A001SOD说明书05311-1222资料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。A001SOD说明书05311-1222-超氧化物歧化酶（SOD）测试盒货号：A001目录试剂盒的介绍2测定意义2测定原理2试剂盒有效期和保存条件2实验中所需的仪器和自备的试剂2总SOD的测定3高脂血症血清（浆）中SOD的测定6红细胞中SOD的测定9总SOD与分型SOD的测定方法抽提法测CuZn-SOD12SDS和KCl抑制Mn-SOD测定CuZn-SOD16KCN抑制CuZn-SOD测定Mn-SOD19参考值22注意点22试剂盒优点23附录：SOD标准曲线的制备.24试剂盒的介绍本试剂盒采用黄嘌呤氧化

2、酶法测定超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutaseSOD)活力，可测血清(浆)、脑脊液、胸水、腹水、肾透析液、尿液、红细胞、白细胞、血小板、心肌培养细胞、肿瘤培养细胞、各种动植物组织细胞及亚细胞水平(线粒体、微粒体)中的SOD活力，并可检测微生物、药物、食品、饮料、化妆品中的SOD活力。既适用于常规检验工作，又能满足科研工作的需要。测定意义.超氧化物歧化酶（SOD）对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基（O2）保护细胞免受损伤。因而SOD活力的高低与衰老、肿瘤、炎症、自身免疫病、血液病、心血管病、肾脏病、消化系统疾病、辐射、药物作用等有着密切的联系，

3、对疾病的病因学探讨、诊断、治疗、术后的观察有着重要意义。测定原理通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2）,后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。高等动物细胞内只有二种SOD即铜锌-SOD（CuZn-SOD）与锰-SOD(Mn-SOD),二者相加等于总SOD(T-SOD)。KCN可抑制CuZn-SOD活力，而Mn-SOD活力不变，而经样本前处理过的样本中Mn-S

4、OD活力丧失，但CuZn-SOD活力不变。试剂盒有效期和保存条件本试剂盒保存期：6个月；贮存温度：4，注意4号试剂不可放在0以下，否则酶会失效，所用塑料吸嘴尖要干净，最好消毒，或者用蒸馏水将新吸嘴尖头反复冲洗，一定要避免菌类及重金属离子污染。实验中所需的仪器和自备的试剂550nm的分光光度计37恒温水浴锅台式离心机微量式移液器蒸馏水冰醋酸（分析纯）总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的测定一、试剂的组成与配制：（一）、100管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：10ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至100ml，4保存。2、试

5、剂二：液体10ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体10ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l2支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml2瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080热双蒸水75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。

6、（二）、50管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至50ml，4保存。2、试剂二：液体5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水37.5ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至37.5ml，

7、配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水37.5ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。（三）、25管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液2.5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至25ml，4保存2、试剂二：液体2.5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体2.5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体175l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液2.5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存

8、，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水18.75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至18.75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水18.75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。二、操作方法：（一）、总SOD（T-SOD）活力的测定：试剂测定管对照管试剂一(ml)1.01.0样品(ml)a*蒸馏水(ml)a*试剂二(ml)0.10.1试剂三(ml)0.10.1试剂四(ml)0.10.1

9、用旋涡混匀器充分混匀，置37恒温水浴40分钟显色剂(ml)22混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。注意注1：a*代表样本取样量和蒸馏水取样量注2：最佳取样量因样品种类不同，其SOD活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系(附录：SOD标准曲线)，各种测定样品取样量不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量。最佳取样量的摸索：如果您第一次使用本试剂盒测试某一种新的样品时最好先做三只不同取样量的测试管。例如想测1%脑组织匀浆，取样量分别为10l、30l、50l，然后计算（对照管吸光度-测定管吸光度）对照管吸光度的结果应该在0.150.

