毛细管电泳原理及分析策略ppt课件

1、毛细管电泳分别原理及分析战略贝克曼高效毛细管电泳仪毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进展高效、快速分别的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)。 毛细管电泳的原理1 安装 毛细管 数据处置 电极 检测器 电极 试样 缓冲液 高压电源 可高至30KV 2 电泳和电渗 电泳是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向挪动的景象。电渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体外表挪动的景象。 2 电泳和电渗 电泳行为与特性运用淌度描画 即单位场强(E)下离子的平均电泳速度 ep=/E实验中，只发生电泳时

2、有效淌度 ef =ef (L /V) =( l / tm )(L /V) 毛细管有效长度 迁移时间 毛细管总长度 电压 2 电泳和电渗 电渗与固液界面的双电层有着亲密的关系 在毛细管壁双电层的分散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷外表，构成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与严密层作相对运动，携带着溶剂一同向阴极迁移，便构成了电渗流electroosmotic flow ,EOF。 固液两相间的总电势-热力学电势-0 Zeta电势- 2 电泳和电渗 电渗流的流型特点电渗流 HPLC塞流 层流 2 电泳和电渗 电渗流的表示电渗流的大小可用淌度(eo)或电渗流系数表示

3、 eo =eo / E = l /( teoE )电渗流速度 毛细管有效长度 电渗流流出时间 电场强度 第22章 毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理2 电泳和电渗 电渗流的意义电泳过程中，伴随着电渗景象电渗流的速度比电泳速度快57倍利用电渗流可将正、负离子或中性分子一同向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分别分析电渗流是毛细管电泳分别的重要参数控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分别的效率、重现性、分别度。 分情况而论2 电泳和电渗 改动电渗流的方法改动外加径向电场改动缓冲液成分和浓度 Zeta电势改动缓冲液pH参与添加剂改动温度 粘度 盐-离子强度外表活性剂e

4、o正比于Zeta电势和介质的介电常数 反比于介质的黏度Zeta电势正比于双电层厚度和界面有效电荷密度 反比于介质的介电常数表观电泳淌度 apap=ap/E ap为离子的表观迁移速度 ap=ef +eo ap= ef + eo2 电泳和电渗 3 分别效率和分别度 分别效率柱效可以用实际塔板数n表示 n = (ep+eo) V l /(2DL) 毛细管电泳分别的柱效方程 实际塔板高 H =L / n n = 5.54(/ W)2 实验上可按上式求出实际塔板数 为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的间隔 W为电泳峰的半顶峰宽 3 分别效率和分别度 分别度电泳中两峰的分别度Rs，也称为分辨率，它表示了淌

5、度相近的组分分开的才干，可表达为 Rs= n 1/2/4 /平 相邻两区带的迁移速度差平为两者的平均速度 / 平表示分别选择性n为柱效分别度计算式Rs = 2 (tm2 - tm1 ) / ( W1 + W2 )tm1、tm2 分别为两个组份的迁移时间W 为峰底的宽度3 分别效率和分别度 4 区带宽度及其展宽要素 区带宽度展宽要素 焦耳热 进样电泳分散毛细管壁对组分的吸附 焦耳热 细内径100m，粗外径的毛细管柱 温度轮廓 - 黏度轮廓 -速度轮廓4 区带宽度及其展宽要素 进样 试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。 细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严厉。 普通进样区带控制在柱长的

6、1%电泳分散 试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差别，而引起区带电分散。 s-b 峰前展或拖尾？4 区带宽度及其展宽要素 毛细管壁对组分的吸附 电泳峰拖尾或变形，甚至消逝。抑制吸附作用常用的方法有： 运用极端pH条件 参与中性盐或两性离子化合物 对毛细管内壁进展涂层处置 需求留意：方法也会抑制或改动电渗流 4 区带宽度及其展宽要素 CE分别原理-与方式有关毛细管区带电泳CZE毛细管胶束电动色谱MECC/MCKC毛细管凝胶电泳CGE毛细管等电聚焦cIEF亲和毛细管电泳ACE毛细管电色谱CEC第一章 毛细管区带电泳样品在电解液中泳动,根据物

