HBV-LP会议宣传用ppt课件

1、一种新的乙肝诊断血清免疫学目的乙肝病毒大蛋白 美国ab大学乙型肝炎流行现状乙型肝炎是一个严重的公共卫生问题。全球60亿人口中，约1/2人口生活在HBV高流行区，约20亿人证明有HBV感染，34亿人为HBV慢性感染，其中25%40% 最终将死于肝硬化和肝癌。全球前10位疾病死因中乙肝占第7位，每年因乙肝死亡约75万例 中国乙型肝炎流行现状(一) HBeAg阴性活动期肝炎增多 (二) HBV变异株添加HBV的突变率较高， HBeAg阴性活动期肝炎临床特点：(1) 转为肝硬化和肝癌比例较大；(2) 与年龄相关：患者年龄较大；(3) 疾病自发或继续减轻极少发生；(4) 何时停药难以确定；(5) 治疗后

2、复发率高。HBeAg阴性活动期肝炎HBeAg阴性乙肝与HBeAg阳性乙肝不同点：(1)慢性肝炎病情不减轻；(2)生化学和病毒学标志反复升高；(3) 可3040年无病症；(4) 约45岁左右发生肝硬化；(5) 10年后约25%发生并发症。 HBeAg阴性活动期肝炎HBeAg 阴性的慢性乙肝流行率升高缘由：(1) 继续免疫压力导致突变株选择；(2)长期治疗导致病毒变异；(3) 前C和C启动子变异；(4) 检测方法的灵敏度提高。 HBeAg阴性活动期肝炎HBeAg 阴性活动期肝炎临床诊断现状：(1) 传统“两对半目的不能反映此类患者HBV复制程度；(2) 缺乏指点合理治疗的目的；(3) HBV DN

3、A检测不易于各级医疗机构广泛开展；(4) 临床上急需可以反映HBV复制程度及指点治疗的目的。 抗病毒治疗效果监测临床上用于抗病毒治疗的药物干扰素核苷类似物 抗病毒治疗效果监测临床上缺乏评价抗病毒治疗效果的目的。以HBV DNA阴转作为治疗的终点不恰当，此时停药病情易反复。 乙肝病毒实验室检测的缺陷 抗病毒治疗效果评价血清学目的缺乏 临床上评价抗乙肝病毒治疗效果时存在一个很大的问题，即其评价目的主要是肝功能的改善与否、血清乙肝病毒DNA程度的变化以及肝组织的病理学改动等。诚然，这些目的对临床医生判别患者病情而言非常重要和适用，也是临床医生选用抗乙肝病毒药物时的根据， 然而对于何时停用抗病毒药物、

4、停用抗病毒药物后乙肝病毒能否会重新复制活泼导致乙肝复发那么缺乏客观而有效的目的。 乙型肝炎血清学诊断技术新突破乙肝病毒大蛋白HBV-LP前S区 酶免定量试剂盒 -直接定量检测乙肝大蛋白 -不用分开检测前S1和前S2HBV-LP诊断试剂新颖之处采用病毒样颗粒制造针对构象构造的高活性抗体同时检测前S1和前S2进展定量检测，用于评价抗病毒治疗效果和预后诊断HBeAg阴性活动期肝炎的独一血清学目的评价治疗效果及断定治疗终点独一血清学目的大蛋白完全衰退意味患者预后良好乙肝病毒包膜蛋白研讨进展1995-2004年 发现大蛋白前S区有复杂构象构造1996年 发现大蛋白具有反式激活病毒复制的作用2002年 发

5、现导致肝细胞病变及凋亡的主要缘由是大蛋白2004年 实验室胜利构建针对构象型抗原的单克隆抗体2005年 国内公司胜利研制乙肝外表抗原大蛋白酶联免疫定量试剂盒Hepatitis B乙型肝炎HBV模型HBV包膜蛋白HBV的外表抗原的组成HBV病毒构呵斥分 HBV-LP与病毒复制亲密相关HBV Dane 管形 球型 血流中的分布 L-HBs 大蛋白存在 存在 不含仅病毒复制期存在M-HBs中蛋白存在 存在 1%含量 非复制期少量存在S-HBs小蛋白存在 存在 存在 存在根据检测血液中大蛋白的有无，判别病毒携带者体内的HBV病毒能否在进展复制。乙肝病毒包膜蛋白 preS特性: 暴露在病毒颗粒外表高免疫

6、原性 参与了病毒与细胞受体的相互作用 诱导抗感染的维护性抗体的产生 Neurath AR, Kent SB, Strick N, Parker K. Delineation of contiguous determinants essential for biological functions of the pre-S sequence of the hepatitis B virus envelope protein: its antigenicity, immunogenicity and cell-receptor recognition. Ann Inst Pasteur Virol