10、55之间,即百分抑制率在1555%之间（此段曲线基本呈直线关系）,然后取百分抑制率在48%50%左右的一管作为最佳取样量,若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需将样品浓度稀释或减少取样量后再测试.若百分抑制率小于20%时,则需将样品量加大后测试.这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60或小于10，各个测定组的结果在t检验中常常无显著性差异。注3：最佳取样量参考值：人红细胞抽提液为8.010l；大鼠红细胞抽提液为5l左右；人血浆（血清）30l；小鼠血浆（血清）5l左右；1%组织匀浆3050l；胞浆2050l；心肌灌流液或肾透析液100200l；白细胞悬液100200

11、l；细胞培养液100200l。所有的样本用生理盐水稀释1倍后则取样量可加大1倍。三、计算：（一）、血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD活力计算：定义：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD活力计算公式：3、计算举例：测人血清中总SOD的活力，取血清30l，测得对照管吸光度为0.465，测定管吸光度为0.298。将数据代入计算公式：（二）、组织匀浆中总SOD活力计算：定义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。2、计算公式：3

12、、计算举例：取1%肝组织匀浆10l测总SOD的活力，对照管吸光度为0.510，测定管的吸光度为0.242，测得组织蛋白为1.075mg/ml。则计算结果为：*mgprot为毫克蛋白数。高脂血症血清（浆）中SOD的测定一、试剂的组成与配制：（一）、100管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：10ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至100ml，4保存。2、试剂二：液体10ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体10ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l2支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml2瓶，4保存。用时二者按114稀

13、释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080热双蒸水75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。（二）、50管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至50ml，4保存。

14、2、试剂二：液体5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水37.5ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至37.5ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水37.5ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，

15、4避光冷藏。（三）、25管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：2.5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至25ml，4保存。2、试剂二：液体2.5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体2.5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体175l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液2.5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水18.75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必

16、须用蒸馏水补充至18.75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水18.75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。二、高脂血症血清（浆）样本的前处理：轻度高脂血症：外观略有混浊，血清测试前处理只需加等量的生理盐水稀释，然后进行检测；中度高脂血症：外观混浊较明显，血清测试前处理需加等量的生理盐水，再加血清1/2量（体积比）的无水乙醇混匀，然后进行检测；重度高脂血症：取50l高脂血清（浆）加生理盐水200l混匀后，加无水乙醇150l，充分混匀1分钟，再加入三氯甲烷150l，充分混匀1分钟，35

17、00转/分（台式离心机），离心10分钟，取上清检测。三、操作方法：高脂血症血清（浆）SOD活力的测定：试剂测定管对照管试剂一(ml)1.01.0样本(ml)a*试剂二(ml)0.10.1试剂三(ml)0.10.1试剂四(ml)0.10.1用旋涡混匀器充分混匀，置37恒温水浴40分钟显色剂(ml)22样本(ml)a*混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。注意注1：a*代表样本取样量和蒸馏水取样量注2：最佳取样量因样品种类不同，其SOD活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系(附录：SOD标准曲线)，各种测定样品取样量不一样，在每测定一种新的样品

18、前最好选择一个最佳取样量。最佳取样量的摸索：如果您第一次使用本试剂盒测试某一种新的样品时最好先做三只不同取样量的测试管。例如想测1%脑组织匀浆，取样量分别为10l、30l、50l，然后计算（对照管吸光度-测定管吸光度）对照管吸光度的结果应该在0.150.55之间,即百分抑制率在1555%之间（此段曲线基本呈直线关系）,然后取百分抑制率在48%50%左右的一管作为最佳取样量,若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需将样品浓度稀释或减少取样量后再测试.若百分抑制率小于20%时,则需将样品量加大后测试.这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60或小于10，各个测定组的结果在

19、t检验中常常无显著性差异。四、高脂血症血清（浆）SOD活力的计算：定义：每ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。2、高脂血症血清（浆）SOD活力计算公式：*4、计算举例：测家兔高脂血清中SOD总量，取50l高脂血清加生理盐水200l混匀后，加无水乙醇150l，充分混匀1分钟，再加入三氯甲烷150l，充分混匀1分钟，3500转分离心10分钟，取上清150l进行检测。测得对照管吸光度为0.434，测定管吸光度为0.262。将数据代入计算公式：红细胞中SOD的测定一、试剂的组成与配制：（一）、100管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：10ml1瓶（天冷时或放