7、质的荷/质比差别来进展分别，比值愈大,跑得愈快进样方式压力进样电动进样浓缩进样毛细管种类非涂层毛细管裸管内壁涂层毛细管涂层管非涂层毛细管-电渗流的概念- H+高pH低pH电渗流的特点EOF-+纯电泳形状-+EOF电泳+电渗流0tm (min)电渗流的作用电渗流的活塞流特点Hydrodynamic flowParabolicResistance to flow at surfaceMore diffusion/broader detection zoneEOF gives plug flowMinimizes band broadeningNarrows detection zoneHydrod

8、ynamic flowParabolicResistance to flow at surfaceMore diffusion/broader detection zoneEOF gives plug flowMinimizes band broadeningNarrows detection zone电渗流的活塞流特点电渗流是CE中最大的驱动力来源之一电渗流的正面及负面作用正面作用添加分别速度使得正、负电荷物质同时分别负面作用减少分别时间和分别有效间隔电渗流的动摇极大的影响了迁移时间的反复性影响电渗流的要素pH值 pH越高，电渗流越大离子强度 离子强度越高，电渗流越小缓冲溶液添加剂 离子型外

9、表活性剂、有机溶剂、环糊精电渗流随pH的变化情况控制电渗流的三个重要手段采用涂层毛细管，消除电渗流的影响改动pH，从而调整电渗流的大小。pH10以后，电渗流根本不添加添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而添加分别的有效间隔；外表活性剂可以彻底改动电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时运用缓冲溶液的影响和选择在CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液：在所选的pH范围内有较强缓冲才干；在检测波优点有低的紫外吸收；小的淌度即大体积、低电荷离子以降低所产生的电流。 那些被称为生物“优良缓冲液的，如Tris, borate, CAPS等特别有用，由于这些缓冲溶液中的离子普通较大，可以在较高浓度下运用

10、而不会产生大的电流，但一个潜在的缺陷是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。常用的CE缓冲体系磷酸钠体系 宽缓冲范围硼酸钠体系 高pH范围Tris-HCl体系 低pH范围醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系CZE分别条件的选择毛细管类型-涂层还是非涂层？毛细管长度-长毛细管还是短毛细管？缓冲液体系-种类和pH值添加剂类型-甲醇|环糊精|乙腈检测器选择-紫外|二极管阵列|激光诱导荧光缓冲溶液的选择 可先用磷酸缓冲体系为搜索根底，初步确定最正确pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽pH=1.513，但电导也比较大。缓冲溶

11、液及pH值的选择 研讨阅历阐明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性pH 2或碱性pH9分别条件，比较容易得到好的分别结果；糖类样品通常在pH=911之间能获得最正确分别；羧酸或其他样品多在pH=59之间选择分别条件。缓冲溶液及pH值的选择 pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内任务，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3pH8的范围以外任务，其涂层容易水解失效。缓冲溶液及pH值的选择 在一样的 pH下，不同缓冲体系的分别效果不尽一样，有的能够相差甚远。普通的阅历是，能与样品发生相互作用的试剂，有能够就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分别糖类和DNA等分子时

12、优先运用硼酸盐缓冲体系，由于硼酸根能与糖羟基构成配位键，从而添加糖的负电荷和分别度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分别。缓冲溶液及pH值的选择 缓冲试剂及pH调理剂的浓度也需求优化。缓冲试剂的浓度普通控制在10200 mmol/L之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20 mmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及HEPES等，其浓度可在100 mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高0.5mol/L的试剂浓度，此时要留意减少分别电压，分析速度自然也将随之降低。添加剂的选择目的：改善分别抑制分析物在毛细管上的吸附添加剂的选择甲醇|乙腈5

13、-50%降低电渗流，添加分别有效间隔，从而改善分别效果添加非极性物质的水溶性环糊精|SDS等外表活性剂添加分别选择性，提高分析效果降低电渗流，添加分别有效间隔，从而改善分别效果非极性高分子聚合物掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附降低电渗流构成一定的分子筛，提高分子大小选择性第二章 毛细管胶束电动色谱 电解质中参与外表活性剂(surfactant，例如SDS)，使之构成胶束Micelle，样品根据其疏水性(Hydrophobicity)强弱的差别，在胶束与电解质的分配系数有所不同來进展分别 ，样品疏水性愈強，那么进入胶束的时机愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水性愈強的物质那么愈慢

