药学专业大学生创新训练计划申请书文献

1、2013年度国家大学生创新创 业训练计划申报书基于菜豆假单胞菌毒素的生物源除草剂开发 及抗性基因资源挖掘指导教师:团队成员:2013年3月- - / 15武汉大学2013年度大学生创新创业训练计划申报书填表时间：2013年03月10日项目名称基于菜豆假单胞菌毒素的生物源除率剂开发及抗性基因资源挖掘项目创新特色概述?开发环境友好型的生物除率剂，打破跨国公司草甘麟和草俊 瞬的垄断地位?改造产生菌株的抗性基因，开发具有自主知识产权的除率剂 抗性基因，为开发转基因抗除率剂作物储备基因资源?综合利用基因工程、细胞工程等分子生物学技术进行开发研 究项目所属一级学科理学、农学（跨学科）申请经费10000元起

2、止时间2013年3月至2015年5月姓名学号院（系）、专业联系电话()卜 i 1*青 B 人1一Aia-hArg trixpliideAJbhrgH- Ort 。-HN h MMP INotoxin由合成路线可知，参与药效基团合成的基因有 ，因此可将与药效基团合成无关的基因敲除或将合成药效基团的基因组装起来，构建一个只合成药效基团的合成途径，这样就可以减少合成步骤，降低物质和能量消耗，以期提高毒素的产量。实验材料：宿主菌铜绿假单胞菌实验过程：限制性内切酶技术与扩增技术结合克隆与药效基团合成相关的基因，按照基因簇中基因排列顺序，用连接酶组装成药效基团基因簇；选择合适的载体和药效基团基因簇，进行启

3、动子改造和密码子优化，将重构基因簇导入异源宿主菌(铜绿假单胞菌 )；发酵培养，检测药效基团的活性和合成单位，并与原始菌株相同环境下相同时间内的相关数据比较，优化异源表达系统。项目II.改良抗性基因，开发转基因植物本方案拟采用基因工程和蛋白质工程的方法，对抗性基因进行优化改良，以提高其抗性。然后筛选合适的位点拆分，建立和转化模式植物的方法，为开发转基因作物打下基础。.实验材料：野生型烟草(L.),菜豆丁香假单胞菌 3121 ( .3121 ),大肠杆菌21 ( 21), 28a质粒等。.实验步骤：抗性基因的优化改良易错扩增设计引物，采用易错扩增并诱导目的基因发生随机性突变，得到具有不同位点的突变

4、基因构建质粒重组将突变基因装载到大肠杆菌超量表达载体28a,得到重组质粒。原核表达，筛选优良突变基因将重组质粒转到大肠杆菌 21中，挑取单菌落接种于含有高浓度的培养基中，经抗性梯度培养后寻找存活下来的大肠杆菌，筛选抗性增强的抗性基因。真核表达，检验活性对优良抗性基因进行修饰及加工，使其能在真核细胞中表达。将加工后的抗性基因导入目标植株一野生型烟草中，检验其活性。拆分改良型基因并导入目标植株一野生型烟草（ L.）花粉易携带抗性基因漂移产生超级杂草。目前解决思路是：由于花粉中只含有染色体，而叶绿体不能随植物花粉转移，因此可将改良型基因拆分成两个没有活性的基因片断，一断整合在染色体 上，另一断插入叶

5、绿体 中。这样花粉中只携带没有活性的部分基因片断，而避免了抗性基因的漂移产生超级杂草的安全性问题。抗性基因拆分位点的确定1根据的碱基序列，利用蛋白质三维结构预测分析网站对其抗性蛋白进行结构预测，找到结构域的交接位点。继续利用 接点扫描系统（7 ）精确寻找改良型基因能够进行拆分的位点。利用7转座在靶的随机位点上插入15（即编码5个氨基酸短肽）的外源片段，通过鉴定目的蛋白能否忍受少量外源氨基酸多肽 的插入来寻找可能的拆分位点。抗性基因的拆分与介导载体的构建采用方法，从上述的可拆分位点处将改良型基因拆分成N端与C端两个片段，称为和然后分别arglGNlntein-C与 内含肽片段对应基因的 N端和C

6、端融合。 见下图详解：核酸 argK-J| Intein-N)C 二argK N基因表达、蛋白融合 lntein r r/IargK-N蛋白质工（argK-C7内含肽自鹑切 Intein*目标蛋白.CargKN农杆菌介导融合基因转入烟草愈伤组织2在野生型烟草（L.）中，利用农杆菌介导将融合基因N端插入核基因组，融合基因 C端插入叶绿体基因组。在细胞核内和叶绿体内表达的前体蛋白中的内含肽可以互相识别进行蛋白剪接，形成了一个完整的有功能的目的蛋白产物 ，即抗除草剂蛋白，转基因植株对除草剂表现出抗性。通过用含有的 培养液培养烟草愈伤组织，筛选产有抗性蛋白而存活下来的植株，进而大规模种植。反式剪接防止

7、基因漂流。编码抗除草剂的基因改良型基因被拆分，转入核中和叶绿体中。核基因片段融合了编码反式剪接蛋白内含肽剪接区域的端（）和编码叶绿体定位的（），整合进叶绿体中的基因片段则融合了编码反式剪接蛋白内含肽剪接区域的端（）。转录和翻译后，（）-（）导入叶绿体中，在那里通过反式剪接或介导的蛋白互补（）形成有活性的抗性蛋白。3参考文献M C , F J , A E , al . A 7 一.2000,28 : 1067 1077.2顿宝庆、陆伟、张维、平淑珍、王旭静、陈明、徐玉泉、金丹、王劲、赵仲麟、梁爱敏、侯松娜、.、林敏，荧光假单胞菌 G2.合酶的拆分和 介导的活性恢复.科学通报.2006, 51 （

8、12）: 1479-1481.3靳茜、王志兴、王旭静、贾士荣，限控基因飘流的生物学措施研究进展，中国农业科技导报2012,14 （5） :64-70.三、预期成果.对的合成机制有更深的理解，探索出一种可以高效生产的途径。2.筛选得到对抗性提高的基因,建立拆分表达构建转基因植物的系统。.争取整理发表1-2篇有关合成调节的科研论文，通过论文的发表，我们可以直接参与学习论文的 撰写、修改和的发表全部过程，增强我们的知识产权意识。.通过此次创新实践，提高队员的专业知识水平和创新意识，激发队员学习专业知识的兴趣；培养实事求是、艰苦奋斗、的科学研究精神；提高队员的综合素质，促进学生由知识型向能力型人才的转变。四、详细预算预算项目名称简要说明费用材料购置标品、分子生物学试剂等4000测试化验毒素活性、含