20、冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至100ml，4保存。2、试剂二：液体10ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体10ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l2支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml2瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080热双蒸水75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水75ml溶解

21、后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。（二）、50管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至50ml，4保存。2、试剂二：液体5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂

22、1支，用时加7080蒸馏水37.5ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至37.5ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水37.5ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。（三）、25管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：2.5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至25ml，4保存。2、试剂二：液体2.5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体2.5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体175l1支，4保存

23、，不可冷冻；4号稀释液2.5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水18.75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至18.75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水18.75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。二、样本的前处理（红细胞抽提液的制作）：采集手指血、或肝素抗凝的静脉血或动脉血50l，冲入盛有

24、24ml的生理盐水的带刻度玻璃离心管中。2000转/分离心3分钟。用玻璃吸管也可用针筒接上麻醉针头吸去上清液（要吸干净），留沉淀的红细胞。在沉淀的红细胞中加入冷双蒸水0.2ml，混匀（使红细胞充分溶解：将溶血液对光观看呈透明状则已充分溶解）。加入95%乙醇0.1ml，振荡30秒。加入三氯甲烷（氯仿）0.1ml置旋涡混匀器充分抽提混匀一分钟。3500转/分离心8分钟。此时液体分三层：上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷。若上清有混浊可加入少量固体NaCl后再离心5分钟，即可澄清。记录上清液体积，取520l作SOD测定。注*大、小鼠可取内眦血，用玻璃毛细管从内眦部斜向咽喉方向刺

25、入，或者剪尾取血，将血滴在含肝素并烤干的玻片上（烤干时温度要低于80），再用移液器取50l血，作SOD抽提。血量少时可取1020l抗凝全血。（做慢性动物试验，在饲养过程中可以反复取血56次）三、操作方法：（一）、红细胞中SOD活力的测定：试剂测定管对照管试剂一(ml)1.01.0样品(ml)a*蒸馏水(ml)a*试剂二(ml)0.10.1试剂三(ml)0.10.1试剂四(ml)0.10.1用旋涡混匀器充分混匀，置37恒温水浴40分钟显色剂(ml)22混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。注意注1：a*代表样本取样量和蒸馏水取样量注2：最佳取样量因样品种

26、类不同，其SOD活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系(附录：SOD标准曲线)，各种测定样品取样量不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量。最佳取样量的摸索：如果您第一次使用本试剂盒测试某一种新的样品时最好先做三只不同取样量的测试管。例如想测1%脑组织匀浆，取样量分别为10l、30l、50l，然后计算（对照管吸光度-测定管吸光度）对照管吸光度的结果应该在0.150.55之间,即百分抑制率在1555%之间（此段曲线基本呈直线关系）,然后取百分抑制率在48%50%左右的一管作为最佳取样量,若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需将样品浓度稀释或减少取样量后再测试.若

27、百分抑制率小于20%时,则需将样品量加大后测试.这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60或小于10，各个测定组的结果在t检验中常常无显著性差异。注3：最佳取样量参考值：人红细胞抽提液为8.010l；大鼠红细胞抽提液为5l左右四、红细胞中SOD活力的计算：定义：全血中每克血红蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。2、计算公式：3、计算举例：取红细胞抽提液10l测SOD活力：测得对照管光密度0.465，测定管光密度为0.293，测得全血中血红蛋白105g/L（即0.105g/ml）。*采血量为0.05ml；*0.05ml的全血进行

28、红细胞的SOD抽提，得抽提液0.3ml；*测定时取红细胞抽提液0.01ml。总SOD与分型SOD的测定方法一抽提法测CuZnSOD此法适用于血清（浆）、组织匀浆、细胞培养液等；该方法简便、快捷、精确，推荐使用！一、试剂的组成与配制：（一）、100管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：10ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至100ml，4保存。2、试剂二：液体10ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体10ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l2支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml2瓶，4保存。用时二者按114稀释，可

29、以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080热双蒸水75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。7、试剂七：20ml1瓶；8、试剂八：20ml1瓶。（二）、50管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液