14、出來。毛细管胶束电动色谱原理SDS-+EOFMicellar Electrokinetic Chromatography (MEKC)七种青霉素的分别CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.5(B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) soln. 胶束电动色谱的特点优点添加对弱极性物质分别的分别度在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常运用缺陷稳定性不佳，到达好的反复性比较困难第三章 毛细管凝胶电泳 毛細管內先填充凝胶(例如polyacrylamide或cellulose)，此时凝胶会在毛細管內构成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內挪动速度不同而进展分别。主要用于核

15、酸片断及蛋白分子量分析毛细管凝胶电泳CE双链及单链核酸分析45-寡核苷酸质控 1.0 2.0 3.0123456789101112131415161718192023242526272829303031323334IS21 10.0 15.0Relative Fluorescence IntensitydsDNA片段 (72 bp-12 Kbp)CE-SDS蛋白分子量分析第四章 毛细管等电聚焦第五章 亲和毛细管电泳-分别条件基于CZE 当在CZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，便可以用于研讨和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进展特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需求运用生化知识外，其

16、他方面的选择与CZE等一样。用于研讨分子间相互作用测定，分子构型变化特定物质检测活性物质挑选ACE测定分子间结合常数与解离速率JAK2与SH2-B之间的相互作用研讨CE药物挑选ACE用于相互作用挑选适体Aptamer类似于抗体，但可以体外合成，结合常数比抗体更高，有广泛的药物挑选和临床诊断运用潜力 目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法挑选得到的IgEHIV type 1 reverse transcriptaseThrombinAnti-thrombin IIITaq DNA polymeraseACE用于相互作用挑选传统挑选方法如亲和色谱或者CEC挑选一个Aptamer需求4

17、-6周而CE只需求几天就可以了，大大提高了挑选速度-MicroScale Bioseparations 2006第六章 检测器选择小分子检测大分子检测CE检测器种类及性能小分子检测有紫外吸收首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器无紫外吸收可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、复原性糖等不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器有荧光或需求高灵敏度检测的可采用LIF检测器需求测定构造或者难以用光学检测器检测的，可以思索质谱检测大分子检测蛋白、核酸可以首先选择紫外检测器假设需求高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标志荧光，然后用LIF检

18、测假设需求特异性检测，可运用特异性荧光探针，标志后再LIF检测需求测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测多糖含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测含量较低的复原性多糖可用衍生试剂标志后以LIF、UV的方式检测第七章 分别条件选择流程 分别条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研讨任务者能够会有各自不同的选择战略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考： 第一步，尽能够多地了解分别样品的类型、来源、组成及其性质； 第二步，根据样品的能够性质和来源，选择分别方式，假设无样品信息可先选CZE；条件选择流程 第三步，根据样品性质确定检测方法，普通先选直接紫外吸收； 第四步

19、，确定样品处置方式，包括衍生方案以及离心过滤除蛋白等； 第五步，根据样品解离常数计算最正确pH，或利用75mID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;条件选择流程 第六步，根据所需pH构建缓冲体系，包括进一步优化pH、缓冲试剂浓度等； 第七步，优化其他操作参数，如毛细管尺寸、分别电压和温度等； 第八步，确定能否需求运用添加剂和运用非水溶剂； 第九步，确定能否需求换用其他分别方式。条件选择流程 在毛细管电泳条件选择中，还应充分留意以下操作事项： 最好对样品和缓冲液进展过滤或离心处置。 毛细管的洗涤或平衡，与缓冲体系、pH以及柱子有关。磷酸根与石英和玻璃之间存在慢相互作用，需求延伸平衡或冲洗时间，处置

20、的时间应由分别重现性决议。条件选择流程 欲降低缓冲液的电导，应尽量运用所谓的“生物缓冲试剂；欲降低检测背景，那么应尽量运用无机缓冲试剂。 欲坚持分别重现，要尽量采用一样的条件，包括毛细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。第八章 各类物质的分别要点阴离子及有机酸此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法间接紫外法普通以铬酸钠等物质作为背景吸收物CTAB通常用作电渗流反向剂，以加速出峰，提顶峰的锋利度要运用反向极性分别各类物质的分别要点阳离子及金属离子的分别此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法间接紫外法普通以氨基吡啶等物质作为背景吸收物与阴离子不同的是阳离子的分析不需求在缓冲溶液中添加电渗流反向试剂也不需求运用