂可回收，经再生可循环运用。该亲和层析剂用20%乙醇浸泡于冰箱保管。亲和层析柱在再生处置、上样、洗脱过程中其颜色都有明显变化白、蓝、绿，只需细心操作，样品能否被吸附上去或被洗脱下来？都能察看到从而作出判别。实验安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生镍柱；然后，过柱纯化重组蛋白。 思索与讨论解释IPTG诱导表达的荧光蛋白经12 SDS电泳结果图谱。镍柱在再生处置、上样、洗脱过程中其颜色有何变化？为什么？要到达好的分别效果要留意哪些问题？实验十一 SDS电泳分别蛋白质实验目的实验原理资料与试剂

19、实验仪器操作步骤本卷须知实验安排思索与讨论一.实验目的 了解SDS灵敏度高，分辩率强的原理。用此法分析不同条件下培育的菌其荧光蛋白表达情况。 实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acrylamide,简称ACR和交联剂甲叉双丙烯酰胺N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状构造的凝胶，经过改动单体浓度与交联剂的比例可以得到不同孔径的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N、N、N、N四甲基乙二胺简称TEMED。通常控制这两种

20、溶液的用量使聚合在1h内完成。2光聚合：通常用核黄素为催化剂，经过控制光照时间和强度来控制聚合时间也可加速反响。本实验采用化学聚合。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为延续的凝胶仅有分别胶电泳；第二类为不延续的凝胶浓缩胶和分别胶电泳。通常聚丙烯酰胺凝胶不延续电泳有三种效应：电荷效应；电泳物所带电荷的差别性。 凝胶的分子筛效应。凝胶的网状构造及电泳物的大小外形不同所致浓缩效应，凝胶浓度的不延续性、缓冲液离子成分的不延续性、电位梯度的不延续性以及pH的不延续性所致。因此，样品分别效果好，分辨率高。SDS，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS十二烷基磺酸钠。SDS破坏蛋白质的二级和三级构造；强复原剂

21、使半胱氨酸之间的二硫键断裂，因此，蛋白质在一定浓度的含有强复原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，构成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量的SDS，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差别。而由于SDS与蛋白质的结合是按大小成比例的，在进展电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。试剂30%的凝胶贮备液: Acr 29g + Bis 1g溶于100mL去离子水中。避光储存棕色瓶中。3M Tris-HCl (p

22、H8.9): 36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL5Tris-甘氨酸电泳bufferpH8.3): Tris-base15.1g + 甘氨酸94g + 5gSDS + H2O至1L用时稀释5倍。 10%SDS：10g SDS溶解于100mL去离子水中，储存于室温中。0.5M Tris-HCl(pH6.8): 6.05g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mLTEMED(四甲基乙二胺):浓度10%，20 mL (共用)10% AP(过硫酸铵):10 mL，1g AP溶解于10mL去离子水中，新颖配制。 2x样品缓冲

23、液： 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT(二硫苏糖醇) 4% SDS 0.2% 溴酚蓝 20% 甘油 考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于45mL甲醇中，加10mL冰醋酸 + H2O至100mL。滤纸过滤除去不溶物 脱色液：75mL冰乙酸 + 50mL甲醇 + 875mL H2O如只配500mL，各物质减半实验仪器 电泳仪、垂直板电泳安装、微量进样器50L、染色/脱色摇床等。操作步骤胶板模型的安装：在干净的带隔板的玻璃板的三条边上把橡胶条压上，然后将另一块凹形玻璃板压上，放入电泳槽中。示范12%分别胶的制备每次配10 mL 去离子水 3.2mL 30%

24、 凝胶液 4.0mL 3mol/L Tris-HCl(pH8.9) 2.6mL 10% SDS 0.1mL 10% APS 0.1mL TEMED 0.005mL 用手轻摇约2分钟混匀(留意不要产生气泡,小心将混合液注入预备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间，悄然在顶层参与几毫升去离子水复盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制造用。刚参与水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消逝，不久又出现界面，这阐明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全。 ！留意：为防止凝胶过快聚合，配胶用的无离子水、30%的凝胶液及Tris-HCl缓冲液应事先于4或冰上放置,以下同。浓缩胶的制备：先吸去已聚合好的分别胶上层的水，用水

25、洗界面一次，再用滤纸吸干残留的水液。按以下配方制备5毫升浓缩胶溶液。混合后将其注入分别胶上端，插入梳子应小心防止气泡。 去离子水 3.2mL 30% 凝胶液 0.83mL 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 0.75mL 10% SDS 0.050mL 10% AP 0.050mL TEMED 0.005mL在浓缩胶聚合的同时，将样品与5样品缓冲液16L 4L混合，100加热3分钟以变性蛋白质。Sample1,2用600L起始缓冲液悬浮，取16L同上操作。浓缩胶聚合完全后，小心地拔出梳子，用无离子水冲洗梳孔，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均参与1X电泳缓冲液，检查有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡，上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔。按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，20L/孔，一孔加一个样品，同时安排知分子量的规范物作对照。电泳：开场时浓缩胶电压为80V，染料进入分别胶后，将电压增到