30、的配制：用时加热蒸馏水稀释至50ml，4保存。2、试剂二：液体5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水37.5ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至37.5ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水37.5ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照

31、试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。7、试剂七：10ml1瓶；8、试剂八：10ml1瓶。（三）、25管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：2.5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至25ml，4保存。2、试剂二：液体2.5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体2.5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体175l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液2.5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5

32、、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水18.75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至18.75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水18.75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。7、试剂七：5ml1瓶；8、试剂八：5ml1瓶。二、样本的前处理：（请用玻璃试管进行操作）1、取玻璃试管编号2、取样本0.2ml加试剂七0.2ml，旋涡混匀器充分混匀1分钟后，加入试剂八0.2ml,旋涡混匀器充分混匀1分钟后，以35004000转/分，离心15分钟（台式离心机），取

33、上清待测。此上清液即经过处理后的样本，Mn-SOD活力丧失而CuZn-SOD活力不受影响。三、操作方法试剂总SOD测定管CuZn-SOD测定管对照管试剂一(ml)1.01.01.0样品(ml)a*处理过的样品a*蒸馏水(ml)a*试剂二(ml)0.10.10.1试剂三(ml)0.10.10.1试剂四(ml)0.10.10.1用旋涡混匀器充分混匀，置37恒温水浴40分钟。显色剂(ml)222混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色注意注1：a*代表样本取样量、经附加试剂处理的样本取样量和蒸馏水取样量注2：最佳取样量因样品种类不同，其SOD活力不一。根据酶的百

34、分抑制率与酶的活力呈抛物线关系(附录：SOD标准曲线)，各种测定样品取样量不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量。最佳取样量的摸索：如果您第一次使用本试剂盒测试某一种新的样品时最好先做三只不同取样量的测试管。例如想测1%脑组织匀浆，取样量分别为10l、30l、50l，然后计算（对照管吸光度-测定管吸光度）对照管吸光度的结果应该在0.150.55之间,即百分抑制率在1555%之间（此段曲线基本呈直线关系）,然后取百分抑制率在48%50%左右的一管作为最佳取样量,若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需将样品浓度稀释或减少取样量后再测试.若百分抑制率小于20%时,则需将样品量

35、加大后测试.这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60或小于10，各个测定组的结果在t检验中常常无显著性差异。注3：最佳取样量参考值：人红细胞抽提液为8.010l；大鼠红细胞抽提液为5l左右；人血浆（血清）30l；小鼠血浆（血清）5l左右；1%组织匀浆3050l；胞浆2050l；心肌灌流液或肾透析液100200l；白细胞悬液100200l；细胞培养液100200l。所有的样本用生理盐水稀释1倍后则取样量可加大1倍。四、计算：（一）、血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD与CuZn-SOD活力计算：定义：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个

36、SOD活力单位（U）。2、血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液SOD计算公式：3、计算举例：例：取未经处理的血清30l测定总SOD的活力：测得对照管吸光度为0.526，总SOD测定管吸管度为0.255；血清经附加试剂处理后，取30l测铜锌SOD，测得对照管吸光度为0.526，CuZn-SOD测定管的吸光度为0.341：（二）、组织匀浆中SOD活力计算：1、定义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。计算公式：3、计算举例：例：取未经处理的1%肝组织匀浆10l测总SOD：测得对照管吸光度为0.510，总SOD测定管吸光度为0.24

37、2；1%肝组织匀浆经附加试剂处理后，取10l测CuZn-SOD：测得对照管吸光度为0.510，CuZn-SOD测定管吸光度为0.289，测得组织蛋白为1.075mg/ml。则计算结果为：*mgprot为毫克蛋白数总SOD与分型SOD的测定方法二SDS+KCl抑制法测CuZnSOD此法适用于血清、组织匀浆、细胞培养液等；但该方法前处理较繁琐，耗时较多一、试剂的组成与配制：（一）、100管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：10ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至100ml，4保存。2、试剂二：液体10ml1瓶，410保存。3、

38、试剂三：液体10ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l2支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml2瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080热双蒸水75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。7、另附加SDS及KCl各一支，用时各加