7、. 1988 Jan-Mar;(1):13-38. 乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研讨Prange R, Streeck RE. Novel transmembrane topology of the hepatitis B virus envelope proteins. EMBO J 1995; 14: 247- 256Lambert C.et al. Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral lare envelope proteins J.General Virology 2004 85

8、,1221-1225.乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研讨HBV病毒颗粒外表的PreS曾经被证明具有独立的构造域和天然构象很多研讨努力于表达并观测PreS的构造，但是极少胜利。其缘由是单独表达的PreS很容易被蛋白酶所降解。(A)内质网ER膜上乙肝大蛋白的拓扑构造模型 。 (B)病毒体包膜上的乙肝大蛋白的拓扑构造模型。Volker Bruss, Xuanyong Lu1, Reiner Thomssen and Wolfram H.Gerlich.Post-translational alterations in transmembrane topology of the hepatitis B

9、 virus large envelope protein. The EMBO Journal vol.13 no.10 pp.2273-2279, 1994乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研讨HBV L包膜蛋白大蛋白的构造域和穿膜拓扑构造 A. 大蛋白的构成组分，含preS1、preS2及S构造 B. 大蛋白在内质网ER膜上的拓扑构造Carsten Lambert, Sylvia Mann and Reinhild Prange. Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral large envel

10、ope proteins. Journal of General Virology (2004), 85, 12211225乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研讨 AA99169构成一个环状构造，这一序列横跨前S1和前S2，是其主要免疫表位。乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研讨Volker Bruss Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid Virus Research 106 (2004) 199209 29 September 2004AA99169L蛋白i-pre-S方式的功能方式图。黑点表示L蛋白pre-S构造 略去S和M蛋白分泌的

11、病毒体外表的e-pre-S构造很能够具有结合病毒受体的功能。目前的数据显示L蛋白的i-pre-S构造是一种蛋白矩阵，在病毒体的构成过程中担任与核壳体相接触，包装外膜。VOLKER BRUSS* AND KERSTIN VIELUF. Functions of the Internal Pre-S Domain of the Large Surface Protein in Hepatitis B Virus Particle Morphogenesis. JOURNAL OF VIROLOGY, Nov. 1995, p. 66526657 Vol. 69, No. 11肝炎病毒物种特异性的感

12、染取决于病毒进入的程度，并由病毒L蛋白上的pre-S构造决议。 Arg 103和Ser 124之间的序列在不同的HBV之间是高度保守的。Arg 103和Ser 124之间的 pre-S序列对于HBV的构成具有重要功能。横跨前和前之间乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研讨VOLKER BRUSS. A Short Linear Sequence in the Pre-S Domain of the Large Hepatitis B Virus Envelope Protein Required for Virion Formation. JOURNAL OF VIROLOGY, Dec. 1997

13、, p. 93509357 Vol. 71, No. 12TAKASHI ISHIKAWA AND DON GANEM. The pre-S domain of the large viral envelope protein determines host range in avian hepatitis B viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 92, pp. 6259-6263, July 1995 Determination of the Minimal Distance between the Matrix and Transmembra

14、ne Domains of the Large Hepatitis B Virus Envelope Protein Journal of Virology, June 2005, p. 7918-7921, Vol. 79, No.120022-538X构成特殊的矩阵构造跨膜区，维持它们正常构造的最短间隔是个乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研讨 Pre-S的反式激活作用乙肝病毒大分子外表抗原大蛋白是一种转录活化因子The hepatitis B virus large surface protein (LHBs) is a transcriptional activator. Virology

15、. 1996 Nov 1;225(1):235-9. Bruns M,Miska S,Chassot S,Will H. Enhancement of hepatitis B Virus infection by noninfections subviral particles.J Virol ,1998;76 ;1462-8. 乙肝鸭模型证明由大蛋白组装成的亚病毒颗粒可以反式激活病毒继续复制这个研讨具有临床意义,对于大蛋白阳性而DNA阴性患者容易停药反跳具有参考意义.亚病毒颗粒上pre-S的反式激活作用原 文： Ultrastructural Analysis of Hepatitis B

16、Virus in HepG2-TransfectedCells With Special Emphasis on Subviral Filament Morphogenesis作 者： PHILIPPE ROINGEARD AND CAMILLE SUREAU作者单位： Laboratoire de Biologie Cellulaire, EP CNRS 117, Faculte de Medecine de Tours, 2 bis Boulevard Tonnelle,F-37032 Tours Cedex France. 发表刊物： HEPATOLOGY Vol. 28, No. 4,

17、 1998 在乙肝病毒感染的HepG2细胞中对亚病毒纤维体的形状发生进展的超微构造分析大蛋白与肝细胞病变研讨大蛋白的过量表达,管状颗粒在细胞内堆积,导致体外培育的细胞5天内死亡Chisari等和Fernandes等曾经证明，在转基因小鼠中过量表达大的外表蛋白会使肝细胞凋亡并且产生慢性肝炎。然而，在他们模型中的这种损伤相对比较温暖，没有小鼠死于肝功能衰竭 .转基因小鼠的肝细胞带有这种蛋白L的积累滞留，那么会开展为细胞的损伤作用，它会诱导肝的再生，在这个模型中最终导致肝癌 大蛋白导致肝细胞病变研讨大蛋白是导致FCH中肝细胞损伤,纤维化的主要缘由FCH与肝细胞内大蛋白过量表达蛋白L的滞留也被发现和一

18、种独特的综合症，即纤维淤胆性肝炎FCH相联络，它的特征为肝细胞的空气球化和有着显著的胆汁阻塞，但是它普通只需很少的炎症发生，它发生于免疫抑制的乙肝携带者。来自于发生了FCH的病人的肝脏样品，经过电镜察看发如今细胞内膜系统中有着同样的乙肝亚病毒包膜纤维体的积累。2002年国际肝病杂志实验证明，表达的乙肝大外表蛋白致使培育的肝细胞在一些天内死亡。乙肝大的外表蛋白会致使体外培育的细胞的液泡化和细胞凋亡。这些结果和FCH下的肝脏病理情况相当地类似， 国内pre-S研讨部分文献一： Establishment and preliminery use of hepatitis B Virus Pre S1

19、/2 antigen assay World Journery of Gastroenterology 99年军事医学科学院所文献二 xpression and purification of the complete preS region of hepatitis B Virus World Journal of Gastroenterology 2005年中科院上海生化和细胞所抗原表位目前生物科学领域，对天然表位的研讨借助现代科学技术的提高，对表位曾经有比较深化的认识。表位的构成方式至少有两种：由某些氨基酸残基按一定顺序延续陈列组成的线状序列，称为顺序sequential表位或线性(li

20、near)表位。顺序表位是蛋白分子的一级构造，比较稳定，不受蛋白质加热变性和空间构形改动的影响。由分子内不延续的23个氨基酸残基折叠陈列所构成的三维构造构成，称为构象(conformational)表位；有时候，呈螺旋式陈列的延续肽链序列也可起到构象表位的作用。多肽无法模拟构象表位商品化的前S1 定性检测试剂上市，其单抗是用AA21-47化学合成的多肽而制造的。而运用该多肽免疫制造的抗体在科研中就曾经发现，只能检测到微弱的抗-pre-S1抗体的产生多肽无法模拟构象表位Schodel等人曾以100ug的pre-S1(21-47)合成多肽免疫Balb/c小鼠，诱导生成的抗pre-s1抗体的滴度只需

21、160，上海生化所改良运用pre-S1-BSA偶联复合物免疫Balb/c小鼠，也只能检测到微弱的抗Pre-S1的活力， 目前临床运用乙肝前S1以及前S2试剂大部分研讨主要集中在前S1区、前S2区。研讨阐明前S1区、前S2区蛋白及其抗体都与HBV-DNA、HBeAg、肝脏损害、乙肝的转归等都有极其亲密的关系。临床运用：前S1试剂、前S2试剂诊断的结果与HBV-DNA、HBeAg 三者之间有一定的关系，但符合率却只需0%，甚至更低。杨海林等 完好病毒颗粒Dane颗粒标志物PreS1蛋白药盒的研制 上海医学检验杂志1995 vol.10:204-206杨海林等 抗乙肝炎病毒外表抗原PreS12047

22、多肽的制备、性质和运用。生物化学与生物物理学报 1994 vol 26 145-151运用针对化学合成多肽的单克隆抗体，无法定量监测，无法用于疗效察看临床运用年，灵敏度不理想，目前临床运用乙肝前S1以及前S2试剂乙肝大蛋白定量诊断试剂运用构造生物学、蛋白晶体学的研讨，研发出针对乙肝病毒前S区的构象型单抗，大大提高了乙肝病毒感染者中前S区抗原即LP大蛋白的检出率，临床运用阐明大蛋白的检出率与血液中病毒DNA的符合率高度符合90%。比原来的前S1试剂效果大大提高，可作为病毒复制的一个目的。乙肝大蛋白re-S抗原蛋白晶体构造HBV-lp晶体构造空间模型针对大蛋白构象表位单抗研制简要过程本方法是我们曾