39、70-80热蒸馏水12ml，充分溶解，SDS溶液在天冷时或放冰箱会凝固，每次测试前必须在水浴中加热溶解为透明状方可使用。此二样试剂是在没有KCN的单位作CuZn-SOD测定时用。（二）、50管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至50ml，4保存。2、试剂二：液体5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可

40、保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水37.5ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至37.5ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水37.5ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。7、附加SDS及KCl各一支，用法同100T。（三）、25管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：2.5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至25ml，4保存。2、试剂二：

41、液体2.5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体2.5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体175l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液2.5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水18.75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至18.75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水18.75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显

42、色剂，4避光冷藏。7、附加SDS及KCl各一支，用法同100T。二、样本的前处理：取样本0.4ml加0.1ml的SDS水溶液，即样本SDS=41容积比SDS配制方法见试剂组成与配制，两者混匀后置37水浴30分钟或恒温箱放置30分钟，取出后冰箱冷却至4。再按照样本SDS混合液与KCL溶液以101的比例加入KCl溶液（上述样本与SDS混合液体积为0.5ml应加KCl溶液为0.05ml即50l）。充分混匀后再放入4的冰箱中30分钟，取出后以3000转/分，离心10分钟（台式离心机），取上清液测试。此上清液即经过SDS及KCl处理后的样本，Mn-SOD活力丧失而CuZn-SOD活力不受影响。三、操作方

43、法试剂总SOD测定管CuZn-SOD测定管对照管试剂一(ml)1.01.01.0样品(ml)a*处理过的样品a*蒸馏水(ml)a*试剂二(ml)0.10.10.1试剂三(ml)0.10.10.1试剂四(ml)0.10.10.1用旋涡混匀器充分混匀，置37恒温水浴40分钟。显色剂(ml)222混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色注意注1：a*代表样本取样量、经SDS和KCl处理的样本取样量以及蒸馏水取样量注2：最佳取样量因样品种类不同，其SOD活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系(附录：SOD标准曲线)，各种测定样品取样量不一样，在每测定一

44、种新的样品前最好选择一个最佳取样量。最佳取样量的摸索：如果您第一次使用本试剂盒测试某一种新的样品时最好先做三只不同取样量的测试管。例如想测1%脑组织匀浆，取样量分别为10l、30l、50l，然后计算（对照管吸光度-测定管吸光度）对照管吸光度的结果应该在0.150.55之间,即百分抑制率在1555%之间（此段曲线基本呈直线关系）,然后取百分抑制率在48%50%左右的一管作为最佳取样量,若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需将样品浓度稀释或减少取样量后再测试.若百分抑制率小于20%时,则需将样品量加大后测试.这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60或小于10，各个测定

45、组的结果在t检验中常常无显著性差异。注3：最佳取样量参考值：人红细胞抽提液为8.010l；大鼠红细胞抽提液为5l左右；人血浆（血清）30l；小鼠血浆（血清）5l左右；1%组织匀浆3050l；胞浆2050l；心肌灌流液或肾透析液100200l；白细胞悬液100200l；细胞培养液100200l。所有的样本用生理盐水稀释1倍后则取样量可加大1倍。四、计算：（一）、血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD与CuZnSOD活力计算：定义：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。2、血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液SOD计算公式：3、计算

46、举例：例：取未经SDS和KCl处理的血清30l测定总SOD的活力：测得对照管吸光度为0.526，总SOD测定管吸光度为0.255；血清经SDS及KCl处理后，取30l测CuZn-SOD，测得对照管吸光度为0.526，CuZn-SOD测定管的吸光度为0.383：（二）、组织匀浆中总SOD与CuZnSOD活力计算：定义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。2、计算公式：3、计算举例：例：取未经处理的1%肝组织匀浆10l测总SOD：测得对照管吸光度为0.560，总SOD测定管吸光度为0.269；1%肝组织匀浆经SDS和KCl处理后，取10l