23、经恳求的专利的一部分获得体外重组的PRE-S抗原获得多抗，亲和层析从强阳性标本中获得病毒样颗粒病毒样颗粒制造抗体大蛋白试剂临床研讨1、HBV DNA阳性标本中HBVLP的阳性符合率考 核 单 位HBV DNA（）HBVLP（）例（次）数例（次）数比例（）北京地坛医院126825494.78北京地坛医院2（治疗系列）115214998.03解放军传染病研究所17013579.41辽宁沈阳传染病医院14313493.71浙江省湖州中心医院（治疗系列）213312896.24合 计84878392.33注：1 阿德福韦抗病毒治疗患者43例，共检出HBV DNA阳性152次； 2 拉米夫定抗病毒治疗患

24、者51例，共检出HBV DNA阳性133次。2、不同HBV DNA拷贝数中HBVLP阳性率以及OD值比较大蛋白试剂临床研讨组别HBV DNA大蛋白试剂结果HBVDNA拷贝数例数阳性例数阳性率（）大蛋白 OD1104(阴性)842321.380.2660.0442104432967.440.4160.0813105634673.020.5040.2054106242187.500.8980.1805107171694.121.2750.31961082323100.001.4280.238注：解放军传染病研讨所，HBV DNA拷贝数对数值与HBVLP OD值的相关系数r=0.945大蛋白试剂临床

25、研讨组别HBV DNA大蛋白试剂结果HBVDNA拷贝数例(次)数阳性例(次)数阳性率（）阳性含量均值（ng）1103544888.8917.602104383797.3724.693105585696.5530.444106656396.9255.465106808010086.61合计/29528195.25/注：北京地坛医院与沈阳传染病医院汇总，其中北京地坛医院为阿德福韦抗病毒治疗患者标本。HBV DNA拷贝数对数值与HBVLP含量ng的相关系数3、不同HBV DNA拷贝数中HBVLP阳性率以及含量比较r=0.935大蛋白试剂临床研讨4、HBVLP试剂与乙肝前S1试剂比较大蛋白试剂临床研讨

26、考 核 单 位HBVDNA（）HBVLP（）乙肝前S1（）例数例数比例（）例数比例（）北京地坛医院26825494.7817665.67解放军传染病研究所17013579.419757.06合 计43838988.8127362.33大蛋白试剂临床研讨考 核 单 位HBVDNA（）HBVLP（）HBeAg（）北京地坛医院沈阳传染病医院例数例数比例（）例数比例（）39136894.1217745.275、HBV DNA、HBeAg与HBVLP三者在乙肝患者中的比较5、HBV DNA、HBeAg与HBVLP三者在乙肝患者中的比较大蛋白试剂临床研讨HBV DNA（）HBeAg()HBeAg()合计1

27、77 #214 *391HBVLP（）172（97.18%）196（91.59%）368（94.12%）注： # 其中北京地坛医院109份；沈阳传染病医院68份 * 其中北京地坛医院159份；沈阳传染病医院55份6、不同HBV方式的患者中HBVLP与HBV DNA的比较大蛋白试剂临床研讨HBV M 模 式 例数 HBV DNA（） 例数 阳性率(%)HBVLP（）例数 阳性率(%)HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)21820292.6720694.50HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)20716780.6815876.33HBsAg(+)HBeAg(+)231982

28、.611878.26HBsAg(+)HBcAb(+)371335.141643.24合计48540182.6839882.06大蛋白试剂临床研讨7、HBVLP试剂盒抗干扰才干的考评考核单位干扰血清HBVLP结果所患疾病例数阳性例数阳性率（）北京地坛医院甲肝800丙肝800戊肝800两种肝炎混合感染 * 600沈阳传染病医院丙肝2000合计/5000注：* 含甲肝乙肝混合感染、丙肝乙肝混合感染以及戊肝乙肝混合感染各2份8、HBVLP试剂盒的特异性考评大蛋白试剂临床研讨考核单位考评标本HBVLP结果标本来源例数阳性例数阴性例数特异性（）河北省血液中心正常献血员21183211599.86解放军传染病研究所体检健康者1000100100北京地坛医院体检健康者57057100合 计/22753227299.87大蛋白试剂临床研讨9、HBVLP用于抗病毒治疗的监测北京地坛医院进展了阿德福韦治疗患者的过程监测浙江湖州中心医院进展了拉米夫定治疗患者的过程监测北京大学生物系进展了干扰素治疗患者的过程监测北京地坛医院阿德福韦治疗