47、测CuZn-SOD。对照管吸光度为0.560，CuZn-SOD测定管吸光度为0.324，测得组织蛋白为1.075mg/ml。则计算结果为：*mgprot为毫克蛋白数。总SOD与分型SOD的测定方法三用KCN抑制CuZnSOD测定MnSOD该方法适用于血清、组织匀浆、细胞培养液等，但KCN要自备一、试剂的组成与配制：（一）、100管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：10ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至100ml，4保存。2、试剂二：液体10ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体10ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体3

48、50l2支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml2瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080热双蒸水75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。7、KCN自备（二）、50管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部

49、分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至50ml，4保存。2、试剂二：液体5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体350l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水37.5ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至37.5ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水37.5ml溶解后备用，

50、配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。7、KCN自备（三）、25管试剂盒的组成与配制：试剂一：贮备液：2.5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）：试剂一应用液的配制：用时加热蒸馏水稀释至25ml，4保存。2、试剂二：液体2.5ml1瓶，410保存。3、试剂三：液体2.5ml1瓶，410保存。4、试剂四：液体175l1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液2.5ml1瓶，4保存。用时二者按114稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4保存，不可冷冻。配好后可保存23个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处

51、理过。5、试剂五：粉剂1支，用时加7080蒸馏水18.75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至18.75ml，配好后的试剂避光4冷藏。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水18.75ml溶解后备用，配好后的试剂避光4冷藏保存。显色剂的配制：按照试剂五试剂六冰乙酸=332的体积比配成显色剂，4避光冷藏。7、KCN自备（四）KCN的配制：（自备）浓度为60mmol/L的KCN贮备液的配制：若配20mlKCN的贮备液（KCN的分子量为65.12）65.1260EQEQF(20,1000)=78mg将78mgKCN加蒸馏水至20ml溶解即成贮备液。浓度为10mmol/L的KCN

52、应用液的配制：取60mmol/L的KCN的贮备液加5倍蒸馏水稀释即可。KCN配制好后要避光冷藏，贮备液可存放40-50天，应用液只能存放7-10天。二、Mn-SOD活力的测定：试剂总SOD测定管总SOD对照管MnSOD测定管MnSOD对照管试剂一(ml)1.01.01.01.0样品(ml)a*a*蒸馏水(ml)0.50.5+a*a*10mmol/LKCN(ml)0.50.5试剂二(ml)0.10.10.10.1试剂三(ml)0.10.10.10.1试剂四(ml)0.10.10.10.1用旋涡混匀器充分混匀，置37恒温水浴40分钟。显色剂(ml)2222混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处

53、，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。注意注1：a*代表样本取样量和蒸馏水取样量。注2：当KCN质量好时，总SOD与锰SOD二者对照管的吸光度应该差不多，若KCN质量不好或放置时间过长或潮解，则总SOD与锰SOD二者的对照管的吸光度相差很大。锰SOD对照管要明显高于总SOD对照管的吸光度。在计算时要采用纠正公式：将所测得的Mn-SOD活力除以吸光度的上升比率*（锰SOD对照管吸光度总SOD对照管吸光度，即为吸光度上升比率）。具体计算见计算举例。注3：因KCN为剧毒品，不可邮寄，没有KCN的实验室可用NaCN代替测Mn-SOD或者通过测T-SOD活力与CuZn-SOD活力，将T-SOD活力减去C

54、uZn-SOD活力从而计算出Mn-SOD活力。我们推荐使用抽提法测定CuZnSOD，方便、准确。注4：KCN为剧毒药，应注意废液的处理，可用除毒液除毒。除毒液的配制有二种方法：方法一：取硫酸亚铁（FeSO47H2O）二份加氢氧化钠（NaOH）一份，在研钵中研细，配成100g/L的悬液。每1000ml废液中加上述除毒液5ml放置3小时，不断搅拌，使剧毒的氰化钾成无毒的亚铁氰化钾。方法二：废液加入等量的水，每升加次氯酸钠（安替福民）35ml，充分振摇，混匀后敞开容器，置室温15小时后，排入下水道。三、计算：（一）、血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液中总SOD与MnSOD活力计算：定义：每

55、毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。2、血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液SOD计算公式：3、计算举例：例：取未经处理的人血清30l测总SOD的活力：测得总SOD对照管吸光度为0.465，总SOD测定管吸光度为0.298；取经过KCN处理的人血清30l测MnSOD的活力：测得MnSOD对照管吸光度0.485，MnSOD测定管吸光度为0.425：注意：因测Mn-SOD时加KCN，所以对照管与测定管的吸光度均较测TSOD的对照管及测定管的吸光度为高，因而要采取纠正公式：将所测得的Mn-SOD活力除以吸光度的上升比率（锰SOD的对照管吸光度总SOD

56、对照管吸光度，即为吸光度上升比率）本例Mn-SOD活力为32U/ml，Mn-SOD对照管吸光度为0.485，T-SOD对照管吸光度0.465。Mn-SOD活力U/ml血清=32（0.4850.465）=321.043=31U/ml血清CuZn-SOD活力U/ml血清=T-SOD活力Mn-SOD活力=92-31=61U/ml血清（二）、组织匀浆中总SOD与MnSOD活力计算：1、定义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。2、计算公式：3、计算举例：例：取经过KCN处理的1%肝组织匀浆30l测Mn-SOD：MnSOD对照管吸光度为0.48

57、5，MnSOD测定管吸光度为0.375，测得组织蛋白为0.67mg/ml，则计算结果为：mgprot为毫克蛋白数。测组织匀浆中T-SOD的对照管吸光度为0.465，则纠正后Mn-SOD活力为：86.4U/mgprot（0.4850.465）=82.8U/mgprot。参考值人血清T-SOD活力：104.2+18.8U/ml（n=100人，人血清取样量为30l）；Mn-SOD活力：41.21+3.2U/ml（n=100人，人血清取样量为30l）；人红细胞中SOD活力：19246+132U/gHb（n=40人，红细胞抽提液取样量为10l）；小鼠1皮肤组织T-SOD活力：69.01+19.95U/m

58、gprot（n=26，取样量为50l）；家兔血清T-SOD活力：429.04+31.60U/ml（n=12，血清取样为10l）。以上均为+SD。注意点试管要洗干净，在测微量样品时，例如心肌培养细胞、肿瘤培养细胞、白细胞、血小板、线粒体、微粒体或离体心肌灌流液等尤为重要。所有试剂的配制均应在测试前一天进行，目的使其充分溶解。配好后的试剂,4可以保存36个月，测试前从冷藏箱中拿出的试剂及样品要在室温中放30分钟后再用。为避免测试误差，第一次吸的试剂要丢弃，用作冲洗管道，吸嘴外周若挂有液体要用滤纸轻轻擦干，样品和试剂要垂直加入试管，不要加在管壁上（因试剂及样品量小）。水浴前要用旋涡混匀器充分混匀。每

59、次水浴时间为40分钟，（当室温低于20时水浴时间适当延长至45分钟）水浴温度37要固定。对照管要做2支，并且放在所有测试管的中间做，取其平均值。或每9支测定管做一支对照管。同一份标本测T-SOD与Mn-SOD或者是测T-SOD与CuZn-SOD时，只需测其中一对即可以。因为T-SOD减去Mn-SOD等于CuZn-SOD；T-SOD减去CuZn-SOD等于Mn-SOD。（人体中只有二种SOD即铜锌CuZn-SOD与锰Mn-SOD，二者相加等于总T-SOD）。测试前先预试以确定最佳取样量：当您第一次使用本试剂盒测试某一种新的组织样品时最好先做三只不同取样量的测试管。例如想测1%脑组织匀浆，取样量分别为10l、30l、50l，然后计算：结果应该在0.150.55之间，即百分抑制率在1555%之间，然后取百分抑制率在45%或48%左右的一管作为最佳取样量，因为酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，若百分抑制率大于60%时，则需将样品浓度稀释或减少取样量后再测试。若百分抑制率小于20%时，则需将样品量加大后测试。本法优点快速：整个操作过程约50分钟，在这期间可测100例以上样本。这种短时大批量的测试方法是很受操作人员的欢迎。取样量极微：本法取手指或耳垂